細胞死亡在膿毒癥引起的腎損傷中的作用

周文琛,何朝勇

(中國藥科大學,江蘇 南京 211198)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征,是一種以嚴重的全身炎癥和多器官功能障礙為特征的復雜疾病。膿毒癥是急性腎損傷(AKI)最常見的病因,占病例的40%以上[1],AKI的主要特征是血清肌酐升高或尿量減少,代表腎臟功能喪失。膿毒癥引起的系統性炎癥起始于固有免疫系統對病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)如革蘭陰性菌外膜的主要結構成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的識別。之后通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)等信號通路觸發炎癥反應,釋放多種炎癥介質,導致細胞損傷或死亡,進一步釋放損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),引發持續的炎癥反應。除了全身炎癥外,DAMPs和PAMPs還能與腎臟近端小管中的受體相互作用,導致局部炎癥反應,進而導致白細胞浸潤和腎小管損傷,并伴有腎臟細胞死亡[2]。腎臟中多種細胞的損傷和死亡被認為是AKI的促發因素[3],而細胞的內質網應激、炎癥反應和線粒體損傷等進一步促進AKI向CKD 轉變[4]。膿毒癥引起腎損傷的機制極其復雜,且至今仍沒有標準化和令人滿意的治療策略。

1 膿毒癥中的腎臟細胞死亡

腎小管和腎小球是腎臟的主要組成部分,主要由腎血管內皮細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞和腎間質成纖維細胞組成[5]。這些細胞在腎臟的功能維持中起著重要作用,同時其功能障礙或死亡與膿毒癥引起的腎損傷密切相關。

腎血管分布復雜,包括腎動脈、腎小球小動脈、腎小球毛細血管網、弓狀動脈和腎毛細血管。腎血管內皮細胞覆蓋在腎血管內部,通過對水、關鍵營養素和電解質的重新吸收,維持全身滲透性、酸堿平衡和細胞外液量的穩態。血漿中存在的內毒素、DAMPs、炎性因子和活性氧(reactive oxygen,ROS)等可導致血管內皮細胞功能障礙和死亡,內皮受損,受損的內皮屏障導致血管通透性增加、促凝血途徑激活和多種促炎細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放[6],大量液體、內毒素和炎性因子滲入腎間質,損傷腎間質細胞,加重腎臟損傷。同時,浸潤的炎性細胞和炎癥因子攻擊腎小管上皮細胞,腎小管的損傷阻礙腎小管內液體流動,使腎單位失去過濾功能。另外,腎小管上皮細胞既是炎癥因子的主要靶點也是重要來源,損傷的腎小管上皮細胞釋放一系列炎癥因子和生長因子,導致巨噬細胞浸潤,系膜細胞增殖,以及腎間質成纖維細胞增殖和表型轉化,促進腎小球硬化[4]和腎間質纖維化[7]。而作為先天免疫核心的巨噬細胞同樣在腎損傷中發揮重要作用,受損組織釋放的PAMPs或DAMPs激活并促進巨噬細胞向促炎表型(M1)轉化,促進炎性因子,趨化因子和 ROS的釋放[8],進一步影響上文提到的多種腎臟固有細胞。

綜上所述,腎臟中血管內皮細胞、腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞、腎間質成纖維細胞和巨噬細胞的損傷和功能障礙及其相互聯系是膿毒癥引起的AKI發生的病理生理基礎,也與AKI轉化為CKD后腎結構與功能的進一步惡化密切相關。

2 膿毒癥中的腎臟細胞死亡類型

膿毒癥引起的腎損傷涉及多種細胞死亡途徑,這些途徑的分子機制不同但相互關聯(見圖1),細胞死亡形式大致可分為凋亡、壞死、焦亡和自噬等,不同死亡形式對于腎損傷的影響也有所不同。

