鮮食、釀酒、觀賞類葡萄果實揮發性風味物質解析

呂茜,孫曉涵,汪佳琪,馮延濤,張繼豐,馬雯,4,5*

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021) 3(寧夏西鴿葡萄種植有限公司,寧夏 青銅峽,750002)4(寧夏葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,寧夏 銀川,750021) 5(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae),葡萄屬(Vitis),葡萄屬植物按照系統分類學可以分為真葡萄亞屬(Subgen.EuvitisPlanch)和圓葉葡萄亞屬(Subgen.MuscadiniaPlanch)。真葡萄亞屬有70多個種,按照地理起源形成了3個種群,既歐亞、北美和東亞三大種群。按照葡萄用途不同,又可以分為鮮食品種、加工品種和砧木品種等[1-2]。紅地球和蛇龍珠均屬歐亞種且紅地球歸為鮮食葡萄類[3]、蛇龍珠歸為釀酒葡萄類[4]。嘉寶果[Pliniacauliflora(Mart.) Kausel],又名樹葡萄,為桃金娘科(Myrtaceae)擬愛神木屬(Myrciaria)熱帶亞熱帶常綠小喬木或大型灌木[5],其原產于巴西,味道甜美宜人,略帶酸味[6]。由于在本土引進早期主要作為一種觀賞類植物,所以在本研究將其歸為觀賞類葡萄。

香氣作為反映葡萄風味品質的重要指標,是大量揮發性化合物的復雜混合物,其成分因葡萄品種而異[7-9],且葡萄漿果中的芳香成分決定葡萄制品的典型風味特征[10]。葡萄中的揮發性化合物由游離態和結合態組成,游離態揮發物是可直接從葡萄果實聞到的一類香氣物質,為葡萄貢獻主要的品種香氣[11],因其本身就具有揮發性,所以通過葡萄汁就可檢測到[12]。結合揮發物基本上作為無味前體存在于葡萄中[13],這些與糖苷結合的揮發物可以在葡萄加工及在人口腔中酶的作用下進一步水解,釋放出它們的苷元,這些釋放的苷元可以影響葡萄及葡萄加工產品的整體香氣[11],其水解可以通過酸、熱、酶促和超聲波等方法實現[14-17]。結合態揮發物也在許多葡萄品種中被確定為葡萄香氣的前體,負責葡萄及葡萄加工制品的某些特定品種香氣屬性[18-21]。紅地球、蛇龍珠作為重要的鮮食、釀酒葡萄品種其揮發性物質已被廣泛研究,而樹葡萄由于含有豐富的多酚類物質、具有營養健康方面的益處和用于開發衍生食品的潛在用途,近年來被廣泛研究,但研究主要集中于非揮發性物質,而鮮有對其揮發性物質的研究[22-23]。

本研究采用固相萃取(solid phase extraction,SPE)技術及酶解法對葡萄的芳香糖苷進行提取及水解,并采用頂空固相微萃取-氣相色譜聯用三重四級桿質譜(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-QQQ)技術對3種葡萄果實中的游離及糖苷結合態揮發性化合物進行檢測及半定量,其中用總離子流掃描(SCAN)模式對葡萄醇類、酯類、羰基類、酸類、萜烯類等揮發性物質進行檢測,同時用選擇離子監測(selected ion monitor,SIM)模式對與葡萄中綠色香氣相關的C6醇/醛類物質及與含量低于SCAN模式檢測限的甲氧基吡嗪類(methoxypyrazines,MPs)物質進行單獨檢測。旨在明晰3種葡萄的游離態及結合態揮發性物質的成分構成,為葡萄產品的鮮食與加工的香氣品質識別與調控提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅地球’采摘于寧夏賀蘭山東麓永寧產區,‘蛇龍珠’采摘于寧夏賀蘭山東麓青銅峽產區,‘樹葡萄’采摘于福建莆田產區;三者均為2019年采摘的成熟期果實。樣品采摘后置于裝有冰袋的泡沫箱中運輸至實驗室,然后放置于-20 ℃冰箱冷凍備用。

氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖,國藥集團化學試劑有限公司;色譜級無水乙醇、交聯聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP)、葡萄糖酸內酯、氟化鈉,上海阿拉丁試劑有限公司;Cleanert PEP-SPE樹脂柱(200 mg/6 mL),天津飛諾美公司;HPLC級甲醇,美國Thermo Fisher公司;色譜級二氯甲烷,山東禹王試劑公司;AR 2000葡萄糖苷酶,美國Creative Enzymes公司;4-甲基-2-戊醇(色譜純),純度≥98%,日本TCI公司;C8～C20正構烷烴、3-異丁基-2-甲氧基吡嗪(3-isobutyl-2-methoxypyrazine, IBMP)、3-異丙基-2-甲氧基吡嗪(3-isopropyl-2-methoxypyrazine, IPMP)和3-仲丁基-2-甲氧基吡嗪(3-sec-butyl-2-methoxypyrazine, SBMP),純度≥99%,美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設備

ME104E型萬分之一精度電子天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;SZ-1型快速混勻器,常州圓儀儀器公司;萬能高速粉碎機,浙江紅景天有限公司;PHS-3C型pH計,上海雷磁公司;7890B-7000D氣相色譜質譜聯用儀,美國Agilent公司;Visiprep DL SPE真空固相萃取裝置,美國Supelco公司;低溫超速離心機,德國Eppendorf公司;旋轉蒸發儀,美國Lab Tech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄果實基本理化指標檢測

葡萄果實基本理化指標檢測方法參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定,總糖:直接滴定法;pH值:pH計測定法;總酸:酸堿滴定法。百粒重則采用直接稱量法。上述所有檢測均重復3次。

1.3.2 果實游離態揮發性化合物的提取及分析

游離態全種類揮發性化合物提取:隨機選取100粒葡萄果實,液氮速凍后打碎成粉末,然后準確稱取15 g葡萄果粉置于50 mL離心管中,加入0.15 g PVPP和0.1 g葡萄糖酸內酯,待果粉微融后快速混勻樣品,后放置于4 ℃冰箱中靜置4 h,以凝集蛋白及沉淀單寧等大分子非揮發性化合物。靜置后將樣品于4 ℃下以8 000 r/min的速率離心10 min后取上清液即得澄清葡萄汁[24]。

游離態C6醇/醛類化合物提取:同游離態全種類揮發性化合物提取。

游離態MPs提取:隨機選取50粒除梗的葡萄果實,液氮速凍后打碎成粉末,稱10 g葡萄果粉于50 mL離心管中,然后加入5 mL的NaF溶液(80 mg/L),快速混勻樣品后在4 ℃下靜置30 min以提取果實中的MPs。靜置后的樣品在4 ℃下以8 000 r/min的速度離心10 min取上清液[25]。

游離態各類揮發性化合物檢測:取5 mL澄清葡萄汁、1.5 g NaCl、10 μL(1.008 3 g/L)內標加入到20 mL頂空瓶中,之后擰緊瓶蓋,每個樣品做2個重復。將頂空瓶置于自動進樣器中,首先在250 ℃下對萃取頭老化10 min,樣品在50 ℃ 400 r/min下穩定5 min,隨后將萃取頭插入到頂空瓶進行吸附,在50 ℃ 400 r/min下吸附30 min,然后將萃取頭插入到進樣口中,在240 ℃下脫附10 min,進樣模式為不分流進樣。加熱柱箱的起始溫度為50 ℃,保持1 min,之后以3 ℃/min的速率升溫至220 ℃并保持5 min,流路載氣為純度≥99.999%的高純氦氣,流速1 mL/min,傳輸線溫度為250 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電子能量70 eV,采用SCAN模式進行檢測,離子質量掃描范圍m/z為35～300[26]。

