基于土壤宏基因組的聚磷酸激酶的篩選與鑒定

章素平,高森浩,李王馨月,張錦豪,楊詩韻,尤忠毓*

1(嘉興南湖學院 新材料工程學院,浙江 嘉興,314001)2(嘉興大學 生物與化學工程學院,浙江 嘉興,314001)

腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)是一種含有2個高能磷酸鍵的化合物,是生物體各類生命活動所需能量的重要來源[1]。在生物催化生產高價值的產品時,ATP也是最常見的能量供體,但ATP本身價格昂貴,經濟上不允許在反應過程中直接添加ATP[1]。目前最常見的ATP供應方式是ATP再生系統,即將一個合成ATP的酶催化反應與消耗ATP的酶催化反應進行偶聯,使其能夠以廉價的原料實現ATP的循環再生[2]。截止目前,ATP再生系統所使用的酶主要是激酶,包括聚磷酸激酶、乙酸激酶、腺苷酸激酶、氨基甲酸激酶、丙酮酸激酶等,其中聚磷酸激酶的應用較為廣泛[1-2]。

聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK,EC 2.7.4.1)能夠以多聚磷酸鹽(polyPn)為磷酸供體催化ADP生成ATP,其反應過程為:ADP+polyPn→ATP+polyPn-1,其中polyPn可分為短鏈polyPn(n<10)和長鏈polyPn(n>10),由于短鏈polyPn的合成簡單、價格低廉,因此,基于PPK和短鏈polyPn的ATP再生系統能夠得到有效的應用[3-4]。目前來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)、嗜熱聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)、白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)等多種生物的PPK已被鑒定并用于ATP再生系統的構建,實現了5-氨基酮戊酸、D-木酮糖-5-磷酸、谷胱甘肽、ε-聚賴氨酸等多種化合物的酶法合成[3,5-7]。不同來源的PPK具有不同的催化特性與底物偏好性(不同鏈長的polyPn),適用于不同的ATP依賴型酶催化反應,因此,篩選并開發新型的PPK將有利于擴大ATP再生系統的應用范圍。

宏基因組是指生境中所有微小生物遺傳物質的總和,是新型生物催化劑的重要來源[8]?；诤昊蚪M的生物催化劑篩選避免了微生物的分離純化過程,加快了新型生物催化劑的開發進程。近年來,利用宏基因組技術已經發現了大量的生物催化劑,例如,雙功能纖維素酶、木聚糖酶、酯酶、內切-β-1,4-葡聚糖酶等[9-12]。本研究以土壤宏基因組為研究對象,利用直接PCR擴增法篩選新型聚磷酸激酶基因,并實現其在大腸桿菌中的重組表達,為新型ATP再生系統的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

土壤基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA-EZ Reagents L土壤腐植酸清除劑、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、T載體PCR產物克隆試劑盒、Taq Plus DNA聚合酶、限制性內切酶(NcoI和XhoI)、ATP、ADP、多聚磷酸鈉(polyP6)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 菌株、質粒及培養基

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET28a均由本實驗室保藏,分別用于基因的克隆及表達。LB培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,固體培養基加入20 g/L瓊脂,必要時加入相應抗生素:氨芐青霉素(100 μg/mL)或卡那霉素(50 μg/mL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤采集

土壤樣品采自浙江省內農田、果園、濕地公園等,取樣深度距土壤表面10～15 cm。

1.2.2 土壤宏基因組DNA的提取

利用土壤腐植酸清除劑除去各土壤樣品中的腐植酸,再利用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒提取土壤樣品的總DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取樣品。

1.2.3 聚磷酸激酶基因的獲取

從GenBank數據庫中下載來源于E.coli(EcPPK,WP_115187122)、T.thermophilus(TtPPK,BCZ86902)、T.elongatus(TePPK,QLL30020)、Neisseriameningitidis(NmPPK,AAA85674)、Alcaligenesfaecalis(AfPPK,KGP01591)的PPK氨基酸序列,通過多重序列比對搜索保守序列,根據保守氨基酸序列設計簡并引物。以土壤宏基因組DNA為模板,進行PCR擴增,并將擴增產物與T-載體連接后轉化至E.coliDH5α感受態細胞中,挑取單克隆送上海生工測序。將測序結果輸入GenBank數據庫中進行比對,選擇序列一致性較高且定義為PPK的序列為研究對象。根據數據庫中對應的全長序列,直接設計特異性引物,以相應的土壤宏基因組DNA為模板,通過PCR獲得全長編碼基因,通過與T-載體連接后測序驗證。

