不同品種抹茶營養物質和抗氧化活性的測定及主成分分析

鄔剛,馬云龍,徐銘辰

(濰坊工程職業學院 基礎教學部,山東 濰坊,262500)

茶是最受歡迎的飲品之一,起源于我國的云貴高原,迄今已有幾千年的種植歷史,因其獨特的口感、風味和保健功效在世界范圍內被廣泛消費[1-2]。抹茶是一種粉末茶,以茶樹嫩葉為原料,經過遮陰栽培、蒸青、冷卻、脫水、干燥、組合粉碎等多道工序制作而成[3-4]。抹茶能較好地保存茶葉中的營養物質和活性成分,使其具有較高的營養與保健價值[5-6]。此外,與傳統茶葉不同,抹茶中的水溶性和水不溶性成分都可以攝入,增強其健康功能潛力,如抗氧化和抗疲勞運動訓練恢復等[7]。這是由于抹茶茶粉表面積較大,更容易被人體吸收,且人體對抹茶營養的吸收率也能大大提高[1]。由于抹茶具有鮮甜的味道和良好的色澤,常被作為一種健康無害的天然食品添加劑,廣泛用于食品工業[8-9]。

抹茶中富含茶氨酸、茶多酚和生物堿等天然活性物質,具有多種益于人體健康的功效。茶氨酸是一種廣泛存在抹茶中比較特殊且含量最高的氨基酸,不易分解,極易溶于水,其水溶液呈弱酸性,具有焦糖的香味和類似味精的鮮爽味,可減輕咖啡因的苦味,是抹茶滋味鮮爽的主要來源[1,10]。茶多酚是抹茶中最重要的活性物質,約占抹茶質量的10%,包括花青素、黃酮類、酚酸類和兒茶素類等多酚類化合物[1]。茶多酚作為天然抗氧化劑,可有效延緩谷物貯藏期間的油脂氧化[11]。此外,兒茶素類化合物作為含量最高的多酚類化合物,是抹茶保健功效的主要成分,包括兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯等天然活性物質[1,12]?？诜翰杷仡惢衔锟赏ㄟ^改善小鼠腸道微生物群落進而產生抗氧化、抗炎反應緩解結腸炎[13-14]?？Х葔A是抹茶中含量較高的一種生物堿,具有抗氧化和調節中樞神經系統的作用[8]。因此,抹茶具有較大的經濟和健康價值。

近年來,抹茶產業發展迅速,呈上升趨勢,從事抹茶加工的茶企數量也逐年增多,市場需求不斷擴大[4,15]。但是,仍然缺乏對抹茶抗氧化活性的全面調查,以及對不同抹茶產品中生物活性成分的鑒定和定量。因此,本研究旨在系統評估不同品種抹茶在水分、水浸出物、可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸、茶多酚、兒茶素類化合物、咖啡堿含量和體外抗氧化活性的差異,并結合主成分分析的方法綜合分析差異,合理評價抹茶的營養價值和保健功效,以期為抹茶的研究與開發提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:鳩坑、龍井43、茂綠、迎霜和中茶302等抹茶樣品,采購于浙江茶葉集團有限公司,由我國茶樹品種制成,均以新鮮茶樹嫩葉為原料,采用蒸汽殺青、冷卻、脫水、復合干燥、組合粉碎等多種工藝制備而成;青嵐、若竹和五十鈴等抹茶樣品,采購于上海鉅云食品原料商行,為日本茶樹品種。所有抹茶樣品運送至實驗室后干燥密封待用。

試劑:乙醇、磷酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、葡萄糖、福林酚、碳酸鈉、氫氧化鈉(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(色譜純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除能力檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

DHG-9053A臺式鼓風電熱恒溫干燥箱,上海習仁科學儀器有限公司;HZK-FA110電子分析天平,上海諾萱科學儀器有限公司;HL2020-A激光粒度分析儀,北京海鑫瑞科技有限公司;HSY-26電熱恒溫水浴鍋,南京貝登醫療股份有限公司;UV1990A雙光束紫外可見分光光度計,上海赫爾普國際貿易有限公司;1260高效液相色譜儀,美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基礎理化指標測定

水分:參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定;水浸出物:參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》測定;粒度(D60):參照GB/T 34778—2017《抹茶》測定;灰分:參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》測定;可溶性糖:參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》測定;茶多酚:參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定;茶氨酸:參照GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測定 高效液相色譜法》測定。

