等容冷凍技術在食品保存中的研究進展

魏啟航,張虹虹,劉書成,夏秋瑜,劉陽,吉宏武,孫欽秀, 2*

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心, 水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088) 2(江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室,江蘇海洋大學,江蘇 連云港,222005)

冷凍可以通過抑制微生物的生長和酶的活性來維持食品原有的營養價值及感官品質,延長食品的貯存時間,是防止食品浪費的有效手段之一[1]。但在傳統冷凍過程中,形成的大而不規則的冰晶會刺破食品的組織細胞,導致不可逆的結構損傷、汁液損失、營養價值下降等問題[2]。為了解決這些問題,近年來研究者們提出了許多新型方法來抑制冷凍過程中冰晶的形成,使食品處于過冷(超冰溫)狀態貯藏,從而改善產品的品質,如電場輔助過冷[3]、磁場輔助過冷[4]、添加冰點調節劑[5]等。這些技術雖然可以避免冰晶的形成,減小冰晶對食品組織細胞的破壞,但由于晶核的形成是復雜且不可預測的過程,因此處于過冷狀態的食品內仍會隨時誘發成核發生凍結[6]。

等容冷凍(isochoric freezing,ICF)是一種新型技術,指將食品放進一個體積恒定且密閉的容器中進行冷凍貯藏[7]。這項技術首先由RUBINSKY及他的團隊在2005年提出[8]。他們認為,在等容體系中,隨著溫度的降低,形成的冰晶會對液相施加高壓,從而降低液相的凍結點,使得系統內存在一定體積的低溫且未被凍結的液相,當食品處于過冷態的液相中時,既能抑制酶活性,又可以阻止冰晶的形成[9],從而改善了冷凍產品的品質。并且,因體系內始終有液相的存在,可以減緩滲透壓的變化幅度,降低食品細胞的脫水損傷。因為等容環境下冰晶的體積變化僅與溫度有關,當溫度不變時,系統內就不會新形成冰[10],因此,相對于其他過冷貯藏技術,等容冷凍系統內的液相的過冷態是穩定的,消除了冰晶成核的不確定性。此外,等容冷凍技術還能減少能源消耗與碳排放[11],據該團隊的另一成員BILBAO-SAINZ在一篇新聞報道中所言,如果等容冷凍技術可以全面應用于冷凍行業,減少的碳排放量相當于減少了一百萬輛汽車[12]。目前,在果蔬、肉制品、水產品和微生物等領域,等容冷凍技術已經有了一些初步研究。

本文對等容冷凍技術原理以及在食品行業中的研究進展進行綜述,同時對等容冷凍技術當前存在的局限之處進行探討分析,展望其未來在食品低溫保存行業的發展潛力,以期為其在食品冷凍方面的研究與應用提供更多的參考。

1 等容冷凍概述

1.1 等容冷凍原理

從熱力學的觀點來看,等容系統可以被認為是一個體積固定且密閉的系統。圖1顯示了純水的壓力-溫度圖,顯示了其中4種不同冰相在水的相圖中的存在的條件范圍,在顯示的所有冰相中(冰Ⅰ、冰Ⅱ、冰Ⅲ、冰Ⅴ),與液態水共享相界的有冰Ⅰ、冰Ⅲ和冰Ⅴ相,不同冰相的密度不同[13]。除冰Ⅰ相外,其他冰相的密度均比水高。等容系統中的凍結過程將精確地遵循冰Ⅰ和水之間的液相線,直到冰Ⅰ、冰Ⅲ和水的三相點,此時,體系內有約45%的溶液保持液態,在此之后,系統內將生成冰Ⅲ相,因冰Ⅲ的密度高于冰Ⅰ相,形成冰Ⅲ相后固相體積減少,無法繼續產生高壓,并將導致體系內充滿冰晶。因此,等容冷凍的設定溫度應控制在三相點溫度以上。

