基于網絡藥理學探討巴元明治療慢性腎功能衰竭核心藥物的作用機制*

劉施,李成銀,高越,陳樹和,巴元明,徐玉婷

湖北省中醫院,湖北中醫院大學附屬醫院,湖北 武漢 430061

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)發病機制復雜,涉及腎小球病變、腎小管間質纖維化、脂質代謝異常等多個方面[1]。西醫治療CRF存在一定的局限性,如治療成本高、替代治療方案普及程度不足等。相比之下,中醫藥治療CRF具有較好的療效和優勢[2-5]。課題組前期基于中醫傳承輔助平臺構建巴元明治療CRF的醫案數據庫,采用關聯規則Apriori算法和熵聚類分析方法篩選核心藥物,包括黃芪、黨參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金櫻子、芡實、黃柏、穿山甲。這些核心藥物是在清代醫家沈金鰲所撰《沈氏尊生書》中的參芪地黃湯基礎上加減化裁而來[6],這一方劑具有較好的臨床療效。鑒于中藥復方具有多成分、多靶點的特性,這些核心藥物治療CRF的作用機制尚未完全闡明。網絡藥理學具有整體性、系統性等特征,能夠有效闡釋中藥的作用機制[7],并為研究復雜的中藥系統提供新思路[8-9]。本研究擬采用網絡藥理學方法探討巴元明治療CRF核心藥物的作用機制,以期為后續的臨床和基礎研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 核心藥物活性成分及作用靶點篩選在中醫藥整合藥理學研究平臺(integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine,TCMIP)V2.0數據庫[10](http：//www.tcmip.cn/)的“中藥材數據庫”中建立任務列表,檢索黃芪、黨參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金櫻子、芡實、黃柏、穿山甲的化學成分。根據結構相似的生物分子化合物具有類似理化性質和生物活性的原理,在TCMIP V2.0檢索化合物的二維結構,并將其與美國食品藥品監督管理局上市藥物進行比對,以Tanimoto系數定義的相似度計量方法對相似性打分,選擇相似性≥0.8的藥物所對應的靶點作為核心藥物的作用靶點。

1.2 CRF相關疾病靶點以“chronic renal failure”“renal failure”作為關鍵詞,在TCMIP V2.0“疾病靶標數據庫”中進行檢索,構建CRF的疾病靶點數據庫。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建將核心藥物作用靶點與CRF疾病靶點進行匹配,所得靶點即為核心靶點。通過TCMIP V2.0數據庫構建核心藥物作用靶點與CRF疾病靶點之間的PPI網絡。

1.4 “核心藥物-活性成分-關鍵靶點”網絡構建通過TCMIP V2.0的“中醫藥關聯網絡挖掘”模塊,針對核心藥物作用靶點與CRF疾病靶點的PPI網絡計算拓撲特征值,選取大于“介度(Betweenness)”“緊密度(Closeness)”中位數的靶點作為關鍵靶點,并構建“核心藥物-活性成分-關鍵靶點”的多維關系網絡。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析采用David v6.7數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp) 對核心靶點進行GO功能分析和KEGG通路分析,結果按照P值從低到高的順序進行排序。

2 結果

2.1 核心藥物化學成分及作用靶點基于TCMIP V2.0數據庫獲取12個核心藥物的化學成分,其中山茱萸56個、茜草52個、金櫻子14個、黃芪27個、黃柏24個、茯苓33個、黨參64個、芡實1個、白茅根20個、穿山甲8個、山藥45個、地黃12個。

設定相似性≥0.8獲取化學成分的作用靶點,其中山茱萸784個、茜草210個、金櫻子92個、黃芪399個、黃柏87個、茯苓232個、黨參540個、芡實21個、白茅根309個、穿山甲91個、山藥898個、生地黃656個。

2.2 CRF疾病靶點基于TCMIP V2.0疾病數據庫獲取13個CRF相關疾病靶點,包括前列腺素E受體 4(prostaglandin E receptor 4 gene,PTGER4)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等。

表1 CRF疾病靶點信息

2.3 PPI網絡及關鍵靶點將核心藥物作用靶點與CRF疾病靶點進行匹配,得到136個核心靶點,構建“核心藥物靶點-疾病靶點”的PPI網絡,見圖1。篩選大于"Betweenness""Closeness"中位數的靶點,得到62個關鍵靶點,根據Degree值進行排序后,排名前20位的關鍵靶點,見表2。

注：圓形代表核心藥物作用靶點,方形代表CRF疾病靶點。圖1 “核心藥物靶點-疾病靶點”PPI網絡圖

表2 巴元明治療CRF核心藥物的關鍵靶點(前20位)

2.4 “核心藥物-活性成分-關鍵靶點”多維關系網絡利用TCMIP V2.0平臺“中醫藥關聯網絡挖掘”模塊,建立巴元明治療CRF的“核心藥物-活性成分-關鍵靶點”多維關系網絡,結果顯示核心藥物的68個活性成分直接或間接作用于62個關鍵靶點,見圖2。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析針對136個核心靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析,GO分析以P<0.01為篩選條件,共獲得170個功能富集,其中生物過程(biological process,BP)涉及信號轉導、凋亡過程負調控、血管收縮、腺苷酸環化酶活性的激活等;細胞成分(cellular component,CC)涉及質膜、突觸、線粒體等;分子功能(molecular function,MF)涉及細胞色素C氧化酶活性、磷酸吡哆醛結合、受體活性、藥物結合、蛋白結合等,排名前9位的GO分析結果見表3。KEGG通路分析以P<0.05為篩選條件,共獲得105個通路富集結果,主要涉及神經活性配體-受體相互作用、環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號通路、代謝通路、Ras信號通路、近端小管對鈉離子的重吸收等,排名前10位的KEGG結果見圖3。

