嗜酸乳桿菌與枯草芽孢桿菌協同發酵玉米淀粉糖渣

李少雷,陳旭升,張宏建,王靚,張建華*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉液化、糖化后壓濾得到的殘渣,其含有豐富的還原糖、蛋白質和膳食纖維等成分。根據姚宇晨等[1]的預測,到2023年,我國玉米淀粉糖產量將超過2 400萬t。相應地,預計每年將產生大約200萬t的糖渣。目前,多數企業直接將糖渣作為飼料原料進行銷售,但由于糖渣適口性差且含有營養限制因子,導致糖渣的飼喂效率較低[2]。

利用微生物發酵能夠提升蛋白含量、改善風味、消除營養抑制因子,是實現糖渣高值利用的有效手段[3]。在玉米淀粉糖渣的發酵方式中,固體發酵具有對設備和發酵環境要求低、能耗低、排廢少且利用率高等優勢[4]。趙建國[5]以Y9601酵母為出發菌,固體發酵玉米淀粉渣, 通過工藝條件優化,產物酵母數可達7.45×109個/g,表觀粗蛋白增加12.7%,真蛋白凈增加5.46%,但該方法并不能改善玉米淀粉糖渣的風味、口味;曹磊[6]對玉米淀粉糖渣生產功能性乳酸菌活菌飼料進行了研究,在液態發酵中,將鼠李糖乳桿菌的活菌數由4.10×108CFU/mL提高到1.08×109CFU/mL,達到乳酸菌發揮有益作用要求的菌體密度;還對鼠李糖桿菌的固態發酵工藝條件進行了優化,得到了1.10×109CFU/g的活菌數。前人研究表明,利用糖渣生產乳酸菌制劑是可行的。

本研究以玉米淀粉糖渣為原料,采用枯草芽孢桿菌協同乳桿菌發酵,旨在提高對糖渣中糖的利用率和乳桿菌的活菌數。對雙菌發酵進行了種子液接種量、含水量、起始pH、裝料量等因素的單因素優化,再選取3個顯著影響的條件進行響應面優化,以提高乳桿菌活菌數。對雙菌發酵產物和單菌發酵的產物的蛋白質、氨基酸、風味物質、抗營養因子和抗氧化能力進行了分析檢測。本研究將為提升玉米淀粉糖渣附加值提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

玉米淀粉糖渣由山東菱花集團提供;麩皮采購于市場;化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司、北京伊諾凱試劑有限公司,純度為分析純。

1.1.2 菌種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus),山東威昂生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),北海強興生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 種子液培養基

采用LB培養基培養芽孢桿菌;采用MRS培養基培養乳桿菌[7]。

1.1.3.2 固體培養基

固體培養基是將種子液培養基中添加30 g/L的瓊脂制備而成。

固態發酵培養基:玉米淀粉糖渣與麩皮質量比1∶1,50%含水量,250 mL三角瓶裝料量20 g,起始pH值為7,115 ℃滅菌15 min[8]。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外可見分光光度計,博訊(上海)有限公司;高效液相色譜儀,美國安捷倫有限公司;凱氏定氮儀,山東海能儀器有限公司;味覺分析儀,日本INSENT公司;Heracles II電子鼻,法國Alpha MOS S.A.有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固態發酵的條件優化

雙菌接種比例的優化:乳桿菌接種量5%,再按照乳桿菌與枯草芽孢桿菌的接種比例為5∶0、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4(體積比,下同)接種,在37 ℃發酵48 h后,測定發酵物中的乳桿菌活菌數、pH、殘糖量。

單因素發酵優化試驗:種子液接種量、含水量、起始pH和裝料量進行單因素發酵試驗,以最高的乳桿菌菌落數為確定因素的最適范圍。

為進一步提高乳桿菌活菌數,對前期單因素優化試驗中確定的種子液接種量、起始pH和含水量為影響顯著影響因素因素,進行響應面優化試驗(表1)。

表1 乳桿菌發酵單因素試驗因素與水平Table 1 Lactobacillus acidophilus fermentation single factor test factors and levels

乳桿菌發酵工藝響應面優化試驗:基于單因素試驗結果,以乳桿菌菌落數(Y)為響應值,利用Box-Behnken進行工藝優化設計。根據響應面法建立的數學模型,分析預測乳桿菌最佳發酵工藝條件,對優化的工藝進行驗證,對發酵產物進行評價。

1.3.2 乳桿菌計數方法

無菌條件下將樣品稀釋100倍,200 r/min搖床上振蕩15 min,后逐級稀釋至10-6,取100 μL稀釋后菌液加入平板中,倒雙層MRS固體培養基,37 ℃培養48 h,根據菌落數計乳桿菌數[9]。

1.3.3 葡萄糖測定方法:

葡萄糖測定參照SBA法[10]。

1.3.4 氨基酸、植酸、總酚、DPPH自由基清除率測定方法

將樣品冷凍干燥后采用高效液相色譜法測定氨基酸含量[11]、雙吡啶法測定植酸含量[12]、福林酚法測定總酚含量[13]、分光光度法測定DPPH自由基清除率[14]、凱氏定氮法測定蛋白質含量[15]。

1.3.5 電子鼻測定方法:

樣品經冷凍干燥后采用Heracles Ⅱ電子鼻[16]進行分析測定。

1.3.6 電子舌測定方法:

樣品經冷凍干燥后采用味覺分析儀[17]分析。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與乳桿菌雙菌試驗

曹磊[6]對糖渣的固態發酵研究,發現鼠李糖乳桿菌不能直接利用糖渣中的粗蛋白,外源添加2%(質量分數)的蛋白胨可以促進乳桿菌的增殖。因此,氮源可能是限制乳桿菌在糖渣中增殖的主要因素。然而,外部添加氮源的方法不僅會增加成本并且增加了染菌的風險。ZHANG等[8]利用枯草芽孢桿菌MA139的固態發酵提高路氏乳桿菌G8-5的活力,多菌制劑的最高乳酸菌數目為9.01×109CFU/g,最大芽孢桿菌數目為1.03×1010CFU/g。研究認為枯草芽孢桿菌分泌蛋白酶并水解粗蛋白,為乳桿菌提供氮源,同時因枯草芽孢桿菌生長消耗了氧氣,為乳桿菌增殖營造了厭氧環境。

基于上述已有研究結果,本研究嘗試在糖渣中按不同比例同時接入乳桿菌和枯草芽孢桿菌。結果(圖1)表明,隨著枯草芽孢桿菌比例的增加,葡萄糖消耗量先增加后減少,終pH先下降后上升。乳桿菌活菌數在兩菌比例為5∶2時最高,為1.50×109CFU/g,比未添加枯草芽孢桿菌(5∶0)時高2.86倍,同時,終pH也因為乳桿菌的生長而降低。隨著枯草芽孢桿菌比例的繼續增加,導致乳桿菌活菌數下降,表明二者之間的競爭加劇,枯草芽孢桿菌成為優勢菌株,這不利于葡萄糖利用率的增加。以上現象說明,適量添加枯草芽孢桿菌可以促進乳桿菌的生長,提高葡萄糖利用率。

2.2 響應面優化試驗優化提高乳桿菌數

2.2.1 響應面試驗優化試驗

固定條件為發酵37 ℃、雙菌種子液比例為5∶2、發酵時間為48 h、250 mL三角瓶裝料量為20 g。以種子液接種量(A)、培養基含水量(B)、初始pH(C)為響應因子,以乳桿菌菌落數(Y)為響應值,根據Box-Behnken設計3因素3水平優化試驗,試驗設計見表2,響應面二次模型方差分析見表3。

a-pH;b-葡萄糖含量;c-乳酸菌數圖1 枯草芽孢桿菌與乳桿菌接種比例對發酵的影響Fig.1 Effect of Bacillus subtilis to Lactobacillus inoculation ratio on fermentation注:比例為嗜酸乳桿菌:枯草芽孢桿菌種子液體積比。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據Design Expert分析軟件進行回歸分析,得到乳桿菌活菌數對接種量、培養基含水量、初始pH的二次回歸模型方程:

Y=4.99+0.268 3A-0.048 7B+0.125C-0.11AB-0.207 5AC+0.292 5BC-0.468 8A2-0.328 7B2-0.116 2C2

2.2.2 響應面試驗驗證的試驗

根據響應面法建立的數學模型,分析預測出乳桿菌發酵工藝的最佳條件為:雙菌種子液體積比為5∶2,乳桿菌與枯草芽孢桿菌接種量為7.8%,含水量為72%,初始pH為7.26,乳桿菌預測值為5.05×109CFU/g。

根據優化后的工藝條件,在相同的實驗條件下,對單菌和雙菌發酵進行了測定,以獲取乳桿菌的生長曲線,包括菌落數、pH值和殘糖。實驗結果如圖2所示。

結果表明,在經過枯草芽孢桿菌協同發酵后,乳桿菌活菌數明顯增加。相較于單一乳桿菌的發酵,雙菌發酵的乳桿菌活菌數增加了2.42倍,達到了5.05×109CFU/g。驗證與模型預測值相符,說明響應面法優化乳桿菌發酵工藝是可行的,枯草芽孢桿菌和乳桿菌在發酵中具有協同作用。同時,發酵后的pH明顯下降,這表明乳桿菌代謝活動增強,導致有機酸的累積。另外,葡萄糖消耗量也顯著提高,表明協同發酵的代謝效率更高。