圖1 膿毒癥中的腎臟細胞死亡途徑

2.1 細胞凋亡細胞凋亡途徑是膿毒癥誘導的腎損傷的重要分子機制之一。根據起始caspase的不同,哺乳細胞的凋亡可分為3種基本的途徑,一種稱為外在途徑,由細胞表面的死亡受體如Fas 和腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)引發;一種稱為內在途徑或線粒體途徑,由細胞受到刺激后線粒體中凋亡相關因子如細胞色素C的釋放引發;另一種是內質網應激所誘導的CHOP引發的凋亡。

在死于感染性休克患者的腎臟活檢樣本的組織學檢查中,TUNEL染色顯示在所有膿毒癥樣本的近端和遠端小管中都發現了凋亡細胞[5]。在CLP和LPS誘導的膿毒癥動物模型中,在腎小管細胞和血管內皮細胞中觀察到了凋亡[9-10]。而在LPS處理的腎小管上皮細胞HK-2細胞中,腎小管細胞損傷標記物KIM-1和NGAL,caspase-3活性,TUNEL陽性細胞均有所增加,同時與凋亡相關的p53、Bax、C-PARP蛋白表達增加[11]。研究表明,LPS刺激會導致TNF-α和Fas配體的水平上升,它們激活TNFR進而激活下游的caspase-3[12],活化的caspase-3移位進入細胞核,導致底物裂解、DNA降解和蛋白質修飾,凋亡小體出現。同時,腎臟是最耗能的器官之一,富含線粒體,內毒素刺激也導致線粒體功能障礙和ROS產生,過量ROS會刺激p53和Bax而誘導凋亡,同時Bax可以促進線粒體跨膜電位的損失和細胞色素C向胞質的釋放[13],觸發凋亡的內源性途徑[14]。因此,凋亡信號通路與膿毒癥引起的腎損傷密切相關。

2.2 細胞焦亡相比細胞凋亡,細胞焦亡會導致大量DAMPs和促炎因子的釋放以及炎癥細胞的活化,從而加劇炎癥反應和各種組織的損傷。PAMPs 如LPS刺激會導致中樞炎癥反應和炎癥小體激活,包括NOD樣受體蛋白3 (NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、caspase-1和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC),進而促進促炎細胞因子IL-1β和IL-18等的成熟。激活的caspase-1切割GSDMD,GSDMD的N端序列結合到膜上并產生膜孔,導致細胞腫脹、膜破裂和細胞死亡。另外,LPS也可直接激活人caspase-4,5或小鼠caspase-11,進而裂解GSDMD,而不依賴于NLPR3和caspase-1的激活,且caspase-11激活誘導的細胞焦亡對小鼠的膿毒癥休克至關重要[15]。

巨噬細胞和腎小管上皮細胞中的細胞焦亡在膿毒癥相關AKI的發病機制中起重要作用。研究表明,M1型巨噬細胞釋放的大量炎癥介質是膿毒癥時器官損害的重要原因之一[16],而通過抑制M1型巨噬細胞的TNF-α/HMGB1信號通路可抑制LPS誘導的焦亡并改善腎功能[17]。條件性敲除小鼠單核/巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞caspase-11后,GSDMD、IL-1β和IL-18的激活均有所減弱[18]。在野生型小鼠腎小管上皮細胞中,LPS處理后出現顯著的細胞焦亡,伴隨著caspase-11蛋白表達增加,而來源于caspase-11敲除小鼠的腎小管上皮細胞中焦亡細胞顯著減少。同時,LPS誘導的野生型小鼠腎臟損傷嚴重,其特征為腎小管變性和擴張,失去刷狀緣。而caspase-11敲除小鼠中觀察到的LPS誘導的腎損傷程度顯著降低[19]。Caspase-1抑制劑的使用也減少了NLRP1炎癥小體的表達和腎小管上皮細胞的焦亡,并改善CLP誘導的小鼠AKI[20]。另外,研究表明Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinases 1,ROCK1)可能通過TLR2介導的內質網應激/細胞焦亡軸調節膿毒癥誘導的AKI[21]。ROCK1在CLP誘導的小鼠腎臟和LPS處理的HK-2細胞中表達顯著上升,而敲低ROCK1顯著降低LPS誘導的HK-2細胞焦亡。這些結果表明腎臟細胞焦亡可能是膿毒癥引起腎損傷的主要機制之一。

