超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定掛面、方便面中15 種真菌毒素

許 嘉 王 碩 曹瀚文

（北京市朝陽區疾病預防控制中心， 北京 100025）

真菌毒素 （Mycotoxins） 是由某些真菌產生的化合物， 常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素B1（AFB1）、 黃曲霉毒素B2（AFB2）、 黃曲霉毒素G1（AFG1）、 黃曲霉毒素G2（AFG2）、 雪腐鐮刀菌烯醇 （NIV）、 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DON）、 3－乙?；撗跹└牭毒┐迹?－AcDON）、 15－乙?；撗跹└牭毒┐?（15－AcDON）、 玉米赤霉烯酮 （ZEA）、 赭曲霉毒素A （OTA）、 伏馬菌素B1（FB1）、 伏馬菌素B2（FB2）、 伏馬菌素B3（FB3）、 T－2 毒素和HT－2 毒素等。 這些毒素在食品安全領域引起了全球關注， 因為它們廣泛存在于各種谷物及其制品中， 對人類和動物健康有顯著影響。 據聯合國糧食及農業組織估計， 全世界谷物供應鏈25%受到真菌毒素的污染， 對人體和動物的健康具有極大危害[1]。 小麥在生長時期容易受到鐮刀菌、 青霉菌、 曲霉菌等致病菌的污染[2]。 侵染小麥的鐮刀菌產生的DON、 ZEA、 T－2 和HT－2 這4 種鐮刀菌毒素對小麥污染情況最為嚴重[3]。 另外，伏馬菌素主要污染玉米、 小麥等糧食作物， 在大豆、 堅果中也有分布[4]。 基于小麥廣泛被多種真菌毒素污染的背景， 本研究選擇同時測定15 種污染嚴重、 風險較高的真菌毒素（AFB1、 AFB2、 AFG1、AFG2、 NIV、 DON、 3 －AcDON、 15 －AcDON、ZEA、 OTA、 FB1、 FB2、 FB3、 T－2 和HT－2 毒素）。

目前， 真菌毒素的檢測方法包括酶聯免疫法[5]、 熒光免疫分析法[6]、 薄層色譜法[7]等。 相較于上述測定方法， 超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS/MS） 可降低假陽性率、 改進分離不完全[8～9]的問題， 具有高通量、 操作簡單、 快速靈敏、回收率高、 重復性好等特點。 UPLC－MS/MS 通過高度靈敏的質譜檢測， 能夠確保非常低的檢出限，并準確鑒定微量的真菌毒素， 這對于評估食品（如谷物和掛面、 方便面） 中的低濃度真菌毒素至關重要[10]。 且因具有高通量的分析特性， 使UPLCMS/MS 可以同時檢測多種真菌毒素， 極大地提高了樣品處理的效率， 特別適用于大規模的食品安全監測[11]。 同時， 由于其高靈敏度和強大的分離能力， 采用UPLC－MS/MS 時允許使用更為簡單的樣品前處理步驟， 如簡單的萃取和凈化， 從而減少樣品處理時間并降低成本[12]。

在我國， 谷物是居民膳食結構的核心成分， 尤其在北方， 小麥的種植和消費可以追溯到幾千年前， 它與當地的歷史、 文化和生活方式密不可分。在現代社會， 人們的生活節奏加快， 對方便食品的需求隨之增加， 這使得像掛面和方便面這樣的產品成為了消費熱點。 這種轉變也帶來了食品安全上的新挑戰。 真菌毒素， 特別是在存儲不當的情況下，可能在谷物中滋生， 進而污染食品。 鑒于這種風險， 確保產品質量和安全性顯得尤為重要。 為此，需要制定嚴格的檢測標準和方法， 確保消費者能夠放心食用。 本研究擬基于UPLC－MS/MS 開發一種針對掛面和方便面中多種真菌毒素的快速測定方法， 以期滿足監管機構要求， 也為廣大消費者健康提供有力技術保障。

一、 材料與方法

（一） 儀器與設備超高效液相色譜－串聯三重四極桿質譜儀 （ACQUITY UPLC I－Class/Xevo TQ－S， 美國Waters 公司）， 配有電噴霧離子源（ESI）； 電子天平（日本島津公司）； 振蕩器（德國Elma 公司）； 高速粉碎機（上海比朗儀器制造有限公司）； 漩渦混勻器 （德國IKA 公司）； 高速冷凍離心機（美國Sigma 公司）。

（二） 試劑乙腈、 甲醇（色譜純， 美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 甲酸（色譜純， 美國Acros Organics 公司）。 乙腈－水－甲酸溶液（70∶29∶1，V∶V∶V）： 量取700 mL 乙腈加入290 mL 水中，加入10 mL 甲酸， 混勻。 0.1%甲酸甲醇溶液： 吸取1 mL 甲酸， 用甲醇稀釋至1 L， 混勻。 0.1%甲酸水溶液： 吸取1 mL 甲酸， 用超純水稀釋至1 L，混勻。

