液相色譜-穩定同位素比值質譜法測定針葉櫻桃粉中抗壞血酸的碳穩定同位素比值

王道兵,馮迪,曹翠峰,鐘其頂,3*,翟鵬貴,武竹英, 岳紅衛,童玲,張燚,洪玉玲,張紅霞,徐勝,張洛琪

1(國家市場監管技術創新中心(輕工消費品質質量安全),北京,100015) 2(中輕技術創新中心有限公司,北京,100015)3(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015) 4(養生堂藥業有限公司,海南 ?？?570216)5(農夫山泉股份有限公司,浙江 杭州,310024)

L-抗壞血酸,又稱維生素C,在水果和蔬菜中含量豐富,是一種重要的水溶性抗氧化劑[1],參與膠原蛋白、細胞間質和神經遞質的合成,有助于改善機體免疫系統功能[2]。由于人體不能合成維生素C,需要依靠膳食水果和蔬菜等攝入每日的必需量。針葉櫻桃被認為是天然維生素C之王,它是一種產于中美洲至南美洲北部的水果,深受消費者青睞,由于其富含抗壞血酸,常被用作天然抗壞血酸的典型來源[3]?？箟难岙a品有著廣闊的市場前景,針葉櫻桃是我國天然維生素C產品的主要原料,由于巨大的市場需求,針葉櫻桃粉主要依靠北美、歐洲和日本等國家進口。近年來在針葉櫻桃粉相關產品中摻入合成抗壞血酸的事件時有發生,盡管添加了工業合成的抗壞血酸,但仍聲稱是天然抗壞血酸,該行為造成消費者利益受損,行業信譽度損失。因此,亟需建立一種高精度快速檢測抗壞血酸產品中外源添加合成抗壞血酸的分析方法。

穩定同位素技術是當前國際食品摻假鑒別領域打擊假冒偽劣產品有效的科技手段之一[4]。該技術具有常規理化方法不可比擬的優越性,已經通過該技術實現對葡萄酒[5-6]、調味品[7-10]、油脂[11-14]、蜂蜜[15-17]等食品的摻假鑒別、質量評價及產地溯源。目前,國內尚無利用穩定同位素技術對抗壞血酸測定的相關研究,國外已陸續有應用元素分析-同位素比值質譜(elemental analysis-stable isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)和氣相色譜-燃燒-穩定同位素比值質譜(gas chromatography-combustion-stable isotope ratio mass spectrometry, GC-C-IRMS)對橘子汁、針葉櫻桃汁中抗壞血酸穩定同位素比值進行測定[18-19]的報道。EA-IRMS適合全樣品檢測,前處理步驟繁瑣復雜;GC-C-IRMS測定抗壞血酸需要衍生化,對操作人員的要求較高。本文首次采用液相色譜-穩定同位素比值質譜法對樣品中抗壞血酸在線分離并準確測定其δ13C值,具有操作簡單、無需衍生化、標準品和樣品遵循同等處理原則(principle of identical treatment, PIT)的優勢。

本研究擬建立利用穩定同位素技術鑒別天然來源和合成來源抗壞血酸的碳穩定同位素特征。建立液相色譜穩定同位素比值質譜(liquid chromatography-stable isotope ratio mass spectrometry, LC-IRMS)準確測定抗壞血酸δ13C值的方法,對方法進行了優化及驗證。探究了天然和合成來源抗壞血酸的碳穩定同位素差異,以實現對天然抗壞血酸產品真實性的準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7個不同品牌的維生素C片,從電商旗艦店購買,研磨后備用;19個不同濃度、不同地區的針葉櫻桃粉從廠家直接購買。L-抗壞血酸標準品,純度≥99.8%,購自上海葉源生物科技有限公司;

IAEA-CH-6蔗糖[δ13CPDB=(-10.449±0.2)‰],奧地利維也納國際原子能機構,作為碳穩定同位素比值分析的參考物質;濃硫酸(優級純)、磷酸(優級純)和過硫酸鈉(Na2S2O8, 純度≥99%),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Flash 2000元素分析儀配有Conflo IV接口、LC端(LC IsoLink+ConFlo IV)、Delta V Advantage穩定同位素質譜儀(isotope ratio mass spectrometry,IRMS),美國Thermo Fisher Scientific公司;十萬分之一天平,瑞士Mettler-Toledo公司;渦旋振蕩器,北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 前處理方法

準確稱取0.500 g樣品加入50 mL超純水渦旋振蕩,過0.45 μm水系濾膜,移取200 μL稀釋至抗壞血酸含量0.10～0.50 g/L后保存試樣,吸取1 mL至棕色進樣小瓶LC-IRMS測定抗壞血酸δ13C值。