2.3 細胞壞死細胞壞死是嚴重的病理性因素誘發的病理性細胞死亡。受體相互作用蛋白激酶1 (receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)通過激酶依賴性和非依賴性功能調節細胞死亡和炎癥,可作用于RIPK3和混合譜系激酶結構域樣蛋白 (mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)[22],MLKL是細胞壞死的下游效應器,RIPK3介導其磷酸化[23],p-MLKL形成寡聚體并轉運至細胞質膜,導致細胞膜通透性增加,細胞腫脹,最終細胞裂解并釋放出內含物,引起炎癥反應[24]。

在LPS誘導的膿毒血癥小鼠模型中,RIPK1突變提高了小鼠的存活率,且RIPK1突變小鼠的原代巨噬細胞受到LPS刺激后的壞死減少[25]。在CLP小鼠模型中腎臟p-RIPK3和p-MLKL水平顯著升高,而RIPK3敲除減緩了腎小管的損傷,同時在HK-2細胞中,使用RIPK3抑制劑進行前處理或敲除RIPK3均改善了LPS誘導的線粒體功能障礙[26]。另外,在腎缺血/再灌注小鼠模型中,使用RIPK1抑制劑Nec-1減少腎小管細胞壞死并改善了腎損傷[27]。另外,RIPK3介導的壞死和GSDMD介導的焦亡在膿毒癥中,協同促進巨噬細胞和內皮細胞中的炎癥和組織因子釋放,從而導致組織損傷[28]。

2.4 細胞自噬與其他形式的細胞死亡不同,細胞自噬可能改善膿毒癥引起的腎損傷。在饑餓、缺氧、壓力等應激條件下,細胞通過PI3K、PTEN、Akt和mTOR等關鍵分子調控自噬[29],p53也可通過負調控mTOR促進自噬。細胞內的病原體、受損的蛋白質和功能失調的細胞器被包裹在自噬體中,并在溶酶體中被清除,因此自噬被認為是維持細胞內穩態和應激反應的必要因素[30]。自噬的過程主要包括自噬體的形成、溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體以及自噬溶酶體中底物的降解。

研究表明,與自噬密切相關的SIRT6和LC3B-II/LC3B-I的表達水平在LPS處理后的小鼠腎臟中顯著增加,表明在膿毒癥引起的腎損傷中細胞自噬的存在。而在HK-2細胞中過表達SIRT6降低了LPS誘導的TNF-α和IL-6的表達,并減少了細胞凋亡[31]。另外,α2-腎上腺素受體激動劑右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)可通過α2-AMPK-mTOR信號通路增強自噬,抑制NLRP3炎癥小體的激活以及IL-1β和IL-18的表達,進而緩解LPS誘導的AKI,而自噬抑制劑3-MA減弱了DEX的作用[32]。在CLP大鼠模型DEX中同樣抑制了炎癥因子的上調,改善腎損傷[33]。另外,受損的線粒體可以通過被稱為線粒體自噬的選擇性自噬作用降解,通過被吞噬到自噬體中進行降解來促進受損線粒體的更新。由PINK1-Parkin途徑介導的線粒體自噬可清除線粒體ROS并阻止隨后的NLRP3炎癥小體的活化,進而減少腎小管上皮細胞死亡和組織損傷[34]。這些研究表明,自噬可以通過抑制細胞凋亡和焦亡來減緩膿毒癥引起的腎損傷。

3 膿毒癥中的腎臟細胞死亡機制

在膿毒癥引起的腎損傷中,內質網應激、線粒體動力學失衡、氧化應激和線粒體功能障礙都參與對細胞死亡的調節。深入理解膿毒癥引起的腎損傷中細胞死亡機制可以促進有效治療和預防方法的發展。