采用考馬斯亮藍法測定樣品中可溶性蛋白含量,具體如下:取適量樣品溶于水中,吸取1 mL上清液與4 mL考馬斯亮藍G-250(0.6 g/L)反應10 min后置于595 nm測定吸光值[16]。

1.3.2 兒茶素類化合物和咖啡堿測定

兒茶素類化合物:參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定;咖啡堿:參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》測定。

1.3.3 抗氧化活性測定

根據DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除能力檢測試劑盒說明書分別檢測樣品的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率,具體如下:取適量抹茶樣品,按料液比1∶200(g∶mL)加水助溶,超聲10 min后抽濾,吸取100 μL上清液,加入100 μL DPPH甲醇溶液(0.2 mmol/L)、ABTS甲醇溶液(吸光值為0.7)或羥自由基溶液(8.8 mmol/L過氧化氫溶液、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和9 mmol/L水楊酸乙醇溶液等體積混合),混勻后置于黑暗條件下反應30 min,分別置于517、734 nm或510 nm處測定吸光值,分別以甲醇和過氧化氫作代替樣品作為陽性對照,以去離子水代替樣品作為空白對照[16-17]。以50 μg/mL的維生素C作為樣本陽性對照。DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1、A2和A3分別為樣品、對照和空白的吸光值。

參考WANG等[7]提供的方法綜合評價樣品的抗氧化活性如公式(2)所示:

(2)

抗氧化指數得分率為上述3種抗氧化活性檢測方法的抗氧化指數得分的平均值。

1.4 數據處理

實驗結果均以平均值±標準偏差(SD)的形式表示;采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差異顯著;使用GraphPad Prism 8.0進行繪圖;為避免各個指標間的單位量綱差異,對所有指標數據進行標準化處理,再使用SPSS 21.0軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種抹茶基礎理化指標的比較

8個不同品種抹茶的水分、水浸出物、粒度和灰分含量如表1所示,不同品種抹茶間的水分、水浸出物、粒度和灰分等指標存在一定差異(P<0.05)。8種抹茶的水分含量為3.44%～4.23%,符合GB/T 34778—2007《抹茶》中水分低于6%的要求。造成抹茶水分差異較大的原因可能是由于制作抹茶的茶樹品種不同,不同品種對水分的結合能力也不同。此外,不同品種抹茶的灰分含量為7.08～7.75 g/100 g,也符合GB/T 34778—2007《抹茶》中灰分低于8%的要求。8種抹茶的水浸出物和粒度(D60)分別為33.57%～43.38%和14.19～15.54 μm,與WANG等[7]研究結果相一致,所有抹茶的粒度(D60)符合GB/T 34778—2007《抹茶》中粒度(D60)低于18 μm的要求。通常,水浸出物含量的高低可反映抹茶中可溶性物質的多少,標志著抹茶滋味、厚薄的濃郁程度,可進一步反映抹茶品質的優劣[18]。我國不同品種抹茶的水浸出物含量為38.31%～43.38%,平均值為40.37%,其中“龍井43”品種的水浸出物含量最高;而國外不同品種抹茶的水浸出物含量僅為33.57%～36.44%,平均值為35.18%,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。這一結果說明我國抹茶品質優于國外,這是由于我國的茶葉品質更好,茶樹品種培育更優,尤其是以“龍井43”品種為原料制備的抹茶樣品具有最高的水浸出物和最低的灰分。

表1 不同品種抹茶基礎理化指標的比較Table 1 Comparison of basic physicochemical indicators in different varieties of matcha