游離態C6醇/醛類化合物檢測:取5 mL澄清葡萄汁、1.5 g NaCl、10 μL(1.008 3 g/L)內標加入到20 mL頂空瓶中,之后擰緊瓶蓋。樣品置于自動進樣器后的處理過程同游離態各類揮發性化合物檢測。柱箱溫度條件如下:初始溫度為50 ℃保持1 min,之后以20 ℃/min的速率升溫至110 ℃,緊接著以1 ℃/min的速率升溫至135 ℃,最后以20 ℃/min的速率升溫至220 ℃后結束。流路載氣為純度≥99.999%的高純氦氣,傳輸線溫度為250 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電子能量70 eV,采用SIM模式進行檢測,正己醛的定量特征離子m/z為56,定性特征離子m/z為44和41;E-2-己烯醛的定量特征離子m/z為83,定性特征離子m/z為55和41;正己醇的定量特征離子m/z為56,定性特征離子m/z為55和43;E-3-己烯醇和Z-3-己烯醇的定量特征離子m/z為67,定性特征離子m/z為82和41;E-2-己烯醇和Z-2-己烯醇的定量特征離子m/z為57,定性特征離子m/z為67和41。

游離態MPs檢測:取5 mL上清液、1.5 g NaCl、10 μL(1.008 3 g/L)內標加入到20 mL頂空瓶中,旋緊瓶蓋,每個樣品做2個重復。樣品置于自動進樣器后的處理過程同游離態各類揮發性化合物檢測。柱箱溫度條件如下:初始溫度為50 ℃保持1 min,之后以20 ℃/min的速率升溫至110 ℃,緊接著以2 ℃/min的速率升溫至160 ℃,最后以20 ℃/min的速率升溫至220 ℃后結束。流路載氣為純度≥99.999%的高純氦氣,傳輸線溫度為250 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電子能量70eV,采用SIM模式進行檢測,IPMP定量特征離子m/z為137,定性特征離子m/z為152和124;SBMP定量特征離子m/z為138,定性特征離子m/z為124和151;IBMP定量特征離子m/z為124,定性特征離子m/z為151和94。

檢測結果使用NIST 17標準質譜庫對物質進行定性分析,依據色譜保留時間和質譜信息在NIST 17標準譜庫中檢索,同時計算RI值(retention index,RI)[27]。并對3種葡萄揮發物采用內標半定量法來對比物質相對含量的差異。

1.3.3 果實結合態揮發性化合物的提取及分析

結合態全種類揮發性化合物提取:澄清葡萄汁的獲取同1.3.2節。首先依次使用10 mL甲醇、10 mL水活化固相萃取柱;之后將5 mL澄清葡萄汁緩慢通過固相萃取柱進行吸附分離,然后使用5 mL的超純水通過萃取柱,以除去吸附的糖、酸和大多數其他極性化合物,接下來使用5 mL的二氯甲烷通過萃取柱,來除去吸附的游離態揮發物,最后使用10 mL甲醇洗脫,將結合態香氣的糖苷結合前體洗脫下來并收集。收集的甲醇洗脫液使用旋轉蒸發儀旋干,然后重新溶解于10 mL的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中(0.2 mol/L,pH=5),收集緩沖液,之后向緩沖液中加入100 μL的AR 2000糖苷酶溶液(100 g/L),搖勻后放置于40 ℃ 的培養箱中培養16 h進行酶促水解,每組樣品做2個重復[28]。

結合態C6醇/醛類化合物提取:同結合態全種類揮發性化合物提取。

結合態全種類揮發性化合物檢測:取5 mL酶促水解結合態揮發物緩沖液、1.5 g NaCl、10 μL(1.008 3 g/L)內標加入到20 mL頂空瓶中,之后擰緊瓶蓋。后續檢測程序同1.3.2節游離態各類揮發性化合物檢測。