在等容系統中,因為體積是恒定的,且腔壁是剛性的,因此冰的膨脹會對剩余的液相施加壓力,從而降低液相的凍結點。隨著溫度的降低,壓力會繼續上升,直到液相線上系統的溫度等于設定的溫度。然而,由于勒夏特列原理指出,如果改變影響平衡的條件之一(如溫度、壓強),平衡將向著能夠減弱這種改變的方向移動。因此,當水在凍結膨脹時,在恒定體積系統中產生的壓力將阻礙冰的進一步生成,即剛性容器內的冰無法無限生長,而是與液相保持一定的體積比。此時,在恒定溫度、固定體積下,體系的壓力變化存在一個動態平衡,這可保證等容冷凍體系內的液相處于穩定的過冷狀態[14]。

圖1 水在等容條件下的相變圖[15]Fig.1 Phase change diagram for water under isochoric conditions

等容冷凍過程如圖2所示,在冷凍開始前,在遠離樣品的一端建立成核點(一些固體,如螺母等),并在腔內充滿液體以排盡氣體[16],密封后將設備放入低溫環境中。隨著溫度的不斷降低、且有促成核物質的存在,冰晶開始在成核點處形成,不斷生長并向四周施加壓力,使得液相受到的壓力不斷增加,凝固點降低,維持在液態。當到達目的溫度時,樣品被保存在過冷的液相中而不發生凍結,從而維持新鮮的品質。

圖2 等容冷凍過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of the process of isochoric freezing

冷凍過程中將所需的壓力自發維持在最低的水平、且樣品不發生凍結的兩大特點,使得等容冷凍成為了一種節能減排的冷凍技術。據POWELL-PALM等[17]報道,因為食品并未被凍結,故相較于傳統的冷凍方法,等容冷凍最大限度地提高了有效熱質量,在顯著提高系統的溫度穩定性的情況下,使得整體能耗降低了約70%。ZHAO等[18]通過建立相變模型預測之后認為:若等容冷凍技術得以廣泛應用,理論上全球每年的能耗將減少6.49×1010kW·h,同時減少4.59×1010kg的碳排放量。

1.2 等容冷凍設備

與其他一些新興技術,如電場輔助、磁場輔助等相比,等容冷凍不需要復雜的設備儀器,只需要一個承壓能力較強的容器,同時通過冰浴或其他方法對容器外部降溫到目的溫度,并增加一個壓力傳感器即可,如圖3所示。

圖3 等容冷凍裝置示意圖[19]Fig.3 Schematic diagram of the device of isochoric freezing[19]

在等容冷凍過程中,隨著溫度的降低,壓力腔壁承受的壓力逐漸升高,直至抵達水的三相點(209.9 MPa),因此,腔壁所需的材料通常需要較高的抗壓能力,如鈦[20]、不銹鋼[21]等。同時,因為不溶空氣會導致腔內冰晶體積的增加[16],因此需要保證腔體內氣體的消除以及腔的密封程度,圖3中的六角螺釘、箍、密封套、栓等部件均用來提高腔體的密封程度。在冷凍過程中,通過壓力傳感器實時監測腔內的壓力,以判定冷凍終點。

在壓力腔內,樣品可以裝于塑封袋或塑料離心管等較柔軟的小容器中或直接浸泡在液體內,以保證樣品與液相接觸,在小容器內外需要裝滿液體以保證腔體內沒有氣泡?？梢愿鶕煌臉悠坊蚰康倪x擇不同的液體,魚、肉類可選擇等滲的氯化鈉溶液[22],果蔬可選擇等滲的蔗糖溶液[23]或抗壞血酸溶液[24]。在保存蛋白質制劑方面,加入蔗糖溶液可減緩蛋白質的冷變性[25],還可以降低血紅蛋白的聚集性,提高其在冷凍時的穩定性[26]。

等容冷凍設備簡單、操作方便,無需對目前存在的制冷基礎設施進行較大的改變,就可以應用于冷鏈運輸的全過程,甚至放置于家用冰箱內。但設備本身需要具有極高的抗壓能力及密封性,因此目前僅有實驗性的小型設備,無法應用于實際生產。未來需要在保證安全與性能的同時,進一步提高等容冷凍設備的容積,以擴大其應用范圍。