1.2.4 聚磷酸激酶基因的序列分析

使用MEGA5對潛在PPK蛋白序列和已知的PPK序列進行多重比較,構建系統發育樹(建樹方法:Neighbor-joining,Bootstrap method檢測1 000次,建樹模型:Poisson model)。利用ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)對PPK的理化性質進行分析;利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)對疏水性進行分析;利用TMHMM Server v.2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析跨膜結構;利用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽;利用SWISS-MODEL在線服務(http://www.swissmodel.expasy.org/)進行同源建模,構建三級結構模型[13],用PDBsum Generate在線服務(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ Generate.html)對3D結構進行評估,蛋白質結構通過PyMOL展示。

1.2.5 聚磷酸激酶的重組表達及分離純化

根據序列分析的結果,重新設計表達引物,并在引物中引入NcoI和XhoI酶切位點。將重新PCR擴增的PPK基因與表達載體pET28a連接,轉化至E.coliDH5α感受態細胞中,利用菌落PCR篩選陽性克隆,并通過酶切及測序驗證重組質粒構建的正確性。

將測序驗證正確的表達質粒轉化至表達宿主,重組菌株接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中,37 ℃培養至OD600值等于0.6,再向培養基中加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),15 ℃條件下誘導20 h,4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體,并重懸于100 mmol/L PBS(pH 7.0)緩沖液中,超聲破碎細胞,12 000 r/min離心收集上清和沉淀,利用SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。

利用Ni-TED 6F色譜柱和AKTA pure層析系統分離目的蛋白。首先,用平衡緩沖液(50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液+300 mmol/L NaCl)平衡色譜柱,上樣后用洗脫液1(平衡緩沖液+50 mmol/L咪唑)對非特異性吸附的雜蛋白進行洗脫,再用洗脫液2(平衡緩沖液+300 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白,通過SDS-PAGE檢測蛋白的分離情況。

1.2.6 重組聚磷酸激酶的酶活檢測

以ADP和多聚磷酸鈉為底物,檢測聚磷酸激酶的活力,反應體系(10 mL)如下:50 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液,5 mmol/L ADP,10 mmol/L多聚磷酸鈉,10 mmol/L MgCl2,加入1 mL酶液,40 ℃反應300 min,沸水浴5 min終止反應,12 000 r/min離心后取上清液,利用HPLC檢測ATP的生成量。HPLC檢測條件:色譜柱為C18柱;流動相:V(磷酸鹽緩沖液)∶V(甲醇)=90∶10;檢測波長254 nm;流速為1 mL/min;柱溫35 ℃。

1.2.7 重組聚磷酸激酶的應用

靈菌紅素縮合酶PigC可以在ATP存在下催化合成靈菌紅素及其類似物[14]。本試驗將重組聚磷酸激酶與靈菌紅素縮合酶PigC聯用,合成靈菌紅素類似物。反應體系(1 mL)如下:50 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液,1 mmol/L ADP,5 mmol/L多聚磷酸鈉,5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC),0.2 mmol/L 2,4-二甲基-3-乙基吡咯,聚磷酸激酶和靈菌紅素縮合酶PigC粗酶液各100 μL,25 ℃水浴反應1 h,加入酸性丙酮終止反應。

2 結果與分析

2.1 土壤宏基因組DNA的提取

土壤樣品中常存在大量的腐殖酸,會影響DNA的提取及后續的分子生物學操作。為了獲得高質量的宏基因組DNA,本實驗首先利用腐植酸清除劑提前處理土壤樣品,再利用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒提取土壤總DNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖1所示,各泳道樣品均顯示單一高分子量條帶,且無明顯的拖尾、彌散等現象,說明所提取的DNA相對完整,無降解,質量較高,有利于后續實驗的開展。