結合態C6醇/醛類化合物檢測:取5 mL酶促水解結合態揮發物緩沖液、1.5 g NaCl、10 μL(1.008 3 g/L)內標加入到20 mL頂空瓶中,之后擰緊瓶蓋。后續檢測程序同1.3.2節游離C6醇/醛類化合物檢測。

1.4 數據處理

所有統計分析均由R 4.2.1軟件進行。采用單向方差分析(ANOVA)評估不同葡萄品種理化參數間的顯著差異(P<0.05),采用最小顯著差異(least significant difference,LSD)事后檢驗。通過R中的“pheatmap”包進行聚類分析,探索游離和結合揮發性化合物的差異。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄果實基本理化指標檢測結果分析

pH值、還原糖、滴定酸及百粒重是評估葡萄成熟度的重要指標。如圖1所示,由4種理化指標可知紅地球、樹葡萄、蛇龍珠均已成熟[3,5,25]。且由圖1-A可知,紅地球百粒重最大,樹葡萄次之,蛇龍珠最低;由圖1-B可知,3種葡萄中,蛇龍珠的pH值最大,樹葡萄最小,紅地球居中;由圖1-C和圖1-D可知,蛇龍珠還原糖含量最高,滴定酸含量居中;樹葡萄還原糖含量最低,滴定酸含量最高;紅地球還原糖含量居中,滴定酸含量最低;3種葡萄的4個理化指標間均具有顯著性差異;如圖1-E所示,3種葡萄還原糖/滴定酸也存在顯著性差異,樹葡萄的糖酸比遠遠低于紅地球和蛇龍珠,可能存在由于口感過酸而不被多數喜愛偏甜鮮食葡萄的中國消費者廣泛接受問題[29],且由于低的糖酸比其在釀酒用途上也存在局限性。但樹葡萄被證明具有很高的營養保健功效[22],所以若能在栽培過程中改善樹葡萄高酸低糖的問題,可既保留其營養價值又豐富用途。

A-百粒重;B-pH值;C-還原糖;D-滴定酸;E-還原糖/滴定酸圖1 葡萄果實的基本理化指標Fig.1 The basic physical and chemical indicators of grape fruit注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 葡萄果實游離及結合態C6揮發性化合物含量

C6醇/醛根據其氣味描述被命名為綠葉揮發物(green leaf les,GLVs)[30],是葡萄綠色香氣的主要來源,這類物質能對葡萄及加工制品的品質產生重要影響[31]。本研究選擇葡萄及加工產品中常見的7種C6醇/醛類物質進行了SIM模式檢測。表1結果表明,紅地球中游離態C6醇/醛類物質總含量最高,樹葡萄最低,三者含量之間具有顯著性差異;而結合態C6醇/醛類物質則是蛇龍珠最高,紅地球最低;且紅地球中的游離態及蛇龍珠中的結合態C6醇/醛類物質均以C6醛為主,而有研究表明C6醛相對于C6醇具有更低的感官閾值,更易對葡萄香氣產生影響[32],所以紅地球作為鮮食葡萄能以其清新的綠色植物香氣吸引消費者,而蛇龍珠作為釀酒葡萄,其較高濃度的結合態C6醛可在發酵及陳釀過程被釋放出來進而影響葡萄酒香氣。紅地球的游離態C6醇以正己醇和E-2-己烯醇為主,二者含量顯著高于蛇龍珠和樹葡萄;蛇龍珠的游離態C6醇中Z-3-己烯醇含量最高,樹葡萄的游離態C6醇中E-2-已烯醇含量最高。蛇龍珠的結合態C6醇中正己醇含量最高,樹葡萄的C6醇中Z-3-己烯醇含量最高,紅地球中結合態C6醇/醛類物質含量均最低。

表1 葡萄果實游離、結合態C6醇/醛類揮發性化合物含量Table 1 Contents of free and bound C6 alcohol/aldehyde volatile compounds in grape fruits