2 等容冷凍改善凍藏食品品質的原理

相對于傳統的冷凍方法,等容冷凍可以在低溫且不產生冰晶的情況下穩定地保存食品,消除因冰晶生長給食品帶來的冷凍損傷,又因為體系內始終存在液相,可以減緩因冰晶生長帶來的脫水損傷。同時,因溫度降低而產生的高壓也會對食品中的微生物產生一定的影響,從而抑制食品的腐敗。

2.1 消除冰晶生長產生的細胞機械損傷

在傳統冷凍過程中,由于冰晶的生長,細胞被刺破,導致食品在解凍后的品質急劇下降。等容冷凍可使食品保存在穩定的過冷環境中,這可以消除冷凍過程中食品細胞因冰晶生長而引起的機械損傷[27],也能穩定細胞內外的滲透壓,從而更好地維持冷凍食品的品質。NSTASE等[28]研究了等容冷凍對羅非魚品質的影響,如圖4所示,冷凍處理后,相對于等壓冷凍,經等容冷凍處理后的羅非魚細胞間隙沒有顯著增加,細胞排布緊密,更接近新鮮樣品,這證明經等容冷凍處理后,肌肉內部并未產生冰晶。LYU等[29]在植物細胞中也有相似的發現,經等容冷凍處理后的馬鈴薯細胞未被冰晶破壞,避免了細胞內容物流出,證明等容冷凍可以抑制冰晶對馬鈴薯的冷凍損傷(圖5)。

A-新鮮肌肉;B-經3 h等壓冷凍后貯存在-5 ℃下的肌肉; C-經3 h等容冷凍后貯藏在-5 ℃下的肌肉圖4 不同條件冷凍后羅非魚肌肉組織微觀圖像[28]Fig.4 Comparison between fresh muscle under different freeze conditions[28]注:星號表示肌纖維束,白色虛線指向包裹肌纖維束的結締組織。

A、D-新鮮組;B、E--5 ℃等壓冷凍組; C、F--5 ℃等容冷凍組,箭頭指向細胞壁圖5 新鮮和經等壓冷凍、等容冷凍的馬鈴薯切片由甲苯 胺藍O染色后的顯微照片[29]Fig.5 Micrographs of fresh, isobaric frozen and isochoric frozen potato sections stained by toluidine blue[29]

等容冷凍過程中不在食品細胞內產生冰晶的特點,使其果蔬、水產等易發生凍害的食品具有極大的應用潛力,擴大其應用后可以促進這些食品的市場規模進一步擴大。

2.2 減緩滲透壓變化帶來的細胞脫水損傷

冰晶在形成過程中會不斷增加液體中溶質的濃度,因此在傳統的等壓冷凍過程中,食品細胞環境中的滲透壓會隨著冰晶的形成而逐漸升高,導致食品細胞不斷脫水,引起細胞內pH值的變化,導致營養物質的變性。添加冷凍保護劑可以減緩細胞的脫水損傷,但冷凍保護劑最大的缺點是如何在食品中加入和去除,且其潛在毒性也需要學者慎重考慮。而在等容冷凍過程中,因冰晶生長產生的壓力可通過液體傳遞給食品細胞,使得食品細胞內部的水的凝固點降低,避免在降溫過程中食品細胞內部產生冰晶,減緩滲透壓變化帶來的細胞脫水損傷,另外,體系中液相的存在也起到了減緩滲透壓變化的作用。

2.3 抑制微生物的生長

等容冷凍過程中會同時產生高壓和低溫的環境。其中,高壓可以通過破壞微生物的細胞膜、膜蛋白、核糖體等,影響微生物細胞的結構和代謝[30],而較低的溫度可以抑制酶的活性從而抑制微生物的生長與繁殖。目前研究表明,等容冷凍對培養基環境中的常見致腐菌和致病菌的生長具有一定的抑制效果,包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌。