2.2 聚磷酸激酶基因的克隆

從GenBank中獲取5條不同來源的PPK氨基酸序列,利用Clustalw進行多重序列比對,根據比對結果確定了2處保守性較高的序列(圖2-A,圖2-B),兩個保守序列相距330個氨基酸左右。以保守的氨基酸序列為基礎,設計了一對簡并引物:P1:5′-ARTARCAAYYTRGAYGARTTYTWY-3′,P2:5′-YTCRTCRAA-YCKNGCCHTYMMYTC-3′。以土壤宏基因組DNA為模板,進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示(圖2-C),不同的模板擴增后得到多種大小不一的片段,包括250、350、550、750、1 000、2 000 bp等。根據簡并引物設計的距離,選擇大小為1 000 bp的片段進行膠回收后與T-載體連接,轉化至E.coliDH5α感受態細胞中,經藍白斑篩選,挑取陽性克隆送上海生工測序。

M-DNA Marker;1-7-不同土壤樣品的基因組DNA圖1 土壤宏基因組DNA電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of soil metagenomic DNA

測序結果顯示,共獲得2條不同的DNA序列,將其編碼的氨基酸序列在GenBank中進行BlastP分析,結果顯示,其中一條序列與E.coli的PPK序列一致性達99%,另一條序列與Serratiamarcescens的PPK序列一致性達98.9%。查閱文獻可知,來源于E.coli的PPK已被廣泛研究[15],而關于S.marcescens的PPK研究鮮見報道。因此,選擇S.marcescens的PPK為后續研究對象,以GenBank中S.marcescens的PPK基因全長序列直接設計引物(F:5′-ATGGGTCAGGAAAAGCTCTACATCG-3′,R:5′-CTACTGTCCTGGTTGTTCCAGAGC-3′),以相應土壤宏基因組DNA為模板,通過PCR擴增全長,瓊脂糖凝膠電泳顯示,擴增產物為2 000 bp左右的片段(圖2-D),經T-A克隆后測序,結果顯示,在所克隆的片斷中包含一個2 064 bp的開放閱讀框,編碼一個由687個氨基酸殘基組成的蛋白質,序列分析表明,該蛋白即為S.marcescens的PPK(SmPPK)。

A-上游保守氨基酸序列;B-下游保守氨基酸序列;C-不同宏基因組DNA為模板的PCR產物;D-候選基因的全長PCR產物圖2 聚磷酸激酶基因的篩選Fig.2 Screening of polyphosphate kinase genes

2.3 SmPPK的生物信息學分析

從GenBank中篩選11條來源于不同微生物的PPK序列,利用MEGA5構建系統發育樹,確定不同來源PPK之間的進化距離。結果顯示(圖3-A),不同來源的PPK聚到2個大的分支上,其中SmPPK與Serratianevei、Gibbsiellaquercinecans等來源的PPKs在同一分支上,說明它們的親緣關系較近。根據文獻報道[1],PPK可以分為PPK1和PPK2兩大家族,由系統發育樹可知SmPPK屬于PPK1家族。多重序列比對顯示(圖3-B),SmPPK與來源于E.coli、T.thermophilus、T.elongatus、N.meningitidis、A.faecalis的PPK氨基酸序列一致性分別為87.9%、23.4%、30.1%、31.5%、31.0%。

利用ProtParam在線工具對SmPPK的理化性質進行了分析。SmPPK由687個氨基酸殘基組成,其中亮氨酸(Leu)占比最高為11.5%,半胱氨酸(Cys)占比最低為0.3%,該蛋白的分子式為C3599H5696N996O1023S17,分子質量79.8 kDa,等電點8.8。SmPPK分子中帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為96個,帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為90個。利用ProtScale對SmPPK的親/疏水性進行分析,結果顯示(圖3-C),SmPPK的第584位的Val疏水性最強(分值為1.689),第190、191位的Arg親水性最強(分值為-2.656),結合ProtParam分析可知,SmPPK的總平均親水指數為-0.294,因此,SmPPK為親水性蛋白。利用TMHMM Server v.2.0和SignalP 5.0對SmPPK的跨膜結構和信號肽進行分析。結果表明(圖3-D、圖3-E),SmPPK沒有跨膜區和信號肽。