2.3 發酵產物組分分析

2.3.1 發酵產物功能性與抗營養因子等物質的分析

總酚在飼料中起到抗氧化、保護營養成分、提高穩定性和延長保存期的作用[18]。表4結果表明發酵可以顯著增加總酚含量,其中雙菌發酵的含量高于單菌發酵;植酸是一種抗營養因子,抑制動物腸道對礦物質的吸收,對動物生長和健康有負面影響[19],發酵過程中微生物分泌的植酸酶分解了植酸,使其含量顯著降低;飼料清除DPPH自由基的能力越強,其抗氧化能力越強,發酵后的產物更有助于動物腸道健康[20]。發酵后,粗蛋白質、水解氨基酸和游離氨基酸的含量會增加。這種現象一方面是由于總體干重的減少,另一方面則是因為乳桿菌和枯草芽孢桿菌分泌的相關酶作用的結果。綜合來看,雙菌發酵比單菌發酵的效果更好,二者與未發酵的糖渣相比,營養物質增加、功能性增強和抗營養因子減少。

a-乳酸菌數;b-pH;c-葡萄糖含量圖2 單乳桿菌、雙菌協同發酵效果對比Fig.2 Comparison of synergistic fermentation effects of Lactobacillus monosis and Lactobacillus monobacterium

表4 功能性與抗營養因子分析表Table 4 Table of functional and anti-nutritional factor analysis

2.3.2 電子鼻風味特征性分析

使用Heracles Ⅱ電子鼻,對糖渣、乳桿菌的單菌發酵物以及雙菌的發酵物進行了風味性物質分析(圖3)。每個保留時間對應著相應的化合物和相關風味。如表5所示,在保留時間為18.18、24.71 min的潛在可能性組成中,主要成分為二甲硫醚,該物質具有不愉快氣味和毒性,另一成分乙硫醇則具有刺激性蒜臭味和微毒性。經過發酵后,這些氣味顯著減少。在保留時間為52.48、62.70、66.74 min的潛在可能性組成中,主要成分為環己醇、辛酮、庚酸甲酯等具有芳香氣味的物質。發酵后,這類物質的含量明顯增加。而在保留時間為36.24 min的潛在可能性組成中,主要成分為丁二醇,該物質只在混菌發酵中存在,具有類水果味和奶油味。此外,在保留時間為64.13 min的潛在主要成分中,單菌發酵新增正葵烷等芳香類物質,而混菌發酵則主要新增2-乙基-3-甲基吡嗪,該物質具有強烈的堅果香味。

綜上所述,經過發酵后,3種糖渣的氣味出現了明顯的差異。未發酵的糖渣多為酸臭味等不愉快氣味,乳桿菌的單菌發酵物減少了臭味,同時增加了醇和脂類的香味。乳桿菌和枯草芽孢桿菌雙菌的發酵物則在減少臭味的基礎上,增加了強烈的類堅果香味。單菌發酵和雙菌協同發酵都可以改善糖渣的風味,但雙菌協同發酵的香味更為濃烈。

圖3 電子鼻風味雷達圖Fig.3 Electronic nose flavor radar

表5 風味物質成分表

2.3.3 電子舌味道分析

電子舌能感知液體環境中的不同味感,將待測樣品的化學信號轉化為電信號,電信號通過信號采集單元和模式識別系統轉化為電勢差,其輸出值為電子舌評分[21]。由表6可知,發酵減少了苦味,增加了澀味、苦味回味和澀味回味,分析原因為發酵降解了苦味物質,而又增加了可導致澀味的多酚類物質,使得味道變化;又由于發酵后鮮味氨基酸含量的增加,鮮味也有顯著增加,發酵消耗了部分培養基中的糖導致甜味減少,而分泌的乳酸等酸性物質導致酸味也顯著增加。王玉[22]對21日齡斷奶仔豬進行添加風味劑的研究中,發現聯合添加鮮味劑和復合有機酸具有提高采食量的作用。發酵使糖渣味道更偏向于鮮味和酸味,與研究中風味劑相似。

表6 電子舌味道分析表 單位:分

3 結論

單乳桿菌發酵玉米淀粉糖渣,乳桿菌活菌數為5.24×108CFU/g。采用枯草芽孢桿菌與乳桿菌協同發酵,乳桿菌活菌數提升到1.50×109CFU/g,是單菌發酵的2.86倍。并通過工藝優化,將乳桿菌活菌數提高至5.05×109CFU/g,比相同條件下單菌發酵的活菌數高出2.42倍。

對糖渣、單菌發酵和雙菌發酵的產物進行分析,結果表明,發酵可降低植酸含量、增加總酚含量、提升抗氧化能力,同時蛋白質和氨基酸含量也有所增加。在氣味方面,發酵可減少異味,增加醇和酯類香氣,雙菌發酵還兼具濃烈的類堅果香味。此外,口味上也有所改善,減少了苦味,增加了酸味和鮮味,雙菌發酵的效果優于單菌發酵。

本研究方法可用于糖渣的資源化利用,提升糖渣的價值,在工業生產中的應用還需進一步研究。