大腸桿菌是較易污染食品的致病菌之一,攝入后可能會引起人發生胃腸道感染等疾病,因此殺滅食品中的大腸桿菌具有積極意義,PRECIADO[31]最先研究了等容冷凍處理對大腸桿菌的影響,發現經-20 ℃等容冷凍處理后2 h后,大腸桿菌的存活率急劇下降。SALINAS-ALMAGUER等[32]在大腸桿菌方面與PRECIADO[31]的實驗結果有差異。他在不同溫度的等容條件下對大腸桿菌懸浮液進行冷凍處理。結果發現,在等容條件中,并非溫度越低,大腸桿菌繁殖越緩慢,而是存在臨界溫度。如圖6所示,在當環境溫度低于三相點之后,會在環境中形成密度相對于冰Ⅰ相更大的冰Ⅲ相,減少了固相的體積,為部分大腸桿菌提供相對安全的環境,使得大腸桿菌免受高壓的影響,并在解凍之后重新繁殖。而在-15 ℃時,環境中的冰Ⅰ相與水相共存,當冰Ⅰ相體積增大時,產生的壓力能通過液相傳遞給大腸桿菌,導致充滿細菌懸浮液的試管中的大腸桿菌全部滅絕。

POWELL-PALM等[33]研究了不同冷凍溫度/暴露時間的等容/等壓冷凍處理和恢復時間對大腸桿菌的影響,發現在較高的溫度下(-10/-15 ℃),較短的暴露時間(30/60 min)無法對大腸桿菌產生明顯的抑制作用,甚至在當冷凍溫度為-10和-15 ℃,暴露30/60 min時表現出相反的效果;而在-20 ℃下,隨暴露時間的延長,受傷細胞的百分比逐漸升高,且活細胞數量在經120 min后數量百分比降低了約50%,大腸桿菌遭到永久性破壞,另外,作者還發現,雖然等容冷凍與等壓冷凍處理后大腸桿菌的數量均有隨溫度降低而降低的趨勢,但在同樣溫度下,等容冷凍的對數下降值遠高于等壓冷凍,這進一步證明了等容冷凍的抑菌能力。

沙門氏菌(Salmonella)和單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)2種在冷凍食品中常見的致病菌,攝入后可能導致的胃腸道疾病,嚴重的可能會造成菌血癥。因此,這2種細菌對評價冷凍食品的安全性極其重要,學者們需要尤為關注。BRIDGES等[34]在不同溫度下測試鼠傷寒沙門氏菌(S.entericaserovar Typhimutium, ATCC 14028)和單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenesserotype 4b, ATCC 19115)在等容冷凍條件下的存活情況。發現經過等容冷凍處理之后,2種細菌均能降至不可恢復的水平,菌落總數對數減少值均能達到7 lg CFU/mL以上,而等壓冷凍處理后的減少值分別為1.3 lg CFU/mL和2.1 lg CFU/mL。另外,等容冷凍處理在每個階段的抑菌能力均比等壓冷凍處理強。經電子顯微鏡觀察后發現,等容冷凍處理24 h后的鼠傷寒沙門氏菌細胞會發生非常明顯的變形、萎縮和質壁分離現象(圖6)。

以上研究證明了等容冷凍處理可以利用低溫與高壓來抑制微生物的生長繁殖。但研究對象都是在懸浮液/培養基中而非食品體系,且研究的致病、致腐的微生物種類較少。未來還需要進一步研究等容冷凍處理對存在于食品中的微生物的影響,探討出既可抑制病原微生物的繁殖,又能維持食品細胞結構完整性的處理參數,進一步提高冷凍食品的貯藏穩定性及安全性。

A-過夜生長(不處理);B-在-15 ℃等壓冷凍24 h; C-在-15 ℃等容冷凍24 h圖6 鼠傷寒沙門氏菌在不同生長條件下的圖像[34]Fig.6 Images of Salmonella typhimurium under different grown conditions[34]注:刻度條表示TEM圖像為1 μm,FE-SEM圖像為2 μm; 箭頭指出細胞質與細胞膜的可見分離。

3 等容冷凍在食品貯藏方面的應用

等容冷凍技術最初被應用于生物材料的保存研究方面,例如哺乳動物細胞[35]、胰島[36]、心臟[21],這些研究為器官的保存、移植提供了更多、更好的參考。近年來,等容冷凍也被引入到食品冷凍中,目前對等容冷凍技術在食品冷凍中的研究應用相對較少,但在植物性食品和動物性食品中都有所研究。

