感官和化學分析技術結合解析不同茬次清香型白酒風味特征

吳蘭,韓英,甄攀,史斌斌,王佳寶,陳雙*,徐巖

1(江南大學 生物工程學院,釀造微生物與應用酶學研究室,江蘇 無錫,214122) 2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司,山西 呂梁,032200)

以汾酒為代表的清香型白酒是我國起源最早的白酒香型,近年來清香型白酒的市場份額呈現快速增長的復興態勢,體現出清香型白酒獨特的魅力。傳統清香型白酒采用“清蒸清茬、地缸發酵、清蒸二次清”的生產工藝,蒸餾得到各具特色和風格的基酒類型(大茬酒和二茬酒)。大茬酒清香突出,入口醇厚綿甜,具有一定糧香;二茬酒清香明顯,協調爽凈,回味較長[1]。這2種酒經品評、分級、貯存后,按需求勾兌為成品酒。因此,對清香型大茬二茬基酒的風味品質控制是決定成品酒的基礎。

白酒的風味成分是決定白酒香氣、風格和品質的關鍵。前期已經對作為基本香型的清香型白酒的風味成分進行了較為充分的研究。從1964年汾酒試點開始,對汾酒的質量進行了研究和鑒定[1],至中國白酒169計劃的開展實施,從汾酒中分析檢測出703種揮發性成分[2]。最近,有研究從汾酒中鑒定出揮發性成分1 224種[3]。清香型白酒中的揮發性組分較多且復雜,但并非所有的揮發性組分對清香型白酒的風味品質都有貢獻,前期就有不少研究對清香型白酒中的重要香氣成分進行了分析。早期丁云連[4]采用氣相色譜-嗅聞技術對汾酒進行分析,共鑒定出87種香氣化合物。后來,GAO等[5]又進一步通過精確定量、重組、缺失這一策略確認了汾酒中27種關鍵香氣組分,并發現除乙酸乙酯外,一些微量成分如β-大馬酮、土味素對清香型白酒起著重要作用。直到近幾年,使用高精密度儀器從清香型白酒中鑒定出358種微量香氣活性化合物[3]。然而前期的這些研究大多都是集中在清香型的成品酒研究中,而對于清香型基酒風味差異的研究卻較少。在白酒風味研究的早期,有學者采用香氣萃取稀釋分析法和氣相色譜-質譜法從清香型不同茬次原酒中鑒定出104種揮發性香氣組分,包括50種香氣稀釋因子(flavor dilution factor,FD)值>25的香氣化合物[6]。但這與清香型成品酒的風味研究相比還不夠充分。

因此,為了更好地指導工藝控制和酒體勾調工作,需對清香型不同茬次原酒的風味特征進行充分地認識和研究。本研究采用定量描述分析和多方法聯用分析技術,以清香型不同茬次原酒為研究對象,剖析兩類清香型白酒的香氣輪廓與風味特征,增進對清香型白酒風味的認識和豐富清香型白酒風味品質表征的研究,為生產品質控制提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究分析了60個清香型原酒樣品,包括30個大茬原酒和30個二茬原酒。所有樣品均由山西杏花村汾酒廠股份有限公司提供。酒精度為60.9%～74%(乙醇體積分數)。

無水乙醇(色譜純)、氯化鈉(分析純)、乳酸(色譜純),國藥集團化學試劑有限公司;定量內標(內標1:乙酸2-苯乙酯-D3,內標4:苯乙酮-D3,內標5:(±)-芳樟醇-D3(乙烯基-D3),內標6:(R)-2-甲基丁酸-D3,內標8:2-甲基吡嗪-D6,內標9:愈創木酚-D3,內標10:3-甲基-D3-硫代丙醛,均為色譜純),上海百靈威化學技術有限公司;定量內標(內標2:乙酸正戊酯,內標3:叔戊醇,內標7:2-乙基丁酸,均為色譜純),中國食品發酵工業研究院;C6～C30正構烷烴及定量所用標準品(色譜純),Sigma-Aldrich有限公司;超純水,Milli-Q超純水凈化系統制備。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890 N-Pegasus 4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜,美國Agilent、LECO公司;7890A氣相色譜-氫焰離子化檢測器、DB-FFAP毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、CP-WAX 57CB毛細管柱(50 m×0.25 mm×0.20 μm),美國Agilent公司;Rxi-17Sil MS毛細管柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm),美國Restek公司;SPME三相萃取頭(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美國Supelco公司;MPS-2型多功能自動進樣系統,德國Gerstel公司;Milli-Q超純水儀,美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官分析