2.2 不同品種抹茶營養物質的比較

8個不同品種抹茶的可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚含量如圖1所示。由圖1-A可知,不同品種抹茶中可溶性蛋白含量存在顯著差異(P<0.05),其含量為2.22～2.77 g/100 g,平均可溶性蛋白含量為2.47 g/100 g。我國不同品種抹茶的可溶性蛋白含量為2.45～2.77 g/100 g,平均值為2.55 g/100 g;而國外不同品種抹茶的可溶性蛋白含量僅為2.22～2.45 g/100 g,平均值為2.35 g/100 g,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。雖然抹茶中可溶性蛋白含量較低,但卻與抹茶品質有關,對提高抹茶的營養價值及滋味品質有一定的促進作用[19]。此外,抹茶的蛋白質含量在一定程度上可反映所用茶葉原料的老嫩,通常茶葉越嫩,蛋白質含量越高[20]?？扇苄蕴鞘菢嫵赡ú枳涛逗宛こ矶鹊闹饕镔|之一[3]。如圖1-B所示,8個不同品種抹茶中可溶性糖含量為6.31～7.16 g/100 g,平均可溶性糖含量為6.65 g/100 g,與WANG等[7]研究結果相一致。我國不同品種抹茶的可溶性糖含量為6.49～7.16 g/100 g,平均值為6.75 g/100 g;而國外不同品種抹茶的可溶性糖含量僅為6.31～6.6 g/100 g,平均值為6.48 g/100 g,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。茶氨酸是氮素循環的主要代謝產物之一,與抹茶品質有著直接而重要的關系[21]。根據圖1-C可知,不同品種抹茶中茶氨酸含量存在顯著差異(P<0.05),其含量為1.46～2.09 g/100 g,平均茶氨酸含量為1.74 g/100 g,其中“龍井43”品種的茶氨酸含量最高。我國不同品種抹茶的茶氨酸含量為1.58～2.09 g/100 g,平均值為1.82 g/100 g;而國外不同品種抹茶的茶氨酸含量僅為1.46～1.78 g/100 g,平均值為1.62 g/100 g,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。當抹茶中茶氨酸含量較高時,其口感會表現出醇爽、回甘的特點,此外,茶氨酸還具有鎮靜安神、提高記憶力和免疫力、抗氧化及保肝護胃等保健功效[22]。茶多酚是衡量抹茶品質的重要指標之一,其含量高低不僅與抹茶的色澤息息相關,也與抹茶的保健價值脈脈相通[22]。如圖1-D所示,不同品種抹茶中茶多酚含量差異顯著(P<0.05),其含量為10.96～12.67 g/100 g,平均茶多酚含量為11.74 g/100 g,其中“龍井43”品種的茶多酚含量最高。我國不同品種抹茶的茶多酚含量為11.33～12.67 g/100 g,平均值為11.96 g/100 g;而國外不同品種抹茶的茶多酚含量僅為10.96～11.77 g/100 g,平均值為11.38 g/100 g,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。這一結果與WANG等[7]研究結果相一致。綜上可知,我國抹茶產品的可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚含量均高于國外抹茶產品,尤其是以“龍井43”品種為原料制備的抹茶產品。因此,我國的抹茶產品應篩選出類似“龍井43”的抹茶制作所需的茶樹品種,有利于提高我國抹茶產業的品質。

A-可溶性蛋白;B-可溶性糖;C-茶氨酸;D-茶多酚圖1 不同品種抹茶可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸和茶多酚的比較Fig.1 Comparison of soluble protein, soluble sugar, theanine and tea polyphenols in different varieties of matcha注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.3 不同品種抹茶兒茶素類化合物和咖啡堿的比較

兒茶素類化合物是抹茶中含量最多的一類多酚類化合物,約占多酚類化合物總量的70%,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗焦慮和改善認知功能障礙等多種生物活性[23]。在化學結構上以C6-C3-C6為基本碳架,是由2-苯基苯并吡喃構成的一系列衍生物。不同品種抹茶兒茶素類化合物組成和咖啡堿含量測定結果見表2。由表2可知,在不同品種抹茶中共檢測出6種兒茶素類化合物,其中表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯是主要的兒茶素類化合物,這些物質之和約占整個兒茶素類化合物的95%。不同品種抹茶中各兒茶素類化合物含量差異顯著(P<0.05)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯是抹茶中含量最高的一種兒茶素類化合物,其含量為5.01～5.74 g/100 g,平均含量為5.39 g/100 g。而我國不同品種抹茶的沒食子兒茶素沒食子酸酯含量為5.31～5.74 g/100 g,平均值為5.54 g/100 g,顯著高于國外抹茶樣品(含量為5.01～5.26 g/100 g,平均值為5.13 g/100 g)(P<0.05)。有趣的是,“龍井43”抹茶樣品具有最高的沒食子兒茶素沒食子酸酯含量,與圖1-D的結果相一致。每日食用抹茶和富含沒食子兒茶素沒食子酸酯的食物可有效降低患結腸炎的風險,這與改善腸道微生物群落結構、維持腸道屏障、串擾宿主氧化和炎癥反應有關[24-25]。抹茶中表沒食子兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的含量分別為1.33～1.75 g/100 g和0.74～1.06 g/100 g,平均值分別為1.53 g/100 g和0.88 g/100 g。而我國不同品種抹茶的表沒食子兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯含量分別為1.47～1.75 g/100 g和0.74～1.06 g/100 g,平均值分別為1.43 g/100 g和0.92 g/100 g,顯著高于國外抹茶樣品(含量分別為1.33～1.52 g/100 g和0.75～0.84 g/100 g,平均值分別為1.43 g/100 g和0.8 g/100 g)(P<0.05)。表沒食子兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯能夠中和自由基并提高酶的解毒活性,包括谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶[1]。此外,不同品種抹茶中咖啡堿含量存在顯著差異(P<0.05),其含量為2.03～2.69 g/100 g,平均咖啡堿含量為2.41 g/100 g,其中“茂綠”品種的咖啡堿含量最高。我國不同品種抹茶的咖啡堿含量為2.03～2.69 g/100 g,平均值為2.42 g/100 g;而國外不同品種抹茶的咖啡堿含量僅為2.35～2.43 g/100 g,平均值為2.4 g/100 g,與我國抹茶樣品無顯著差異(P>0.05)。通常,兒茶素類化合物具有苦澀的特性,咖啡堿的加入有利于中和澀味,而抹茶滋味的好壞很大程度上取決于咖啡堿、茶氨酸和茶多酚的含量與比例關系[26]。