（三） 標準物質與標準溶液

1.內標物質。13C20－OTA， 10.00 μg/mL；13C34－FB1， 5.04 μg/mL；13C34－FB2， 5.05 μg/mL；13C34－FB3， 10.02 μg/mL；13C17－AFB1， 0.500 μg/mL；13C17－AFB2， 0.500μg/mL；13C17－AFG1， 0.502μg/mL；13C17－AFG2， 0.502μg/mL；13C18－ZEA， 25.2 μg/mL；13C15－NIV， 25.30 μg/mL；13C15－DON， 10.0 μg/mL；13C17－3－AcDON， 25.3 μg/mL；13C22－HT－2， 10.1 μg/mL；13C22－T －2， 1.02 μg/mL。 以上均購自ROMER 公司。

2. 混合標準儲備液。 吸取一定量的標準溶液，用甲醇定容至10 mL， 渦旋混勻， 在－20℃保存。

3.混合同位素內標標準儲備液。 分別移取一定體積的15 種真菌毒素同位素標準溶液于5 mL 容量瓶中， 用乙腈稀釋定容至刻度， 充分混勻后于－20℃避光保存。

4.標準曲線溶液。 準確移取混合標準儲備液適量， 用超純水逐級稀釋， 配制成不同濃度點的混合標準曲線系列溶液。 分別準確移取10 μL 混合同位素內標標準儲備液于各內插管中， 加入190 μL 對應的混合標準曲線濃度點溶液， 于渦旋混合器上混合均勻， 配制成標準曲線溶液系列。

（四） 儀器條件

1. 色譜條件。 色譜柱為Cortecs UPLC C18柱（150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）。 流動相A 為0.1%甲酸水溶液， 流動相B 為0.1%甲酸甲醇溶液； 柱溫為40℃； 樣品室溫度為10℃； 進樣量為5 μL。 梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2. 質譜條件。 離子源為ESI， 正離子模式； 質譜掃描方式為多反應監測模式（MRM）； 錐孔電壓為3.0 kV； 加熱氣溫度為400℃； 離子源溫度為150℃； 脫溶劑氣流速為800 L/h。 各目標化合物及其內標物的保留時間、 定性定量離子對及錐孔電壓、 碰撞能量見表2。

表2 15 種目標化合物和14 種內標物質的質譜參數

（五） 樣品處理

1.樣品前處理。 用高速粉碎機將掛面、 方便面粉碎， 過篩， 使其粒徑小于0.5～1 mm 孔徑試驗篩， 混合均勻后儲存于樣品瓶中， 密封保存， 置于－20℃低溫冰箱中保存， 供檢測用。

2. 提取與凈化。 測試樣品： 準確稱取5 g （精確到0.01 g） 試樣于50 mL 離心管中， 加入20 mL乙腈－水－甲酸溶液 （70∶29∶1，V∶V∶V）， 并用渦旋混合器混勻1 min， 置于旋轉搖床上振蕩提取30 min， 然后以8 000 r/min 離心5 min。 準確轉移0.5 mL 上清液于1.5 mL 離心管中， 加入1.0 mL水， 旋渦混勻后， 在4℃下以10 000 r/min 離心10 min， 吸取上清液過0.22 μm 濾膜。 吸取190 μL 處理好的樣品濾液于300 μL 內插管中， 加入10 μL穩定同位素混合溶液， 混勻， 待上機檢測。

3.空白試驗。 除不稱取試樣外， 均按上述步驟進行。

二、 結果與分析

（一） 色譜柱的選擇考察比較了Cortecs UPLC C18（150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）、 Capcell Pak C18（100 mm×2.1 mm，2 μm） 和Waters ACOUITY（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm） 3 種色譜柱對目標化合物的分離效果。 結果顯示， 當采用Cortecs UPLC C18柱時， 目標化合物分離好， 峰形尖銳， 保留時間適中， 能滿足定量檢測要求。 因此， 最終選擇Cortecs UPLC C18色譜柱 （150 mm×2.1 mm， 1.6 μm）。