根據國際感官分析標準(ISO 8586:2012)和GB/T 10345—2022《白酒分析方法》,感官評估由20名訓練有素的小組成員在溫度為(20±1) ℃的品評室內進行。小組成員(10名男性和10名女性,年齡23～29歲)從江南大學釀造微生物與應用酶學研究室招募。分別將20 mL大茬酒和二茬酒樣品倒入專用白酒品嘗杯中。然后,所有小組成員嗅聞白酒樣品討論香氣屬性,并確認了花香、果香、甜香、青草香、糧香、酸香、醇香7種特征香氣屬性。7種特征香氣屬性及其參照如下:β-苯乙醇和3-苯丙酸乙酯(花香)、乙酸乙酯和辛酸乙酯(果香)、β-大馬酮(甜香)、E,Z-2,6-壬二烯醛和己醛(青草香)、蒸高粱(糧香)、乙酸(酸香)、正丙醇和異戊醇(醇香)。然后,小組成員采取0～5分制(0=無氣味,1=非常弱,2=弱,3=中等,4=強,5=非常強)對7種香氣屬性的強度進行評分。

1.3.2 頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用技術(headspace solid phase microextraction with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,HS-SPME-GC×GC-TOFMS)分析不同茬次香氣化合物含量

參照課題組前期報道的方法[7],將白酒樣品用超純水稀釋至5%酒精度,然后在20 mL頂空瓶中加入5 mL稀釋酒樣和1.5 g NaCl至飽和,加入20 μL同位素混合內標(內標1:175.61 μg/L乙酸2-苯乙酯-D3;內標4:84.86 μg/L苯乙酮-D3;內標5:32.06 μg/L(±)-芳樟醇-D3(乙烯基-D3);內標6:164.48 μg/L(R)-2-甲基丁酸-D3;內標8:160.41 μg/L 2-甲基吡嗪-D6;內標9:131.73 μg/L愈創木酚-D3;內標10:41.47 μg/L 3-甲基-D3-硫代丙醛),隨后用帶有PTFE硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。樣品在45 ℃條件下孵化5 min,隨后以400 r/min的轉速攪拌萃取45 min,萃取結束后以不分流模式在250 ℃下解吸附5 min,每個樣品在相同條件下重復3次。

GC×GC條件:通過使用全二維氣相色譜-飛行時間質譜對香氣化合物進行鑒定。一維和二維色譜柱分別為DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)。一維色譜柱柱溫箱的升溫程序如下:初始溫度在45 ℃保持3 min,然后以4 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,6 ℃/min升至200 ℃,然后以10 ℃/min升至230 ℃,并保持10 min。在整個色譜運行過程中,二維色譜柱柱溫保持在一維色譜柱柱溫5 ℃以上。使用高純氦氣(>99.999%)作為載氣,恒定流速為1 mL/min。調制器周期設置為4.00 s。

TOF/MS條件:檢測器在70 eV的電子撞擊電離能量模式下進行。MS傳輸線和離子源的溫度分別為240、230 ℃。數據采集頻率為100 spestra/s,質譜掃描范圍為35～400 amu。

1.3.3 香氣化合物的定性分析

色譜數據采集和分析使用LECO公司的Chroma TOF軟件進行。一維和二維保留時間偏差分別設置為12、0.2 s,將質譜與NIST2014和Wiley9數據庫中的質譜進行比較,最小峰值匹配為700[8]。隨后使用C6～C30直鏈烷烴計算香氣化合物的線性保留指數,并與NIST網站中報道的保留指數比對來進一步定性,最后采用標準品驗證來鑒定化合物。

1.3.4 香氣化合物的定量分析

1.3.4.1 直接進樣結合氣相色譜-氫焰離子化檢測(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)技術