圖3 KEGG富集通路圖(前10位)

表3 GO功能富集分析(前9位)

3 討論

慢性腎功能衰竭是多種腎臟疾病晚期的最終結局,其發病機制涉及腎小球病變、腎小管間質纖維化等多個方面[11]。本研究基于TCMIP V2.0數據庫探索巴元明治療CRF核心藥物的作用靶點和信號通路,結果表明12味中藥含有356個活性成分,主要包括黃酮類化合物、甾體皂苷類及生物堿等,排名前20位的關鍵靶點主要與調節細胞凋亡、炎癥反應、免疫反應、新陳代謝等功能相關,主要分為以下幾類：(1)腺苷類(ADCY1、ADCY2、ADCY5、ADORA3、ADORA1、ADRA2A、ADRA2B)：腺苷受體廣泛分布于腎臟細胞,不同腺苷受體在腎纖維化中起著特異性作用,慢性腎病患者腎組織間隙腺苷濃度與纖維化程度具有相關性[12-13]。(2)多巴胺類(DRD2、DRD3)：多巴胺D2受體可與抑制型G蛋白耦聯,發揮抑制腺苷酸環化酶、調節鈣離子和鉀通道活性的作用[14-16]。(3)熱休克蛋白αA1：熱休克蛋白90是一種重要的蛋白伴侶,能激活內皮細胞磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路,在維護腎小球內皮細胞內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)功能中發揮重要作用[17]。(4)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受體(HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR2C)：5-HT及其受體是治療糖尿病腎病的抗氧化靶點,5-HT受體拮抗劑可通過降低腎小球血小板活性、增加血清脂肪細胞因子水平從而改善腎小球內皮細胞功能,進而減輕糖尿病腎病早期出現的蛋白尿[18-20]。(5)核因子κB(NFKB1、NFKB2)：NF-κB通路與炎癥相關,處于激活狀態時在腎小球肥大、腎臟纖維化等代謝性疾病中發揮重要作用[21]。(6)其他(TP53、AKT1)：研究發現AKT異常表達或激活參與糖尿病腎病纖維化的病理過程[22-23],沉默TP53基因可抑制AKT信號通路從而干擾腎透明細胞癌的局部浸潤和遠處轉移[24]。

本研究挖掘核心藥物治療CRF的KEGG通路,主要包括4種：(1)cAMP信號通路、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase,PKG)信號通路：cAMP、cGMP常作為腎陰虛模型的指標,參與調節多種物質代謝和生理功能;研究表明近端小管鈉重吸收與cGMP-PKG通路、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路激活導致哺乳動物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制有關[25];此外,cAMP/PKA信號通路的激活與腎纖維化有關[26]。(2)PI3K/AKT/mTOR信號通路：PI3K/AKT信號通路在腎小球系膜細胞增殖、細胞外基質積聚等病理過程中發揮作用;當腎臟受損時,腎上皮細胞中mTOR通路激活,引起細胞增生及纖維化,最終導致腎臟囊腫[27-28]。(3)PI3K/AKT/NF-κB信號通路：通過影響腎小球系膜細胞增殖導致間質纖維化;抑制PI3K/AKT信號傳遞,阻斷NF-κB信號通路激活,可改善腎小球纖維化病變。(4)胰島素抵抗通路：胰島素抵抗是慢性腎臟病進展的機制之一,研究表明胰島素可通過調節足細胞血管內皮生長因子在腎臟的表達水平,進而調節腎小球濾過功能[29]。綜上所述,巴元明治療CRF作用機制可能與調節腎臟炎癥反應、干擾腎小球內皮細胞損傷、調節近端小管重吸收、抗腎纖維化、調節胰島素受體結合、減少蛋白尿等有關。

腎小管間質纖維化是腎臟纖維化的標志,也是慢性腎臟疾病進展的重要因素[30]。本研究發現多條通路參與腎纖維化過程,如cAMP/PKA信號通路、PI3K/AKT/mTOR通路、PI3K/AKT/NF-κB信號通路、胰島素抵抗通路等,他們可通過調控炎癥反應和腎小球系膜細胞增殖,改善腎小球纖維化病變。其中,PI3K/AKT/mTOR信號通路在抑制足細胞凋亡中起關鍵作用[31-32],足細胞是腎小球內阻止蛋白濾出的重要屏障,足細胞數量減少可造成濾過屏障結構損傷,從而導致蛋白尿[33]。此外,高尿酸可激活NF-κB信號通路[34],觸發NF-κB下游大量炎癥因子合成,導致腎臟炎癥反應。因此,巴元明教授治療CRF的作用機制可能與抑制炎癥反應、調節足細胞的生成與凋亡、減少蛋白尿有關。巴元明教授治療CRF常用黃芪與穿山甲,研究表明黃芪甲苷可干擾PI3K/AKT/mTOR信號通路激活,抑制腎臟纖維化并通過MAPK途徑減弱補體膜攻擊復合物誘導的足細胞損傷[35];穿山甲可抑制黃嘌呤氧化酶和腎小管上多種尿酸鹽相關轉運體的活性從而治療高尿酸血癥,同時抑制NF-κB轉錄和炎癥因子合成,從而抑制因高尿酸刺激誘發的腎臟炎癥損傷[36]。

綜上所述,巴元明治療CRF的核心藥物具有多成分、多靶點、多途徑等特點,其可作用于腺苷酸環化酶1、多巴胺D2受體、熱休克蛋白αA1等靶點,調控近端小管對鈉離子的重吸收、代謝通路、Ras信號通路等通路。本研究初步挖掘出巴元明治療CRF核心藥物的作用靶點和信號通路,為中醫藥治療CRF提供了新思路,但研究結果尚需進一步的實驗驗證。