2.4 SmPPK的同源建模

為了解SmPPK的空間結構,以E.coli來源的PPK晶體結構(PDB ID:1XDP)為模板,在SWISS-MODEL中進行同源建模,結果顯示(圖4-A),SmPPK的空間結構呈典型的L型結構,包含20個α螺旋和27個β折疊。利用PDBsum Generate對所構建的模型進行評估,拉氏圖(Ramachandran plot)顯示(圖4-B),該模型中處于最佳區域的殘基比例為88.1%,處于允許區域的殘基比例為11.70%,處于不允許區域的殘基僅占0.2%,說明該模型較合理。對比E.coli的PPK可知[15],SmPPK可分為4個結構域(圖4-C):N-端結構域(residues 1～106)、“頭部”結構域(residues 107～321)和2個C-端結構域(residues 322～500,501～687),由N-端結構域和2個C-端結構域構成了一個底物進出的通道。ZHU等[15]報道了EcPPK的活性中心由His435、Asp470、His592和Glu623組成,根據序列比對發現,SmPPK中與上述4個氨基酸殘基相對應的分別是His433、Asp468、His590和Glu621,而且以上4個氨基酸殘基在其他PPK中高度保守(圖3-B),因此,推測His433、Asp468、His590和Glu621構成了SmPPK的活性中心(圖4-D)。

2.5 SmPPK的重組表達

根據序列分析結果,設計表達引物:P3:5′-CATGCCATGGGTCAGGAAAAGCTCTAC-3′,P4:5′-ATAC TCGAGCTGTCCTGGTTGTTCCAGAGC-3′,下劃線部分為NcoI和XhoI酶切位點。通過PCR擴增目的基因SmPPK,與表達載體pET28a經NcoI和XhoI雙酶切后連接,構建重組表達載體pET28a-SmPPK,并轉化至克隆宿主。重組質粒經單/雙酶切驗證(圖5-A),雙酶切產物可見約2 000 bp的目的基因和5 400 bp的載體,單酶切產物可見大于5 400 bp的單一條帶,說明重組表達載體構建成功,進一步通過測序驗證序列的正確性。

將測序驗證正確的重組質粒pET28a-SmPPK轉化至表達宿主E.coliBL21(DE3),經0.1 mmol/L IPTG誘導后,進行SDS-PAGE電泳檢測,結果顯示(圖5-B),在80 kDa的位置有特異性表達條帶,與目的蛋白理論值一致。細胞破碎上清和沉淀中均有目的條帶,說明SmPPK在表達過程中形成了包涵體,可以通過降低誘導溫度、減少誘導劑濃度等方法,增加其可溶性表達。SmPPK的C末端攜帶His標簽,因此,采用鎳離子親和層析的方法對細胞破碎液上清中的目的蛋白進行分離純化,SDS-PAGE電泳檢測顯示(圖5-C),利用含50 mmol/L咪唑的洗脫液去除雜蛋白,再用含300 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白,可以得到電泳純的SmPPK。

2.6 SmPPK的活性檢測及應用

為驗證SmPPK在ATP合成中的效率,本試驗以ADP和多聚磷酸鈉為底物,考察了SmPPK合成ATP的時間進程,結果顯示(圖6-A),在反應初期的60 min內,ATP的產率快速升高,后期隨著時間的延長,ATP產率增速逐漸變緩,當反應240 min時,ATP產率達到最大值46.5%。為進一步驗證SmPPK在ATP再生系統中的應用潛能,以SmPPK和靈菌紅素縮合酶PigC為催化劑構建了雙酶偶聯催化合成靈菌紅素類似物的反應體系,結果顯示(圖6-B),當反應體系中只有PigC時,反應液的顏色較淺,即靈菌紅素類似物的產量較少;當體系中同時存在PigC和SmPPK時,反應液的顏色明顯變深,即靈菌紅素類似物產量增加。以上結果表明,SmPPK具有較好的ATP合成能力,可用于構建ATP再生系統并應用于ATP依賴的酶催化反應。