根據SHA等[9]的方法稍作修改,使用GC-FID定量高濃度化合物,如乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丙酸、正丙醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-苯乙醇等。在1 mL白酒樣品中加入50 μL混合內標(內標2:乙酸正戊酯,125.50 mg/L;內標3:叔戊醇,111.04 mg/L;內標7∶2-乙基丁酸,102.57 mg/L),取1 μL處理過的樣品直接進樣,分流比為20∶1,進樣器和檢測器溫度為250 ℃,1 mL/min的恒定流速,以氦氣(>99.999%)作為載氣,在CP-Wax 57CB毛細管柱(50 m×0.25 mm×0.20 μm)上進行分析。柱子的升溫程序如下:起始溫度35 ℃,保持5 min,然后以4 ℃/min的升溫速率升溫到100 ℃,保持2 min,再以8 ℃/min的升溫速率升溫到150 ℃,最后以15 ℃/min的升溫速率升溫到200 ℃,保持25 min。將混合標準溶液以1∶1的體積比逐步稀釋至一系列濃度的50%vol乙醇水溶液中,建立標準校正曲線。所有樣品一式3份進行。

1.3.4.2 HS-SPME結合GC×GC-TOFMS技術

使用HS-SPME-GC×GC-TOFMS來定量大多數香氣化合物。分析條件與1.3.2節相同。由于不同化合物之間存在競爭性吸附效應,因此,為了配制更接近真實白酒體系的模擬基質。根據之前實驗室建立的方法[7],用色譜純乙醇、超純水、乳酸及5個白酒中高濃度化合物標準品配制模擬白酒溶液(含乙酸乙酯2 121.70 mg/L,乳酸乙酯3 052.32 mg/L,正丙醇754.07 mg/L,異戊醇255.52 mg/L和乙酸1 671.36 mg/L,pH=3.5,酒精度為50%vol)。準確稱取一定質量的各化合物標準品溶解在模擬白酒溶液中配制成12個不同濃度梯度的標準溶液。將標準溶液按照上述樣品前處理方法處理后進行GC×GC-TOFMS分析,各類化合物以各類化合物的同位素內標作為內標,最終以標準品與內標物的峰面積比為縱坐標,濃度比為橫坐標,繪制標準曲線。

1.4 閾值測定

本研究中苯乙醛二乙縮醛、β-環檸檬醛、2-戊基呋喃、E-2-庚烯醛和甲基壬基甲酮的閾值是采用三點選配法在46%(體積分數)乙醇/水溶液中進行測定[10]。

1.5 統計分析

采用XLSTAT 2019進行主成分分析(principal component analysis,PCA);使用Origin 2021b繪制雷達圖、人口金字塔圖、箱線圖;使用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析和偏最小二乘回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同茬次清香型白酒感官分析

為了評估大茬和二茬清香型白酒的整體香氣差異,對不同茬次清香型白酒香氣特征輪廓進行比較分析。從圖1-a中可看出,果香、甜香、糧香、酸香、醇香感官屬性在大茬酒與二茬酒之間具有顯著性差異。進一步采用PCA分析探究不同茬次清香型白酒與感官屬性之間的關系。如圖1-b所示,PC1解釋了總方差的78.85%,PC2解釋了21.04%,前2個主成分累計方差貢獻值為99.88%,如此高的方差貢獻率較好地包含了原始信息。大茬酒和二茬酒樣品分散在坐標軸的兩側,大茬酒主要表現出果香、甜香、糧香、花香等香氣特征,而二茬酒則表現為酸香、醇香等香氣特征。

a-大茬二茬清香型白酒香氣輪廓圖; b-大茬二茬清香型白酒香氣特征PCA分析圖1 大茬二茬清香型白酒感官評價結果及香氣 特征主成分分析Fig.1 Sensory evaluation results and PCA analysis of aroma intensities of light-flavor Baijiu with Dacha and Ercha

2.2 不同茬次清香型白酒香氣化合物定量分析

為了解析不同茬次清香型白酒的香氣成分差異特征,結合前期的研究[4-6,11-16]并根據香氣化合物的香氣活性值、FD值等,從不同茬次清香型白酒中挖掘出具有風味功能的119種香氣化合物進行定量分析。包括酯類30種、醇類23種、醛類18種、萜烯類11種、酸類11種、酮類9種、呋喃類6種、酚類5種、內酯類3種、含硫化合物2種及吡嗪類1種。其中含量比較高的骨架成分如乙酸乙酯、乳酸乙酯等采用GC-FID法定量,正己醇、乙酸苯乙酯、苯乙醛等微量成分和β-大馬酮、1-辛烯-3-酮、土味素、β-紫羅蘭酮、4-甲基戊酸乙酯等痕量成分采用GC×GC-TOFMS技術定量。特別是痕量成分,由于其含量極低,使用傳統的氣相色譜-質譜較難檢測到,因此需要采用更高精密度的儀器來檢測,而GC×GC-TOFMS的優勢就在于其分辨率和靈敏度比傳統的氣相色譜-質譜更高。