3.1 等容冷凍在植物性食品方面的應用

在冷凍過程中,水分含量較高的果蔬通常會因內部冰晶的生長導致細胞膜破裂,抗壞血酸、酚類化合物等活性物質流出,使解凍后的感官品質和營養價值發生巨大劣變,而在等容冷凍過程中,食品可以保存于過冷的液相中,從而避免冰晶生長的影響。目前,等容冷凍在植物食品領域的研究主要集中在較易發生腐敗變質的菠菜、圣女果、甜櫻桃以及馬鈴薯的冷凍。

LYU等[29]在-3 ℃下將等容冷凍與等壓冷凍對比。結果發現,與等壓冷凍相比,經過等容冷凍后,馬鈴薯的重量與新鮮樣品幾乎一致,沒有出現脫水現象,色澤也與新鮮樣品接近,說明經等容冷凍后馬鈴薯細胞膜并未因冰晶生長而破壞,使得酶促褐變受到抑制(圖5)。同樣用馬鈴薯作為實驗對象,CRISTINA等[37]將等容冷凍、等壓冷凍與單體快速冷凍3種方法對比,得到的質量、顯微結構方面的結果與LYU等[29]的類似,并且,等容冷凍處理還能提高馬鈴薯中的總酚含量及抗氧化能力,并將褐變的發生時間推遲一周(圖7)。

圖7 經不同條件冷凍并解凍3 h后的馬鈴薯圖片[37]Fig.7 Pictures of potatoes frozen under different conditions and thawed for 3 h[37]

ZHAO等[24]對等容冷凍處理馬鈴薯的參數進行了優化試驗。將馬鈴薯放置于不同的冷凍液中,采用不同的溫度/壓力和不同的壓力變化率,研究不同處理條件對馬鈴薯品質的影響。發現,浸泡在等滲的抗壞血酸溶液中,以低于0.02 MPa/s的速度升至156 MPa的冷凍馬鈴薯切片質量較好,其具有與新鮮樣品接近的顏色、質量、和彈性,但因為壓力的增加,馬鈴薯切片的硬度有13%的增幅。

除了馬鈴薯,BILBAO-SAINZ等[23,38-40]還將該技術研究于幼葉菠菜、圣女果、甜櫻桃和石榴。用等容冷凍、速凍、等壓冷凍分別對甜櫻桃進行冷凍處理后,BILBAO-SAINZ等[38]發現等容冷凍處理降低了甜櫻桃的滴水損失,色澤與質構與新鮮樣品更為接近,維持了甜櫻桃的外觀(圖8),且抗壞血酸、可溶性酚類物質的含量的下降程度最低,這證明了等容冷凍在水果方面的應用潛力。BILBAO-SAINZ等[23]將幼葉菠菜在等容冷凍、等壓冷凍及商業冷凍處理后測定其品質。結果發現,等壓冷凍處理后,菠菜的質量和厚度會發生顯著的減小,外觀表現為葉片柔軟、透明。而經過等容冷凍后的菠菜,其營養物質,如抗壞血酸、葉綠素、多酚的下降程度最低,這說明其抗氧化活性下降最為緩慢,同時細胞結構更為完整,外觀也更加接近新鮮樣品。對于圣女果,BILBAO-SAINZ等[39]將經4種方法(10 ℃下貯藏、單體快速冷凍、-2.5 ℃等容冷凍和-2.5 ℃等壓冷凍)貯藏4周之后的圣女果品質進行對比,結果顯示,等容冷凍處理可以維持圣女果的質量、外觀(圖9)以及質構,經冷凍掃描電鏡觀察后發現,等容冷凍處理的圣女果的細胞結構更為完整,這可能是其營養物質保留量相對較高的原因。經過-2.5 ℃的等容冷凍處理后,BILBAO-SAINZ等[40]還發現,相對于冷藏,石榴的總花色苷、抗壞血酸的含量更高,好氧菌如酵母和霉菌的數量也顯著降低。

