HPLC法測定廣西不同產地八角茴香中4種有機酸的含量

歐 敏，潘 宇，陳 路，趙成堅，侯小利，譚梔恩，張孟麗，李曉玲，吳芳芳*

（1.廣西壯族自治區藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，廣西 南寧 530023；3.右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

八角茴香又稱八角，為木蘭科八角屬植物Illicium verum Hook.f.的干燥成熟果實，其味辛、性溫，適用于腎虛腰酸、胃寒嘔吐等癥，也常用作食用香料［1-2］。八角茴香含有揮發油、有機酸、黃酮、倍半萜內酯等多種化學成分，具有抑菌、抗炎、止痛、抗動脈粥樣硬化等作用，是天然的抗病毒藥［3］。莽草酸、原兒茶酸、對甲氧基苯甲酸、對羥基苯甲酸都是有機酸中的重要組成成分［4］?，F代研究表明，莽草酸是合成抗H5N1 禽流感病毒藥物“達菲”的重要成分，同時還具有減少軟骨細胞自噬的損害等多種功效［5-6］；原兒茶酸臨床可用于治療慢性氣管炎［7］；對甲氧基苯甲酸是合成茴拉西坦、酪氨酸酶抑制劑等藥物的重要成分［8］；對羥基苯甲酸可以應用于化工、塑料、食品、醫藥及染料工業中［9］。廣西是八角茴香的主要產地，八角茴香作用廣泛，可用于醫藥工業、獸藥工業及其他化學工業。通過挖掘八角的藥效潛能，可有效發揮廣西八角資源的實際價值，促進八角產業的發展。

目前，2020版《中華人民共和國藥典（一部）》中八角茴香僅有對揮發性成分中揮發油和反式茴香腦的含量測定［10］，缺乏非揮發性成分的評價指標，質量控制仍不夠完善。廣西八角茴香產地較多，生長環境不同，藥材品質之間存在一定的差異。本研究擬建立八角茴香中的莽草酸、原兒茶酸、對甲氧基苯甲酸、對羥基苯甲酸的含量測定方法，對廣西11 個不同產地的八角茴香進行含量測定，以期為廣西八角茴香的質量控制、品質優選及開發利用提供更多科學依據。

1 實驗材料

1.1 試藥與試劑 甲醇［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；乙腈［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；石油醚（天津市富宇精細化工有限公司）；莽草酸對照品（成都普菲德生物技術有限公司）；原兒茶酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；對羥基苯甲酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；對甲氧基苯甲酸對照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；實驗用水為屈臣氏蒸餾水；八角茴香藥材分別采收于廣西不同產地，由廣西藥用植物園藍鳴生主任藥師鑒定為木蘭科八角屬植物八角茴香Illiciun verum Hook.f.的干燥成熟果實。

1.2 儀器 LC-2030C-3D-Plus 型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；KQ-300VDE 型三頻超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLERTOLEDO 型十萬分之一電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；BSA124S 萬分之一電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸5.060 mg、2.515 mg、3.006 mg、2.515 mg，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得含量為莽草酸1.012 mg/ml、原兒茶酸0.503 mg/ml、對羥基苯甲酸0.501 mg/ml 和對甲氧基苯甲酸0.503 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取八角茴香粉末1 g，加水20 ml 超聲波提取30 min，靜置，稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取續濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-3%磷酸水溶液，進行梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 ml/min；進樣量：10μl；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.4 系統適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10μl，按“2.3”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。結果莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 標準曲線的繪制 精密吸取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件，以混合對照品進樣量為橫坐標（X），混合對照品峰面積的平均值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程，見表2。

表2 線性關系考察結果

2.6 重復性試驗 取供試品6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為2.4%、0.8%、1.8%、0.8%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 后按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的RSD 分別為0.9%、4.7%、3.1%、1.7%（n=8），結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，計算莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸峰面積的RSD分別為0.4%、0.8%、0.9%、0.5%（n=6），結果表明儀器精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取產自玉林大容山的八角茴香（含量為6.57%）的樣品6份，每份約1 g，置錐形瓶中，精密加入“2.1”項下混合對照品溶液0.5 ml，按“2.2”項下方法制備加樣回收樣品溶液，然后按“2.3”項下色譜條件測定峰面積并計算回收率。結果莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的加樣平均回收率分別為102.5%、96.9%、101.6%、102.5%，RSD 值分別為1.5%、1.5%、1.1%、1.5%。表明加樣回收率符合要求，結果見表3。

2.10 樣品含量測定 取11 個產地八角茴香適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，含量測定結果見表4。

3 討 論

莽草酸是八角茴香的主要成分，其為水溶性成份［11］，因此采用水提取的方法能更好地提取分離出莽草酸。超聲波提取效率高，提取時間也大為減少，因此采用超聲波提取。

高效液相色譜法具有測量速度快、靈敏度高等優點，在藥學分析檢驗中得以廣泛應用［12］。本研究采用高效液相色譜法對八角茴香中4 種有機酸的含量進行檢測，在預試驗中，曾對色譜柱、柱溫、不同波長及流動相進行考察。在色譜柱的選擇中，本研究選擇Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其適用于分離非極性的化學物質。在柱溫的選擇中，分別考察了20 ℃、30 ℃、40 ℃，結果表明在40 ℃時柱壓較穩定，分離效果最好。在波長的選擇中，考察并比較了213 nm［13］和254 nm［14］的波長，結果表明在254 nm處莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸的吸收峰較213 nm處吸收峰大，且峰面積平穩，因此，選擇254 nm作為測定波長。在流動相的選擇上，本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-3%磷酸水溶液等不同緩沖溶液，結果表明采用乙腈-3%磷酸水溶液作為流動相，通過梯度洗脫能得到較好的分離效果，且出峰時間較為理想。

本研究采用高效液相色譜法對八角茴香中莽草酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸進行測定，方法操作簡便，穩定性強，重復性好，可作為八角茴香的質量控制手段之一。