代謝工程產2′-巖藻糖基乳糖的研究

涂班策,黃廣文,黃明珠,2,劉斌,陳雪嵐,2*

1(江西師范大學 生命科學學院, 國家淡水魚加工技術研發專業中心,江西 南昌, 330027) 2(江西師范大學 健康學院,江西 南昌, 330027)

對于剛出生的嬰幼兒來說,母乳是一種重要的營養資源。它不僅給新生兒提供生長所需的營養物質,而且對新生兒腸道微生物和免疫系統的發育有著重要影響。人乳低聚糖(human milk oligosaccharide,HMOs)作為人乳中最關鍵的碳水化合物,在其中發揮著重要的作用。迄今,已發現超200種HMOs,其中2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)是母乳中含量最豐富的人乳低聚糖,約占其總含量的30%[1],在人母乳中的含量達到2 g/L[2],其結構如圖1所示[3]。研究表明,2′-FL可以在嬰兒腸道上皮細胞上形成一種糖脂類似物,競爭性地和病原菌結合,從而抑制病原菌對嬰兒機體的侵染[4-5],如2′-FL能降低導致嬰兒腹瀉的主要原因之一的空腸彎曲桿菌對腸上皮細胞的侵染,效率達到80%。2′-FL的發酵產物,包括乳酸和一些短鏈脂肪酸,可以調節腸道pH值,從而提高乳酸菌和雙歧桿菌在腸道的定殖能力,并協同發揮抗炎作用[6];此外2′-FL對腸道細胞和呼吸道上皮細胞的黏附有明顯的抑制作用[7],且發現嬰兒感染人體免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的存活率與母乳中2′-FL的含量有關。因此,美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全局先后批準其成為嬰幼兒配方食品及兒童和成人健康食品中的有益制劑[8]。

鑒于此,2′-FL作為營養健康與藥用的功能性食品成分受到了極大的關注,越來越多的科研人員投入到對2′-FL生產研究中。本文對2′-FL的合成方法、生物合成途徑及構建高產工程菌的策略等進行了綜述,以期為相關研究者提供參考。

圖1 2′-FL結構示意圖[3]Fig.1 Structural of 2′-FL[3]

1 2′-FL的合成

1.1 2′-FL的合成方法

目前合成2′-FL的方法有4種,包括直接提純法、化學合成法、酶促合成法及微生物合成法[9],這幾種方法的優缺點具體見表1。從表1中比較可看到,目前已知最高效環保的方法就是微生物生產2′-FL,而且微生物合成的2′-FL與天然的2′-FL功能相同,臨床試驗也不會引起不良反應。此外微生物合成法與上述其他3種方法相比,生產2′-FL 的方法更加方便快捷,合成過程不會添加有毒試劑,大大提高了產物的安全性,且成本低廉,合成底物可以是葡萄糖和甘油等。因此微生物合成法生產2′-FL成為研究熱點。

表1 2′-FL的合成方法Table 1 Synthesis methods of 2′-FL

1.2 2′-FL的生物合成途徑

2′-FL的微生物合成是在α-1,2-巖藻糖及轉移酶的作用下,將巖藻糖殘基從GDP-巖藻糖轉移到乳糖上,因此GDP-巖藻糖是合成2′-FL的重要前體物質。在微生物內合成2′-FL有2條代謝途徑,分別是從頭合成途徑(denovo)和補救途徑(salvage)[17]。合成途徑如圖2所示。

GDP-巖藻糖的從頭合成途徑始于果糖-6-磷酸,然后經過甘露糖-6-磷酸異構酶(ManA)、磷酸甘露糖變位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶(ManC)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶(Gmd)和GDP-L-巖藻糖合成酶(WcaG)等一系列酶的催化反應。合成的GDP-巖藻糖在1,2-巖藻糖基轉移酶(FT)的作用下使GDP-巖藻糖轉化成最終產物2′-FL[18]。

圖2 2′-FL的合成途徑Fig.2 Metabolic pathway for 2′-FL biosynthesis

而補救合成途徑則是通過外源添加GDP-巖藻糖,然后經過雙功能酶[19](Fkp)-巖藻糖激酶和GDP-巖藻糖焦磷酸化酶的作用形成前體物質GDP-巖藻糖,再經過1,2-巖藻糖基轉移酶催化合成2′-FL。補救合成途徑只需要經過2個酶的作用即可形成最終產物,比從頭合成途徑方便快捷。但前體物質GDP-巖藻糖的價格極高,造成成本很高。因此大部分研究都是通過從頭合成途徑來產生2′-FL[20]。