在果蔬冷凍貯藏過程中,等容冷凍處理之后的果蔬貯藏穩定性顯著增強,不僅可以通過抑制冰晶的生長來防止細胞組織被破壞而引起外觀變化,還在抑制酶活性等方面具有一定的作用,可以有效地維持果蔬的品質與營養價值。但目前研究的樣品種類、數量過少,并且等容冷凍抑制酶活性的詳細機制還未被確定,在等容冷凍過程中產生的高壓對細胞的作用也不容忽視。因此,還需進一步擴大等容冷凍在植物性食品方面的研究廣度與深度,在尋找不同食品的最佳處理方式的同時確保等容冷凍在節能減排方面的優勢。

A-分別為新鮮樣品;B--4 ℃等容冷凍;C--7 ℃等容冷凍; D--4 ℃等壓冷凍;E--7 ℃等壓冷凍;F-單體快速冷凍圖8 不同條件冷凍后甜櫻桃的外觀與橫截面對比[38]Fig.8 The appearance and cross section of sweet cherry after freezing under different conditions were compared[38]

A-新鮮樣品;B--2.5 ℃等容冷凍;C-10 ℃、85%相對濕度下貯存;D-單體快速冷凍;E--2.5 ℃等壓冷凍圖9 新鮮圣女果和冷凍處理后保存4周后的照片[39]Fig.9 Photograph of fresh grape tomato and preserved tomatoes after four weeks[39]

3.2 等容冷凍在動物性食品方面的應用

等容冷凍技術不僅在植物性食品的冷凍中有所應用,在動物性食品中也有所應用。但目前,等容冷凍技術在動物性食品中的研究較少。

之后BILBAO-SAINZ等[22]研究了等容冷凍對羅非魚魚片貯藏質量的影響,用等容冷凍、冷藏、過冷和冷凍4種方法處理魚片。發現經等容冷凍處理可大幅減緩揮發性鹽基氮值和硫代巴比妥酸值增加,這表明等容冷凍處理能夠抑制脂質的氧化與微生物的繁殖。另外,等容冷凍處理后的魚片質量略有增加且pH值變化不明顯,通過觀察微觀結構后發現,等容冷凍處理之后的細胞間隙與新鮮樣品最為相近,仍然存在均勻的肌纖維束且肌纖維束仍保持多邊形的截面形狀(圖10),這能解釋為什么等容冷凍處理之后魚片的咀嚼性、黏性和彈性能得到較好的保持。除了羅非魚,RINWI等[41]研究了在等容冷凍過程中,不同的氯化鈉濃度對雞肉品質的影響,發現使用2.5%的氯化鈉溶液作為冷凍液可以更好地維持肌肉的品質,同時也發現,在-4 ℃和-8 ℃下,等容系統的溫度、壓力和時間之間具有相關性,證明了在等容冷凍過程中,監測并控制壓力和溫度具有可行性。

A-新鮮樣品;B--20 ℃冷凍貯藏14 d;C--3 ℃等容冷凍 貯藏14 d;D-5 ℃貯藏14 d;E--3 ℃微凍貯藏14 d圖10 羅非魚魚片組織橫切面的顯微照片[22]Fig.10 Micrographs of cross-section of tilapia fillet tissue[22]

雖然等容冷凍對改善冷凍羅非魚和雞肉品質有著明顯的作用,但僅通過少量樣品,無法證實等容冷凍在動物性食品方面的優勢,未來仍需在這一方面進行更廣泛的研究。

4 總結

等容冷凍是一種食品低溫貯存技術,具有設備簡單、操作方便、綠色節能等優點,它可以通過抑制冷凍食品中冰晶的生長保持冷凍食品的品質。目前雖有部分研究表明等容冷凍可以防止冰晶出現、抑制腐敗菌和致病菌生長,但目前等容冷凍技術在醫藥領域研究較多,在食品應用較少,主要集中于果蔬以及培養基環境中的致病菌,因此為推進等容冷凍技術在食品中的應用,應該擴大其研究對象。此外,由于材料強度的限制,等容冷凍設備目前僅有實驗型,密封性不易保證且冷凍室容積不大,這仍是限制該設備發展的重要問題,需要食品機械方面和食品保藏方面科學家的共同努力以推動等容冷凍技術的發展,使其盡快應用于我國的冷鏈運輸過程中。