2.3 葡萄果實游離態MPs揮發性化合物含量

MPs是一類在葡萄中被廣泛的研究的物質,因為它們所帶來的草本和植物類感官特征會對葡萄及加工制品的香氣和風味產生或利或弊的影響[33]。如葡萄酒中的MPs有時被認為是品種香氣,但過高含量的MPs可能會產生不可接受的綠色和未成熟的香氣,對葡萄酒質量產生負面影響[34-35]。因目前未有研究表明存在結合態MPs,所以本研究對3種葡萄中常見的游離態MPs類物質的檢測結果如表2所示,樹葡萄中MPs含量最高,紅地球最低;且樹葡萄中有最高含量的IPMP,IPMP能給葡萄帶來土豆、蘆筍的香氣;蛇龍珠中有最高含量的IBMP,且IBMP僅在蛇龍珠中存在,而IBMP能給葡萄增加青椒、草本的香氣;SBMP則在3種葡萄中含量均最低,對葡萄香氣產生的影響較小。

2.4 葡萄果實游離及結合態揮發性化合物特征分析

為探究以紅地球、蛇龍珠、樹葡萄為材料的鮮食、釀酒、觀賞類葡萄的風味物質特征,本研究利用HS-SPME-GC-QQQ技術對不同葡萄果實游離及結合態揮發性化合物進行檢測,本實驗共測得游離態揮發性化合物共74種,其中紅地球26種,蛇龍珠32種,樹葡萄55種(表3);共測得結合態揮發性化合物共40種,其中紅地球17種,蛇龍珠23種,樹葡萄28種(表4)。為解析三類葡萄的風味物質特征,對3種葡萄的游離及結合態揮發性化合物進行聚類分析并作出熱圖。

表2 葡萄果實游離態MPs揮發性化合物含量Table 2 Contents of free MPs volatile compounds in grape fruit

表3 葡萄果實游離態揮發性化合物相對含量Table 3 Relative content of free volatile compounds in grape fruit

續表3

表4 葡萄果實結合態揮發性化合物相對含量Table 4 Relative contents of bound volatile compounds in grape fruit

圖2 不同葡萄果實游離態揮發性化合物聚類熱圖Fig.2 Clustering heatmap of free volatile compounds in different grape fruit

由圖2可知,3種葡萄的游離態揮發性風味物質特征區分明顯。對紅地球葡萄整體香氣有貢獻的物質包括:E-2-己烯醇、E-3-己烯醇、正己醇、E-2-己烯醛、己醛5種C6醇/醛類,甲基庚烯酮、對苯二甲醛、反,順-2,6-壬二烯醛、苯乙酮、癸醛5種羰基類化合物,大馬士酮、香葉基丙酮2種萜烯類,乙酸松油酯、甲酸辛酯2種酯類,鄰傘花烴、萘2種芳香族化合物及異辛醇1種高級醇類,共17種物質;對蛇龍珠葡萄整體香氣有貢獻的物質包括:反式-卡拉曼烯、α-松油醇2種萜烯類,癸酸乙酯、己酸乙酯2種酯類,Z-3-己烯醇、Z-2-己烯醇2種C6醇/醛類,苯甲醛、苯乙醛2種羰基類,異戊醇、苯甲醇2種高級醇類,己酸1種酸類及IBMP 1種MPs,共12種物質;對紅地球葡萄整體香氣有貢獻的物質包括:D-檸檬烯、別羅勒烯、1,8-桉葉素等22種萜烯類,苯甲酸乙酯、苯甲酸甲酯、山梨酸乙酯等15種酯類,IPMP和SBMP 2種MPs,4-異丙基甲苯、乙苯、苯乙烯3種芳香族化合物,醋酸、3-環己烯-1-甲酸2種酸類及苯乙醇1種高級醇,共45種物質。