3.1 內質網應激在一些異常損傷因素的影響下,內質網不能正常轉運蛋白質,導致未折疊蛋白的積累和內質網應激,引發未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction,UPR)以維持細胞穩態。肌醇需求酶1、PKR樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和激活轉錄因子6 (activate transcription factor 6,ATF6)3種跨膜蛋白在內質網應激時被激活并激活下游的ATF4、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulating protein 78,GRP78)等,加速UPR[35]。但過度的內質網應激會導致CHOP介導的細胞凋亡[36]等。在膿毒癥誘導的AKI過程中,內質網應激同樣起著重要作用[37]。

在LPS處理的HK-2細胞中,內質網應激的重要標記物ATF4,CHOP和p-eIF2α水平顯著上調,使用黃酮類藥物松屬素(pinocembrin,PINO)顯著改善了LPS引起的內質網應激并減少了細胞凋亡和炎癥因子的產生,而在內質網應激激動劑衣霉素的作用下,PINO的保護作用被減弱[38]。在CLP小鼠模型中,含甲烷的鹽水溶液可通過抑制內質網應激相關的GRP78/ATF4/CHOP/caspase-12凋亡信號通路,發揮其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用,改善膿毒癥誘導的AKI[35]。而在腎小管上皮細胞中敲低GRP78抑制了CHOP和caspase-12的激活,減少了LPS誘導的細胞凋亡[39]。另外,使用?；撬崦撗跛猁}抑制內質網應激,降低了對乙酰氨基酚誘導的肝細胞IL-1β的分泌和活性caspase-1的產生,減少了細胞死亡,表明細胞焦亡也與內質網應激顯著相關[40]。另有研究表明,ROCK1在調節細胞焦亡、炎癥和內質網應激中起著至關重要的作用[41],在HK-2細胞中,ROCK1敲除可抑制LPS誘導的TLR2、CHOP和GRP78蛋白水平,同時HK-2細胞焦亡率下降,使用TLR2激動劑PAM3CSK4則減弱了這種抑制作用。在CLP小鼠模型中ROCK1敲除同樣了減輕了小鼠腎組織細胞的內質網應激和細胞焦亡,同時改善了腎功能,提高小鼠的存活率[21]。這些結果表明ROCK1通過TLR2介導的內質網應激調節細胞焦亡進而改善了膿毒癥誘導的腎損傷。

3.2 線粒體動力學失衡線粒體是一類高度動態的細胞器。在生理條件下,線粒體的分裂和融合是一個持續進行的過程,在線粒體質量控制和細胞能量代謝中起著關鍵作用,融合通過將部分受損的線粒體內容物作為一種補充形式進行混合來幫助緩解壓力;分裂產生新的線粒體,同時將線粒體受損的部分與正常部分分開[42]。在哺乳動物細胞中,線粒體融合涉及線粒體融合蛋白1、線粒體融合蛋白2和OPA1,分裂則依賴于動力蛋白相關蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)、線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fis1)等。在應激條件下,細胞可能出現線粒體動力學失衡,在膿毒癥引起的AKI中表現為線粒體分裂增加而融合減少,進而造成一系列負面影響。

在CLP誘導的AKI小鼠模型中,腎臟線粒體生物合成和融合受到抑制,而裂變增加,其特征是過氧化物酶體增殖激活受體輔激活因子-1α(peroxisome proliferation-activating receptor coactivator-1α,PGC-1α)和OPA1水平降低,Drp1水平升高,同時晚期CLP小鼠腎臟中的線粒體自噬功能受損,表現為COX IV和LC3的共定位減少,進一步導致了受損線粒體的積累、氧化應激和細胞死亡[43]。在腎臟缺血/再灌注和順鉑誘導的腎毒性實驗模型中,DRP1在腎小管細胞損傷早期易位至線粒體,隨后發生線粒體斷裂、Bax/Bak激活、細胞色素C釋放以及caspase酶的激活,進而引起細胞凋亡,使用Drp1藥物抑制劑mdivi-1減少了腎小管細胞的凋亡,改善小鼠的腎損傷[44]。而在LPS誘導的膿毒癥小鼠模型中,mdivi-1下調了NLRP3炎癥小體相關蛋白表達,改善線粒體功能并減輕了腎小管上皮細胞的焦亡[45]。