（二） 色譜條件的優化UPLC－MS/MS 檢測樣品時， 流動相的組成與配比會影響目標化合物的離子化效率和色譜峰峰形。 基于目標化合物易溶于甲酸水溶液、 甲酸甲醇溶液等溶劑的特性， 本研究比較了0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸甲醇溶液及超純水 （含0.1%氨水） －0.1%甲酸甲醇溶液等不同流動相體系下的分離效果。 結果顯示， 水相中添加0.1%甲酸后， H+濃度增加， 使得正離子掃描模式下目標物的離子化效率提高； 同時甲醇溶液作有機相添加0.1%甲酸后， 可提高負離子的響應強度并改善峰形。 此外， 也有文獻報道在ESI+模式下， 加入甲酸有利于提高目標物的離子化效率， 增大其靈敏度[13～14]。 因此， 綜合考慮最終選擇0.1%甲酸水溶液－0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相體系， 并通過優化梯度洗脫 （結果見表1）， 使各目標化合物較好地分離， 色譜峰峰形良好。

（三） 質譜條件的優化配制15 種真菌毒素的混合標準溶液， 將標準溶液用獨立針泵以5 μL/min 流速注入質譜， 在電噴霧離子源下， 進行一級母離子全掃描， 比較正、 負離子模式下的響應， 選擇合適的模式， 優化質譜毛細管電壓、 錐孔電壓、 碰撞能量、 去簇電壓、 霧化氣、 氣簾氣， 檢測得到具有最強響應的定量離子和定性離子對（見表2）。

（四） 提取溶劑的選擇目前常用的提取溶劑主要為甲醇－水、 乙腈－水－甲酸、 乙腈－水等。在極性溶劑中加入一定比例的水后進行提取， 可提高其對樣品的滲透性從而提高提取效率[15]。 本研究參考不同文獻中的提取溶劑， 選取甲醇－水（70∶30，V∶V）、 乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V）、 乙腈－水 （50∶50，V∶V） 進行對比，結果見圖1。 結果顯示， 乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V） 作為提取溶劑時， 15 種目標化合物的回收率較甲醇－水（70∶30，V∶V） 條件下高； 而相較于乙腈－水（50∶50，V∶V） 作提取溶劑時， 雖然HT－2 的回收率有所下降， 但其下降幅度不超過3.5%， 且DON、 FB2、 FB3的回收率有了明顯提高， DON 的回收率由74.0%提高到89.6%，FB2由75.8%提高到89.4%， FB3的回收率由69.7%提高到84.9%。 加入甲酸不僅有助于維持DON、FB2、 FB3的穩定性， 避免在萃取和分析階段的降解， 而且它優化了ESI 的離子產生過程， 從而增強了檢測的靈敏度。 因此， 本研究最終選擇乙腈－水－甲酸 （70∶29∶1，V∶V∶V） 作為提取溶劑。這與謝慧英等[16]研究選用的提取溶劑相同， 但體積比略有不同。

（五） 線性關系、 方法檢出限與定量限目標化合物使用同位素內標， 以空白樣品的提取液作為標準溶液的稀釋液， 配制基質匹配系列工作曲線。以待測物的質量濃度（μg/L） 為橫坐標， 目標化合物的峰面積為縱坐標制作標準曲線。 結果顯示， 15種真菌毒素在一定濃度范圍內線性關系良好， 相關系數大于0.99 （見表3）。 以3 倍信噪比（S／N＝3）和10 倍信噪比 （S／N＝10） 時相應的加標量為方法的檢出限（LOD） 和定量限（LOQ）， 結果顯示，方法LOD 為0.1～33.0 μg/kg， 方法LOQ 為0.2～100.0 μg/kg。 方法的靈敏度完全滿足國家標準對真菌毒素的限量要求。

表3 15 種真菌毒素的線性范圍、 回歸方程、 相關系數、 檢出限和定量限

（六） 準確度與精密度對樣品進行3 個濃度水平的加標回收試驗， 每個濃度水平進行6 次重復實驗， 計算測定結果的相對標準偏差 （RSD）。 結果顯示， 15 種真菌毒素的平均回收率為76.9%～110.4%， RSD 為0.1%～7.1%（見表4）。 方法準確性高， 穩定性好， 符合GB/T 27404－2008 《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》 對實驗室質量控制范圍的要求。

表4 15 種真菌毒素在掛面、 方便面中的回收率與精密度 （n＝6）

三、 結論

在食品安全領域， 真菌毒素的檢測是一個十分重要的研究課題。 面對真菌毒素的結構多樣性， 研究人員們必須不斷革新和優化檢測方法。 該研究踐行了這一理念， 構建了一種掛面、 方便面中15 種真菌毒素的超高效液相色譜－串聯質譜檢測方法。該 方法利用MRM 模式， 確保了對各類真菌毒素的高靈敏度檢測， 使得即便是微量的毒素也能被準確捕捉和分析。 此外， 該方法能夠同時進行真菌毒素的定性和定量分析， 具有極高的應用價值和應用前景， 為食品安全領域提供了一種新的、 可靠的檢測手段。