由圖3可知,3種葡萄的結合態揮發性風味物質特征也具有很高的區分度,紅地球葡萄中貢獻結合態香氣的物質包括:橙花醇、橙花丙酮2種萜烯類,2-辛酮、苯甲醛2種羰基類化合物,共4種物質;蛇龍珠葡萄中貢獻結合態香氣的物質包括:正己醇、己醛、Z-2-己烯醇、E-2-己烯醛4種C6醇/醛類,異戊醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-庚醇、苯甲醇、異辛醇6種高級醇類,甲酸辛酯、棕櫚酸乙酯、水楊酸甲酯、甲酸庚酯4種酯類,共14種物質;樹葡萄中貢獻結合態香氣的物質包括:芳樟醇、D-檸檬烯、桃金娘烯醇等11種萜烯類,苯乙醛、1-壬醛、2-乙酮、甲基異丁基甲酮4種羰基類,E-3-己烯醇、Z-3-己烯醇、E-2-己烯醇3種C6醇/醛類,乙酸乙烯酯1種酯類,苯乙醇1種高級醇類,醋酸1種酸類及對傘花烴1種芳香族化合物,共22種物質。

圖3 不同葡萄果實結合態揮發性化合物聚類熱圖Fig.3 Clustering heatmap of bound volatile compounds in different grape fruit

相比蛇龍珠與樹葡萄,紅地球揮發性風味物質種類較少,其游離態香氣以C6醇/醛貢獻的綠色植物及基羰基類化合物貢獻的柑橘、甜瓜、山楂、紫羅蘭、合歡花等花果香為主。蛇龍珠的結合態揮發物種類比游離態更豐富,使其能葡萄酒發酵及陳釀過程能釋放更多的香氣,提高葡萄酒香氣的復雜度,這與前人研究[11]相似;且其結合態C6醇醛及高級醇類物質種類較多,可為葡萄酒中主要產生果香的酯類物質的合成提供反應底物。樹葡萄的揮發性風味物質最豐富且總含量最高,能給葡萄貢獻復雜、濃郁的香氣,其游離及結合態香氣都主要由萜烯類化合物貢獻,但相比于蛇龍珠與紅地球中的α-松油醇、香葉基丙酮、大馬士酮等能給葡萄帶來花香、甜香等香氣的萜烯類化合物,樹葡萄中所含有的萜烯主要為雪松醇、1,8-桉葉素、別羅勒烯、D-檸檬烯等貢獻植物、草本及等香氣的物質,且此類萜烯中有多種物質具有抗炎抑菌和保健功效[36-39],所以樹葡萄的揮發性物質也參與其營養保健的作用。

3 結論

紅地球、蛇龍珠、樹葡萄的百粒重、pH值、還原糖、滴定酸4種理化之間指標均具有顯著性差異,三者相比,紅地球果粒大、酸度低、含糖量較低;蛇龍珠果粒小、酸度較低、含糖量高;樹葡萄果粒中等、酸度高、含糖量低。其理化指標與三類葡萄各自的主要用途有一定的相關性。

紅地球葡萄果實經定性分析共檢測到26種游離態揮發物、17種結合態揮發物;蛇龍珠中共檢測到32種游離態揮發物、23種結合態揮發物;樹葡萄中共檢測到55種游離態揮發性物、28種結合態揮發物。3種葡萄果實的游離及結合態揮發物經聚類分析可看出,三者在香氣特征上是可以被完全區分的。紅地球果實游離態揮發物總含量主要由C6醇/醛類、高級醇、萜烯類、羰基類及酸類化合物構成;結合態揮發物種類較少且微量,對整體香氣的影響較小。蛇龍珠果實游離態揮發物總含量主要由C6醇/醛類、高級醇類及酯類化合物構成,且其含有較高含量的極低閾值化合物IBMP,此化合物對葡萄香氣影響較大;結合態揮發物含量主要由C6醇/醛類及高級醇類化合物構成。樹葡萄游離態揮發物含量主要由酯類、萜烯類、酸類、芳香族、C6醇/醛類化合物及構成,且其含有較高含量的低閾值化合物IPMP;結合態揮發物含量主要由萜烯類及C6醇/醛類化合物構成。