2 從頭合成途徑提高2′-FL產量的策略

2.1 GDP-巖藻糖的積累

GDP-巖藻糖是2′-FL合成的關鍵前體,因此提高GDP-巖藻糖的在胞內的積累能有效提高2′-FL的產量。

大腸桿菌作為最簡單的模式生物之一,且其自身能內源性合成GDP-巖藻糖,使大腸桿菌成為2′-FL合成研究里最常用的宿主[21-22]。在大腸桿菌中,RcsA是大腸桿菌可拉酸合成的正向轉錄因子,GDP-巖藻糖合成途徑上的基因,包括manB、manC和gmd、wacG都受到rcsA基因的正向調控,因此,rcsA的過表達能上調合成GDP-巖藻糖的基因。但是RcsA會被溫度敏感的ATP依賴性蛋白Lon迅速降解,因此在大腸桿菌中敲除lon基因能提高胞內GDP-巖藻糖的積累[23-24]。對于不能內源性合成GDP-巖藻糖宿主,如谷氨酸棒桿菌[25]、枯草芽孢桿菌[26-27]和釀酒酵母菌[28]等。則需要引入外源基因,構建一條合成GDP-巖藻糖的通路。在報道的通過從頭合成途徑生產GDP-巖藻糖的策略中,共同過表達4個基因,包括manB、manC和gmd、wacG,有利于前體物質GDP-巖藻糖的積累。LI等[29]利用不同拷貝的質粒過表達manB、manC和gmd、wacG4個基因,發現高拷貝質粒中的manB和wacG的轉錄水平比低拷貝高出11.8和12倍,細胞內GDP-巖藻糖的量相比也有明顯提高,最終2′-FL的產量提高到1.45 g/L,提高了70.6%。表明提高這些基因的表達量能有效促進細胞內前體物質GDP-巖藻糖的積累,前體物質積累量提高,2′-FL產量也會隨之提高。LI等[30]也通過對加強上述4個基因的表達水平提高了GDP-巖藻糖的產量,使之從0.2 mg/L達到了11.2 mg/L。因此,提高GDP-巖藻糖是促進2′-FL產量的一個重要策略。

2.2 競爭模塊的調控

為了最大化使代謝物流向目標途徑而不被其他路徑分流,很多研究者都著手調控競爭路徑的基因[31]。如在大腸桿菌中GDP-巖藻糖會在wacJ表達的UDP-葡萄糖脂質載體轉移酶的作用下生成與細胞壁合成有關的可拉酸,因此wacJ基因的失活明顯提高了2′-FL的產量[30]。2′-FL另一個前體物質為乳糖,有效地利用乳糖亦是生產2′-FL的重要因素之一。在生命體內,乳糖會被β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖,因此敲除胞內編碼β-半乳糖苷酶的基因能有效減少乳糖的消耗。

除了上述描繪的直接影響前體物質的競爭途徑,糖酵解和PPP途徑某種意義上來說也是影響產物的競爭模塊。細胞需要生長,代謝流需要流向糖酵解、PPP等途徑;細胞需要生產,代謝流則需要流向生產代謝途徑。但是細胞的生產離不開細胞的生長,細胞足夠的生長量是生產的前提。而單獨的刪除或弱化糖酵解途徑基因會極大地影響細胞的生長,因此平衡細胞的生長和終產物的積累,即實現動態調控策略成為科研工作者的思考[32]。如WU等[31]利用一個雙功能的溫度傳感器,通過控制不同的溫度來調控不同基因的表達量。在細胞前期生長階段時,提高糖酵解和PPP途徑的表達量而抑制生產途徑基因的表達;在細胞生長到平穩期時則抑制生長途徑相關的基因而提高生產途徑基因的表達[33],作者通過對細胞生長的不同時期動態調控不同模塊基因的表達,經過18 h搖瓶發酵,使2′-FL的產量從356.5 mg/L顯著增加到了1 399.5 mg/L,極大的提高了2′-FL產量。因此,合理地通過動態調控生長和生產的平衡是提高2′-FL生產的一個有效策略。

2.3 α-1,2-FT的高效表達

無論是從頭合成途徑或補救途徑,都需要在合成途徑的關鍵限速酶α-1,2-巖藻糖基轉移酶(α-1,2-FT)的作用下使前體物質最終變成2′-FL。然而,微生物來源的α-1,2-FT活性是一般代謝酶的1%,且該酶的水溶性較差,因此在合成2′-FL的過程中,篩選出高活性的α-1,2-FT及提高該酶的溶解性是積累2′-FL的重要手段。HUANG等[23]挑選了10個來源不同物種的α-1,2-FT進行實驗,發現在這10個巖藻糖基轉移酶中來自幽門螺旋桿菌的α-1,2-FT效果最好。并且在目前研究中該酶也是使用最多的酶。但是,該酶的溶解性依舊處于一個非常低的水平,因此研究者們還采用各種手段來設法提高α-1,2-FT的溶解性。