為了明晰119種香氣化合物在不同茬次清香型白酒中的差異變化,對60個不同茬次清香型白酒中的這119種香氣化合物進行準確定量分析,定量方法學參數見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035355)。定量的香氣物質的標準曲線線性良好,R2均大于0.99,回收率也滿足80%～120%的技術要求。各個物質的含量范圍如附表2所示。定量結果表明,乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛、乳酸乙酯、乙酸、正丙醇、異戊醇、丙酸、活性戊醇等化合物在2個茬次中存在差異,然而這些存在差異的化合物是否對酒樣整體風味有貢獻,不僅取決于化合物的含量,還取決于化合物的閾值。香氣活性值(odor activity value,OAV)表示化合物濃度與閾值的比值[17],它是衡量某種香氣化合物對酒樣整體香氣貢獻度大小的重要指標。一般認為,OAV>1的香氣化合物是對酒樣有明顯香氣貢獻的重要化合物。附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035355)列出了所有定量化合物的OAV,在大茬酒樣或二茬酒樣中共有48個香氣化合物的OAV>1。其中,香氣貢獻度較大(OAV>100)的化合物如β-大馬酮、異戊酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醛、己酸乙酯、乙酸乙酯、土味素、乙醛、二甲基三硫等被確認為清香型白酒的重要香氣化合物[5,18]。肉桂酸乙酯(大茬、二茬OAV分別為43.2～172.7和31.1～126.8)、1-辛烯-3-酮(大茬、二茬OAV分別為26.3～402.2和1.3～217.7)、反,反-2,4-壬二烯醛(大茬、二茬OAV分別為3.3～12.1和3.4～16.8)、2-戊基呋喃(大茬、二茬OAV分別為0.1～7和0.5～4.7)、4-甲基戊酸乙酯(大茬、二茬OAV分別為1.4～1.9和1.3～1.9)和苯甲醛(大茬、二茬OAV分別為0.5～1.3和0.8～1.7)在以往清香型白酒研究中并沒有進行OAV分析,但在本研究中呈現出明顯的香氣貢獻,值得注意的是,2-戊基呋喃的閾值是首次在白酒中進行測定,該化合物存在于眾多食品中,常被用來作為咖啡、面包的調香劑[19]。

對不同茬次清香型白酒樣品中48個香氣活性成分的平均OAV進行比較分析,如圖2所示,發現大茬酒樣中土味素、1-辛烯-3-酮、肉桂酸乙酯、正丙醇、2-甲基丁酸乙酯、異丁醇等化合物的平均OAV高于二茬酒樣;乙縮醛、二甲基三硫、乙醛、異戊酸乙酯、β-大馬酮、γ-壬內酯、二甲基二硫等化合物在大茬酒樣中的平均OAV要低于二茬酒樣;而其他物質在兩類酒樣中的平均OAV差異不大。這些香氣活性組分OAV的不同可能是導致大茬和二茬酒樣之間香氣特征存在差異的原因。

a-OAV>10的香氣化合物;b-1

2.3 不同茬次清香型白酒香氣化合物差異分析

除了比較香氣活性組分的平均OAV值外,還借助多元統計分析手段對所有樣品中定量的化合物含量進行分析挖掘。利用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)對60個樣品中香氣化合物的含量進行解析,如圖3-a所示,PLS-DA模型很好地區分2個茬次樣品,該模型的解釋變異度(R2Y)和預測能力(Q2)分別為0.973和0.902,R2Y和Q2都比較接近1,說明該模型效果較好。此外為了驗證模型的可靠性,采用200次置換檢驗評估該模型是否過擬合[20]。通過置換檢驗圖(圖3-b)可以看到R2=0.585,Q2=-0.367,Q2在Y軸的截距是負值,表明該模型有效可靠。變量權重重要性排序(variable importance for the projection,VIP)表示每個變量對樣品區分的貢獻程度,一般認為VIP>1的變量是解釋樣品差異的潛在標記化合物。如圖3-c所示,導致不同茬次清香型白酒差異的潛在標記化合物有45種。

a-得分圖;b-200次置換檢驗圖;c-VIP預測值分布圖圖3 大茬二茬清香型白酒香氣化合物PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA analysis of aroma compounds in light-flavor Baijiu with Dacha and Ercha