1.4 EA-IRMS測定條件

EA-IRMS直接測定抗壞血酸純品的碳穩定同位素比率。EA-IRMS儀器的氧化管溫度為960 ℃,還原管溫度為650 ℃,氣相色譜柱爐溫為50 ℃,氦氣流速為100 mL/min,準確稱取0.2～0.3 mg樣品,每個樣品平行測定2次。進行樣品測試時,每個樣品的分析起始和結尾階段通入CO2參考氣,用于對進樣過程穩定性的評價。

1.5 LC-IRMS測定條件

LC-IRMS測定樣品中抗壞血酸的δ13C值。

色譜條件:色譜柱為Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相為水-pH 2硫酸溶液 (90∶10, 體積比),流速0.250 mL/min;柱溫30 ℃,進樣體積10 μL。磷酸溶液和過二硫酸鈉溶液作為反應助劑,流速0.050 mL/min,反應爐溫度99.5 ℃,將色譜在線分離的有機物轉換成CO2。

質譜條件:離子源為電子轟擊離子源(EI源);掃描方式為正離子掃描;氦氣壓力為0.4 MPa;離子源電壓為9.488 kV;真空度為2.6×10-6mBar。每次測定樣品前后分別測定3次CO2標準參考氣(每次20 s)。

1.6 數據校正與計算

穩定同位素比率的計算是將已知同位素比率的標準品作為參考,計算未知樣本穩定同位素比率的相對值,結果以(千分差,‰)表示,按公式(1)計算:

δ13C=(R樣品/R標準-1)×1 000

(1)

式中:R樣品,樣品中重同位素與輕同位素的豐度比,即13C/12C;R標準,國際標準物質美國南卡羅萊納州白堊系Pee Dee組擬箭石化石(pee dee belemnite,PDB)的碳重同位素與輕同位素的豐度比。本研究選擇IAEA-CH-6[δ13CPDB=(-10.449±0.2)‰]作為實際測定中的參考物質。實驗結果由Isodat 3.0軟件進行數據處理和計算,Excel分析數據,Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

LC-IRMS在線將目標物和其他物質分開,并將目標物中碳元素轉化成CO2測定,要求流動相不含有機溶劑,對流速、柱溫等也有要求,相比常規液相在應用上存在一定局限性。因此,實驗首先建立LC-IRMS測定抗壞血酸δ13C值的液相方法的優化。

2.1.1 流動相選擇

LC-IRMS要求色譜流動相不含甲醇等有機洗脫液,因此實驗選擇純水-pH2硫酸溶液體系探究流動相比例對目標峰的分離度的情況。以抗壞血酸標準品為研究對象,選擇流動相水-pH2硫酸溶液分別以體積比為100、90∶10、80∶20的配制比例測定,出峰情況見圖1。流動相為100%純水時,目標峰的出峰時間相對提前,且抗壞血酸峰較寬,分離度差(圖1-a);改變流動相水-pH2硫酸溶液的體積比至90∶10時,能顯著改善峰形,峰分離度較好(圖1-b);再增加硫酸溶液體積比至80∶20時,出峰時間稍稍延遲,與流動相體積比90∶10相比,峰形無明顯差異(圖1-c)。綜合考慮,選擇流動相水-pH2硫酸溶液體積比為90∶10作為后續實驗的條件。

2.1.2 柱溫及流速選擇

柱溫越高,色譜分離過程會加快,通常效率也會更高,但存在一些樣品混合物共洗脫的可能性[20],且抗壞血酸水溶液存在遇熱易氧化的特性。因此,LC-IRMS測定關鍵組分的在線分離,選擇合適的柱溫度控制是必要的。實驗以抗壞血酸標準品為研究對象,選擇25、30、35、40、45 ℃的梯度溫度,在每個梯度下對標準品重復3次測定,探究柱溫對δ13C值測定的影響。由表1可知,在25～35 ℃,抗壞血酸δ13C值的測定標準偏差≤0.06‰,說明測定結果穩定且不同溫度時的測定結果也無明顯差異,而由于樣品遇熱易氧化特性,在色譜柱溫度較高的情況下,δ13C值測定標準偏差較大。故綜合考慮實驗選取30 ℃作為后續實驗的柱溫條件。

表1 色譜柱溫度對抗壞血酸δ13C值測定的影響Table 1 Effect of column temperature on determination of δ13C value of ascorbic acid

一般流速越高,出峰時間越快,樣品測定時間越短。LC-IRMS由于流動相為水溶液體系,在色譜柱中滯黏度較高,故流速不宜太快。以抗壞血酸標準品為研究對象,研究在0.200～0.450 mL/min流速內δ13C測定值(n=3)的變化特征。由表2可知,隨著流速提高,出峰時間提前,抗壞血酸的δ13C值測定結果較穩定,因此在實際分析中可在0.200～0.450 mL/min范圍內任意設定一個流速參數?？紤]到隨著流速增加,色譜柱柱壓逐漸增高,為了延長色譜柱的壽命及分析效率,本方法選擇0.250 mL/min作為流動相流速。