2.4 不同品種抹茶抗氧化活性的比較

抹茶中富含茶氨酸、茶多酚和咖啡堿等天然生物活性物質,具有較強的體外抗氧化活性[23,27]。本研究采用DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率等3種體外抗氧化活性測定方法來比較不同品種抹茶的抗氧化活性,結果見圖2。由圖2-A可知,不同品種抹茶的DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05),為25.28%～26.87%,平均DPPH自由基清除率為26.08%,其中“龍井43”品種抹茶的DPPH自由基清除率最高。我國不同品種抹茶的DPPH自由基清除率為25.94%～26.87%,平均值為26.39%;而國外不同品種抹茶的DPPH自由基清除率僅為25.28～25.85 g/100 g,平均值為25.56%,顯著低于我國抹茶樣品(P<0.05)。如圖2-B所示,“中茶302”和“龍井43”品種抹茶具有最高的ABTS陽離子自由基清除率,分別可達20.06%和19.98%,二者無顯著差異(P>0.05)。我國不同品種抹茶的ABTS陽離子自由基清除率為19.22%～20.06%,平均值為19.73%,顯著高于國外抹茶樣品(ABTS陽離子自由基清除率為18.23%～19.18%,平均值為18.72%)(P<0.05)。由圖2-C可知,“若竹”品種抹茶具有最低的羥自由基清除率,僅為35.18%,除“青嵐”品種抹茶樣品與其無顯著差異(P>0.05)外,與其他品種抹茶樣品均差異顯著(P<0.05),而“迎霜”品種抹茶具有最高的羥自由基清除率,高達36.35%。國外不同抹茶的羥自由清除率僅為35.18%～35.67%,平均值為35.39%,顯著低于我國抹茶樣品(羥自由基清除率為35.58%～36.35%,平均值為35.98%)(P<0.05)。所有抹茶樣品的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除率均顯著高于維生素C對照組(P<0.05)。此外,通過抗氧化指數得分率綜合評價各品種抹茶的體外抗氧化活性。如圖2-D所示,“龍井43”品種抹茶具有最高的抗氧化指數得分率,高達99.61%;其次分別為“中茶302”品種(99%)和“茂綠”品種(98.48%)?！叭糁瘛逼贩N抹茶的抗氧化指數得分率最低,僅為94.07%。原因可能是不同品種抹茶的茶氨酸、茶多酚、兒茶素類化合物和咖啡堿等天然生物活性物質的含量差異導致體外抗氧化活性差異較大[28-29]。

A-DPPH自由基清除率;B-ABTS陽離子自由基清除率;C-羥自由基清除率;D-抗氧化指數得分率圖2 不同品種抹茶抗氧化活性的比較Fig.2 Comparison of antioxidant activity in different varieties of matcha

2.5 不同品種抹茶的主成分分析

主成分分析是通過降維的方法將多個變量轉為少數幾個綜合變量的多元統計分析方法,可將眾多信息中相互重疊的信息去除[30]。而基于營養物和抗氧化活性對不同品種抹茶進行綜合評價時,不能僅參考一個或幾個指標特征的優劣,更應該全面、客觀、系統地將所有指標都納入綜合評價范疇[30]。由于不同指標存在單位和量綱地差異,故應將這些指標進行標準化處理,再進行主成分分析,結果見圖3和表3。

由圖3可知,前2個主成分(principal component, PC)的累積方差貢獻率可達82.5%。8個不同品種抹茶可明顯被分為3組,分別為“中茶302”和“龍井43”,3個國外品種及剩余的4個品種抹茶。隨后,構建各主成分的線性模型,得到的線性模型如下:

PC1=2.24Z2-0.04Z1+1.61Z3-1.82Z4+2.07Z5+2.12Z6+2.39Z7+2.47Z8+0.78Z9+2.23Z10+1.86Z11-0.18Z12+2.19Z13+2.41Z14+1.94Z15+2.56Z16+2.46Z17+1.79Z18+2.55Z19

PC2=2.5Z1-0.56Z2+0.61Z3+1.68Z4+1.47Z5-1.51Z6-0.72Z7-0.75Z8+2.33Z9+1.09Z10+0.69Z11+2.54Z12-0.43Z13+0.78Z14+0.76Z15-0.51Z16-0.39Z17+1.34Z18-0.18Z19

圖3 不同品種抹茶的主成分分析評分Fig.3 Principal component analysis score in different varieties of matcha

表3 主成分特征向量、特征值、方差貢獻率及累計方差貢獻率Table 3 Principal component eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rate, and cumulative variance contribution rate

由表3可知,PC1的特征值為9.51,方差貢獻率為58.12%,是貢獻最大的主成分,主要綜合了抹茶的水浸出物、可溶性糖、茶多酚、茶氨酸、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和抗氧化指數得分率,代表主要綜合反映抹茶營養物質和體外抗氧化活性。PC2的特征值為3.99,方差貢獻率為24.38%,主要綜合了水分、沒食子酸、咖啡堿和羥自由基清除率,是對PC1營養物質和體外抗氧化活性的補充。

以各主成分的方差貢獻率占累計總方差貢獻率的比率為權重計算綜合得分[30],計算如公式(3)所示:

(3)

根據表4可知,在綜合反映抹茶品質的PC1中,排名前3的抹茶依次為“龍井43”、“中茶302”和“茂綠”,說明這3種抹茶的可溶性糖、茶氨酸、茶多酚和表沒食子兒茶素含量較高。其中“龍井43”品種抹茶的PC1綜合指標值為0.35,高于其他7種抹茶,故“龍井43”品質抹茶的營養物質更豐富。在PC2綜合指標值中排名前2的抹茶分別為“中茶302”和“龍井43”,其綜合指標值分別為0.12和0.1,說明“中茶302”和“龍井43”的體外抗氧化活性比其他6種抹茶更強。與其他7種抹茶相比,“龍井43”品質抹茶的PC1和PC2值均較高,因此“龍井43”品質抹茶的茶氨酸和茶多酚等2種生物活性物質含量相對最高,綜合體外抗氧化指數得分率最高,營養物質含量也更豐富。

表4 不同品種抹茶品質評價的綜合指標值、綜合得分和排名Table 4 Comprehensive index value, comprehensive score, and ranking of the quality evaluation in different varieties of matcha

3 結論

抹茶是一種未經發酵的茶粉,其富含茶氨酸、茶多酚和咖啡堿等多種天然生物活性成分,常被作為一種健康無害的天然食品添加劑,在食品工業有巨大的經濟和應用價值。同時,在運動訓練和體能恢復中適量攝入會取得積極效果。本研究以8種不同品種的抹茶為研究對象,系統地比較不同品種抹茶在相關基礎理化指標(水分、水浸出物、粒度和灰分)、營養物質(可溶性蛋白、可溶性糖、茶氨酸、茶多酚、兒茶素類化合物和咖啡堿)和體外抗氧化活性的品質差異。結果表明,抹茶中水分、粒度(D60)和灰分等基礎理化指標均符合GB/T 34778—2017《抹茶》的要求,且我國不同品種抹茶的平均水浸出物含量顯著高于國外抹茶樣品(P<0.05)。抹茶中可溶性蛋白(2.22～2.77 g/100 g)、可溶性糖(6.31～7.16 g/100 g)、茶氨酸(1.46～2.09 g/100 g)、茶多酚(10.96～12.67 g/100 g)等營養物質在不同品種中存在顯著差異(P<0.05)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯是抹茶中含量最高的單體兒茶素類化合物,約占整體兒茶素類化合物含量的65%。此外,不同品種抹茶的體外抗氧化活性差異顯著(P<0.05),其中“龍井43”品種抹茶的綜合體外抗氧化活性最強?；谥鞒煞址治?構建了主成分向量及其方差貢獻率的綜合指標評價模型,發現“龍井43”品種抹茶的綜合得分最高,說明其品質最優。本研究可為抹茶的研究與開發提供數據基礎。