結合OAV分析和VIP分析結果可知,不同茬次酒樣差異貢獻物質主要包括β-大馬酮、異戊酸乙酯、異戊醛、肉桂酸乙酯、土味素、乙醛、二甲基三硫、乙縮醛、乳酸乙酯、異丁酸乙酯、異丁醇、2-甲基丁酸乙酯、正丙醇、二甲基二硫、4-乙基愈創木酚、γ-壬內酯、4-甲基戊酸乙酯、苯甲醛18種香氣組分。對這18種差異貢獻物質的含量進行單因素方差分析,并得到其在2個茬次中的含量規律,如圖4所示,大茬酒樣中β-大馬酮、異戊酸乙酯、異戊醛、乙醛、乙縮醛、二甲基三硫、二甲基二硫、γ-壬內酯和苯甲醛的含量顯著低于二茬酒樣;土味素、乳酸乙酯、肉桂酸乙酯、異丁酸乙酯、異丁醇、2-甲基丁酸乙酯、正丙醇、4-甲基戊酸乙酯和4-乙基愈創木酚的含量則是大茬顯著高于二茬。這進一步說明了2個茬次中香氣貢獻度大且含量具有顯著性差異的化合物與不同茬次清香型白酒香氣特征的差異具有重要聯系。

2.4 感官評價與香氣活性化合物關聯性分析

此外,為了探究香氣活性化合物(X變量,n=48)與香氣屬性(Y變量,n=7)之間的關系,采用偏最小二乘回歸分析(partial least squares regression,PLSR)法建立模型探索兩者之間的關聯,結果如圖5所示。大茬酒樣花香、糧香、甜香、果香更為突出,與辛酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、肉桂酸乙酯、異丁醇、乳酸乙酯等物質呈正相關,這些化合物大多呈現蘋果、甜香;與此同時,一些呈土腥、蘑菇氣味的化合物如土味素、1-辛烯-3-酮也呈正相關,這說明大茬酒樣中除了令人愉悅的果香、甜香等香氣屬性外,同時也存在部分令人不愉快的香氣。而二茬酒樣更多表現為醇香、酸香,和苯甲醛、乙縮醛、γ-壬內酯、乙醛、異戊醛、異戊酸乙酯、二甲基二硫、二甲基三硫等物質有關,其中,乙醛是引起醛異味的主要成分[21],異戊酸乙酯是小曲清香型白酒水嗅味化合物[22],而苯甲醛、乙縮醛、γ-壬內酯帶來令人愉悅的杏仁、奶油、椰子等香氣。

圖4 大茬二茬清香型白酒差異貢獻物質箱線圖Fig.4 Box charts of differential contributors in light-flavor Baijiu with Dacha and Ercha

圖5 大茬二茬清香型白酒香氣活性化合物與感官屬性的PLS分析Fig.5 Projection on the PLS regression between sensory attributes and aroma-active compounds of light-flavor Baijiu with Dacha and Ercha注:X表示香氣活性化合物;Y表示香氣感官屬性。

3 結論

本研究以60個不同茬次清香型原酒為研究對象,首先采用感官分析技術(quantitative descriptive analysis,QDA)分析對酒樣的感官風味特征進行研究,結果表明大茬酒主要表現為果香、甜香、糧香、花香等香氣特征,而二茬酒則主要表現出酸香、醇香等香氣特征。隨后采用GC-FID結合HS-SPME-GC×GC-TOFMS對不同茬次清香型白酒中的香氣組分進行定量分析及OAV計算。通過OAV值比較和PLS-DA分析,確定了2個茬次酒樣中的18個差異貢獻物質。最后通過PLSR將物質與感官相關聯,挖掘出了與大茬酒特定感官特征相關的重要香氣物質主要是辛酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、肉桂酸乙酯、異丁醇、乳酸乙酯、土味素、1-辛烯-3-酮;而與二茬酒特定感官特征相關的重要香氣物質為苯甲醛、乙縮醛、γ-壬內酯、乙醛、異戊醛、異戊酸乙酯、二甲基二硫、二甲基三硫。2個茬次酒樣中的重要香氣化合物既有呈正面風味貢獻的香氣物質也有呈負面風味貢獻的異嗅化合物,由此可見,對于不同茬次的清香型白酒,需要針對各自的風味特性制定不同的品質判斷策略。此外,還可根據不同茬次的風味特點給予工藝的控制提供指導,同時也可為酒體的勾調提供理論基礎。