早在大腸桿菌中已經證實表達標簽的使用能提高α-1,2-FT的表達量,用GST、脂肪酶前肽、麥芽糖結合蛋白和富含天冬氨酸的小肽來標記FT,都有助于此酶在大腸桿菌中的溶解性[34-35]。因此,科研工作者進一步研究了不同標簽對FT功能的影響。HOLLANDS等[28]在FutC酶上添加了一段SUMOstar?標簽,發現含有帶標簽的FutC酶的耶式酵母中2′-FL的產量比未帶標簽的高出30%,產量近60 mmol/L。WAN等[36]在利用短肽RIDD-RIAD將Fkp和FutC酶組裝成多酶復合物來提高2′-FL產量時,發現其中短肽RIDD也能提高FutC酶的溶解性,并且2′-FL的產量相比原始菌株有了顯著提高,達到了1.2 g/L,比不帶標簽的產量提高約50%。這表明,可以探索更多的融合標簽來提高α-1,2-FT的溶解性。

2.4 輔因子的再生

NADPH和GTP是參與生物能量和碳代謝的重要輔助因子,有助于維持細胞內的氧化還原平衡。目前,加強與代謝產物相關的內源性輔助因子已成為提高工業微生物化學品產量的有效方法。因此加強2′-FL代謝途徑中所需要的NADPH和GTP的再生也能有效提高2′-FL的產量[37]。其中NADPH的主要來源是磷酸戊糖途徑(PPP途徑),因此過表達PPP途徑中的關鍵基因可以促進NADPH的生成。

在合成過程中由甘露糖-1-磷酸到GDP-甘露糖的合成過程需要消耗一個GTP,因此GTP作為合成過程的一個關鍵輔因子,不僅為代謝過程提供能源物質,也作為GDP的一個供體,因此提高GTP的供給能有效的促進2′-FL代謝途徑。LI等[29]在大腸桿菌中共同過表達gsk和zwf基因促進了GTP和NADPH的再生,得到的重組菌中2′-FL的產量達到了2.24 g/L,相較于對照菌產量提高了53.8%。而GTP的代謝調控與鳥苷酸激酶(GMK)、核苷二磷酸(NDK)和黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(XPT)3個酶息息相關。研究表明,過表達ndk和gmk可以優化GTP供應并提高2′-FL的產量。如YU[38]通過啟動子動態調控GTP供應模塊來加強GTP的供應,在枯草芽孢桿菌中過表達GTP供應模塊中的基因gmk和ndk,使得2′-FL的產量達到了1 839.7 mg/L,相較未過表達的菌株2′-FL產量提高了31.5%。

2.5 2′-FL的輸出

對于所有的宿主菌,大部分的2′-FL都存在細胞內,而胞內積累過多的2′-FL可能會通過反饋作用來抑制2′-FL的產生,從而影響2′-FL的產量[39-40]。因此,篩選一個合適的糖轉運體也是很重要的。HOLLANDS[28]通過篩選27個糖轉運體,通過檢測發酵液中2′-FL的產量,結果發現來自大腸桿菌的SetA和粗糙脈孢菌的纖維糊精轉運體CDT2能夠較好地將2′-FL從酵母細胞中輸出。

3 結論與討論

2′-FL在嬰幼兒的健康及發育中起著重要的作用,其化學結構簡單,可通過母乳直接提取、化學合成、酶促合成以及微生物生產4種方式獲得;而微生物合成由于其安全經濟等優勢,成為研究者所關注的熱點。微生物高效合成2′-FL有5個關鍵部分需要關注,包括GDP-巖藻糖的生產、競爭途徑的調控、巖藻糖基轉移酶的選擇、輔因子的供給以及2′-FL的排出,表2對上述采用這5種策略的科研工作進行了總結。在早期研究中,大部分只是通過過表達或者敲除等常規方式來調控基因的表達,但在不同的生長時期所需要調控的基因并不相同,例如在前期細胞生長階段,更期望細胞專注于自身生長;而在細胞趨于成熟后,則調控細胞成為生產的工廠,生產所需要的終產物。因此在改造微生物工廠時,要獲得終產物高產和細胞工廠數量的平衡,選擇一個合適的動態調控的方式可能是一個較好的策略。此外,大多數研究都引用了外源質粒,而質粒的引入需要抗生素篩選,但抗生素的使用在食品安全生產中存在風險,因此盡量避免質粒的運用,將外源基因直接整合到基因組會是更為安全可靠的策略。此外,大腸桿菌由于能直接合成GDP-巖藻糖而被大多數研究者所青睞,但大腸桿菌會有產內毒素的風險,因此選用更為安全的食品級微生物作為工程菌來生產2′-FL將會更有前景。

表2 生產2′-FL工程菌株的構建Table 2 Construction of Engineered Strains for 2′-FL Production