綜上,LC-IRMS測定抗壞血酸的δ13C值的分析條件為:Syncronis C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱,流動相為水-pH2硫酸溶液(90∶10, 體積比),色譜柱溫度30 ℃,流速0.250 mL/min,進樣量10 μL,抗壞血酸在980 s左右出峰。選擇一款針葉櫻桃粉樣品按照1.3節前處理條件水解后,1.4節方法進行測定,測定結果見圖1-d,抗壞血酸目標峰與其他峰可以完全分離準確測定。

表2 流速對抗壞血酸δ13C值測定的影響Table 2 Effect of flow rate on determination of δ13C value of ascorbic acid

a-流動相為100% H2O的標準品色譜圖; b-流動相為90% H2O和10% PH2 H2SO4溶液的標準品色譜圖; c-流動相為80% H2O和20%PH2 H2SO4的標準品色譜圖; d-色譜條件優化后對針葉櫻桃粉樣品測定的色譜圖圖1 不同條件下抗壞血酸色譜圖Fig.1 The peak chromatogram of ascorbic acid under different conditions

2.2 方法準確性驗證

由于缺少抗壞血酸碳穩定同位素的參考物質,因而不能直接測量參考物質的形式對LC-IRMS測定抗壞血酸δ13C值的準確性進行驗證。為了探究建立的LC-IRMS測定抗壞血酸δ13C值過程是否發生同位素分餾,選擇抗壞血酸標準品為研究對象,分別使用本章建立的LC-IRMS測定方法和文獻中報道的EA-IRMS方法進行處理后測定(n=5),測定結果見表3。由表3可知,采用本方法測定的抗壞血酸δ13C值與EA-IRMS測定方法相比,測定結果的差值均小于0.25%,說明LC-IRMS方法測定抗壞血酸δ13C值準確有效,液相色譜在線分離提取抗壞血酸與參考物質時遵循同等轉化原則。

表3 LC-IRMS和EA-IRMS測定抗壞血酸δ13C值的比較 單位:‰

2.3 方法精密度驗證

以抗壞血酸標準品和針葉櫻桃粉為研究對象,按照1.3節步驟前處理后在重復條件下分別測定δ13C值,連續測定6次,在再現性條件下,5 d內對標準品和樣品完成6次獨立測定,結果見表4?？梢姕y定抗壞血酸δ13C的標準偏差為0.06‰～0.15‰,說明該方法滿足抗壞血酸δ13C檢測要求。

表4 LC-IRMS測定抗壞血酸δ13C的重復性和再現性(n=6) 單位:‰

2.4 不同來源抗壞血酸碳穩定同位素比值測定

從市面上隨機購買了不同產地的合成維生素C片和針葉櫻桃粉共26個產品,用LC-IRMS測定并分析不同來源抗壞血酸同位素特征,測定結果見表5。不同產地的合成來源維生素C片δ13C值為-11.74‰～-10.28‰,而天然針葉櫻桃粉中抗壞血酸δ13C值為-25.00‰～-22.01‰,兩者具有顯著的碳同位素分布特征(圖2)。本方法檢測天然和合成來源抗壞血酸的δ13C值數據與文獻報道數據一致[19]。

從現有數據來看,產地對合成來源維生素C的δ13C值分布無影響,且維生素C的生產過程使用了C4植物糖作為起始材料。合成維生素C的方式主要有化學合成法和發酵法,市售的抗壞血酸大多為發酵法生產,該法具有經濟、安全、可大規模生產等優勢。發酵法主要以D-葡萄糖、山梨糖等為原料,并加入假單胞桿菌等進行發酵,發酵完成后,進行提取和精制等步驟以獲得精品維生素C。因此,可根據天然來源的抗壞血酸δ13C值分布規律鑒別產品中的抗壞血酸是否存在外源添加的現象。

表5 不同來源樣品中抗壞血酸的δ13C值Table 5 δ13C values of ascorbic acid in samples from different sources

圖2 天然和合成來源抗壞血酸δ13C值分布圖Fig.2 Distribution of δ13C value of ascorbic acid from natural and synthetic sources

3 結論與討論

本研究基于穩定同位素技術在食品摻假鑒別領域的廣泛應用基礎,建立了LC-IRMS測定針葉櫻桃粉中抗壞血酸的δ13C值的方法,標準品和樣品遵循同等處理原則,在發生同位素分餾的情況下仍能對碳穩定同位素比值準確測定。該方法具有前處理方法簡單、測定時間短等優點,方法的精密度和準確性較好。在實際樣品分析中,實現了天然和合成來源抗壞血酸的有效分離測定,豐富了抗壞血酸相關產品的檢測和鑒別技術,有助于保障消費者利益,維護相關產品的市場公平競爭。