3.3 氧化應激和線粒體功能障礙普遍認為,急性和慢性腎臟疾病的發展可能均主要歸因于控制氧化應激的分子機制失衡[46],而超氧陰離子介導的腎小管損傷可能是AKI進展的重要因素[47]。正常情況下,通過糖酵解和脂肪酸的β-氧化進行的葡萄糖代謝是腎臟的主要能量來源,近端小管細胞主要將脂肪酸作為量來源,產生ATP的主要機制是有氧呼吸[48]。而在膿毒癥和缺氧狀態下,近端小管細胞通過將丙酮酸轉化為乳酸這種效率更低的機制產生ATP,同時三羧酸循環被阻斷,這種代謝變化是由AKT/mTORC1/HIF-1α信號通路介導的[49]。糖酵解的增加會產生大量丙酮酸,丙酮酸在線粒體內積聚并形成琥珀酸,而當組織重新供氧時,琥珀酸被迅速氧化,大量超氧陰離子產生[3]。在正常條件下,超氧陰離子可被超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)轉化為H2O2,隨后被過氧化氫酶(catalase,CAT)分解為H2O,但在膿毒癥狀態下,腎組織SOD和CAT水平顯著降低,ROS水平顯著增加,這通常是由酶誘導的ROS產生和抗氧化劑消耗的結果[50]。過量的ROS導致氧化應激并進一步引起線粒體功能障礙,影響細胞的凋亡和焦亡等。ROS可激活p53,抑制BCL-2,進一步激活BAX復合物并在線粒體形成膜孔而誘導凋亡[51]。同時ROS、受損的線粒體膜脂和氧化形式的mtDNA均是NLRP3的活化配體,會誘導NLRP3的激活進而促進細胞凋亡和焦亡[34]。

在許多與腎臟中ROS生成有關的酶系統中,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)似乎是最重要的貢獻者,通過消耗NADPH產生超氧陰離子和ROS[52]。在小鼠肺內皮細胞中,膿毒癥導致NOX1、NOX2和NOX4顯著上調,使用siRNA干擾NOX1和NOX4能顯著減少ROS的產生,且NOX4干擾降低了CLP誘導的膿毒癥小鼠的死亡率[53]。而在LPS或順鉑刺激的腎小管上皮細胞中,NOX的亞單位p47phox、p22phox和NOX4表達上調,且p47phox的膜轉位和ROS的產生明顯增加[11]。另外,在CLP誘導的AKI模型中,RIPK3在腎小管上皮細胞中表達增加且促進腎小管損傷。同時,RIPK3增強了NOX4的表達并促進NOX4向線粒體轉運,進而促進氧化應激和線粒體功能障礙,而RIPK3和NOX4敲除均顯著改善了小鼠腎小管損傷[26]。這些結果均表明了氧化應激和線粒體功能障礙在膿毒癥誘導的腎損傷中的重要作用。

4 總結與展望

膿毒癥引起的腎損傷是一個非常復雜的過程,涉及腎血管內皮細胞、腎小管上皮細胞和巨噬細胞等多種細胞的參與。其中,腎血管內皮細胞功能障礙和死亡導致內皮受損,腎微循環障礙,炎性因子滲入腎間質;腎小管上皮細胞死亡導致腎小管的結構和功能異常;巨噬細胞的焦亡和壞死可全身或局部放大炎癥反應,這些都是膿毒癥引起的腎損傷的病理生理基礎。而內質網應激、線粒體動力學失衡和氧化應激等被認為是細胞死亡的主要誘因。相信通過針對腎臟細胞死亡探索有效的治療靶點并開發有效的治療藥物,有望改善膿毒癥引起的腎損傷并降低膿毒癥的死亡率。