A-SmPPK的3D結構模型;B-SmPPK結構模型拉氏圖;C-SmPPK的結構域模型(N-端結構域為綠色;“頭部”結構域為藍色; C端結構域分別為青色和黃色);D-SmPPK的活性位點(His433、Asp468、His590和Gln621)圖4 SmPPK的3D結構預測Fig.4 Predictive 3D structure model of SmPPK

A-重組質粒pET28a-SmPPK的酶切驗證(M-DNA Marker;1-pET28a-SmPPK的Nco I酶切產物;2-pET28a-SmPPK的Xho I酶切產物; 3-pET28a-SmPPK雙酶切產物);B-SmPPK誘導表達的SDS-PAGE分析(M-Protein Marker;1-未誘導細胞的裂解物;2-誘導細胞的裂解沉淀;3-誘 導細胞的裂解上清);C-SmPPK的純化(M-Protein Marker;1-裂解上清;2-穿透峰;3-50 mmol/L咪唑洗脫的樣品;4-300 mmol/L咪唑洗脫的樣品)圖5 SmPPK的重組表達Fig.5 Recombinant expression of SmPPK

A-SmPPK催化合成ATP的時間進程;B-基于SmPPK的ATP 再生系統在靈菌紅素類似物合成中的應用 (1-空白對照;2-含PigC但不含SmPPK;3-含PigC和SmPPK)圖6 SmPPK的活性檢測及應用Fig.6 Enzyme activity and application of SmPPK

3 結論與討論

生物催化過程因具有效率高、選擇性高、環境友好等優點,廣泛應用于高附加值化學品的生產[16]。ATP作為一種重要的輔因子,參與許多需要能量的生物催化過程,但直接向反應體系中添加ATP不僅增加了生產成本,而且會產生多種副產物影響后續的產品分離[7,17]。因此,構建廉價、高效的ATP再生系統對于ATP依賴的生物催化過程顯得至關重要。聚磷酸激酶因其底物廉價易得,已成為ATP再生系統構建的首選酶之一。截止目前,已報道的成功應用于ATP再生的聚磷酸激酶數量有限[1],因此,挖掘新型聚磷酸激酶構建ATP再生系統將有利于推動ATP依賴的生物催化過程的應用進程。

宏基因組技術避開了微生物純培養的過程,擴大了可研究的微生物范圍,是一種篩選新酶基因的有效方法[18]。本研究基于聚磷酸激酶的保守序列設計簡并引物,從土壤宏基因組中篩選到一條來源于S.marcescens的聚磷酸激酶基因SmPPK,序列分析表明,SmPPK與E.coliPPK具有較高的序列一致性,同屬于PPK1家族。該家族PPK通常由600～700個氨基酸組成,對ATP具有較高的底物偏好性,部分家族成員屬于膜結合蛋白[2,6],但SmPPK經TMHMM分析表明不具有跨膜區。同源建模顯示,SmPPK由4個結構域組成典型的L型空間結構,其活性中心主要由His433、Asp468、His590和Glu621組成[15],催化過程可能通過酶自身的磷酸化實現,而His433和His590在磷酸化過程中發揮重要作用[19]。

本研究采用大腸桿菌系統實現了SmPPK的重組表達,并利用鎳離子親和層析對重組蛋白進行了分離純化,獲得了電泳純的重組SmPPK。酶活檢測顯示,SmPPK可以在多聚磷酸鈉的存在下,實現ATP的合成,其最高產率為46.5%,該產率高于源自E.coliMG1655的PPK(15.5%)和源自Rhodobactersphaeroides的PPK(20.1%),但低于源于泗陽鞘氨醇桿菌的PPK(71%)[4]。在利用SmPPK構建ATP再生系統與靈菌紅素縮合酶PigC耦合時,成功實現靈菌紅素類似物的合成。因此,SmPPK在ATP再生領域具有較好的研究和應用價值。本研究下一步將對SmPPK的酶學特性及催化機理進行更加深入的研究,以了解該酶適用的催化條件,提高其合成ATP的產率,為更多ATP依賴的生物催化過程提供ATP再生系統。