全氟辛酸對肉雞肝臟和十二指腸的損傷作用

姚文梅,寇晨雨,孫雨昕,劉 濤,2,3,王曉丹,2

[1.河北農業大學中獸醫學院,河北 保定 071000;2.河北省獸醫生物技術創新中心,河北 保定 071000;3.瑞普(保定)生物藥業有限公司,河北 保定 071000]

全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PFOA)是一類新型的持久性有機化合污染物。自20世紀50年代以來,PFOA因具有良好的表面活性和疏水疏油等特性,而被廣泛用于生活用品和工業制造[1]。研究發現,PFOA暴露會誘導機體出現心血管疾病、遺傳毒性、免疫毒性、慢性腎病、生殖毒性和肝臟毒性。近年來,全球范圍內大氣[2]、土壤[3]和水體[4]等環境介質以及畜產品中都能檢出含有PFOA。Li等[5]測定了我國31個省級行政區域的79個城市飲用水樣本中17種全氟烷基類化合物(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)的水平,結果顯示,中國飲用水中普遍存在PFAAs,∑17 PFAAs在4.49～174.93 ng/L范圍內,平均值為35.13 ng/L。調查發現,河流和自來水中普遍存在PFOA、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonates,PFOS)、全氟己酸(Perfluorohexanoic acid,PFHxA)、全氟癸酸(Perfluorodecanoate,PFDA)和全氟戊酸(Perfluoropolyalkylether N,N-diphenylamide,PFPeA)[6]。Tan等[7]測定了我國東部地區作為飲用水主要來源的河流和湖泊中17種多氟烷基物質(Polyfluoroalkyl substances,PFASs)的濃度,飲用水中PFASs的總濃度為1.4～175.0 ng/L,但最令人擔憂的是,杭州三區飲用水中PFOA濃度為115～151 ng/L。Bao等[8]研究發現,阜新地區某氟化物工業園區地下水樣品中 PFOA 含量為2.47 μg/L,其溫室旁土壤樣品中 PFOA 含量為6.8 ng/g,溫室內種植的番茄和黃瓜中 PFOA 濃度高達87和63 ng/g。PFOA不僅有很強的生物富集性[9],還可以通過食物鏈進行傳遞。研究發現,肉類產品中大部分含有PFASs,其中含量最多的是PFOA和PFOS。白潤葉[10]對全國部分主產區1 445份雞肉樣品中PFASs進行調查,結果顯示,PFOA含量位列第二,濃度為0.055 7 ng/g;隨著對人群血清[11-12]、動物性食品(肉[13]、蛋[14]、奶[15]、水產[16])和生活飲用水[17]中PFOA含量進行檢測分析,發現長期暴露于PFOA環境中對全球生態環境和人類健康都存在很大的威脅。

PFOA主要通過污染的飲水和食物進入機體并蓄積,進而對機體產生毒性作用。目前,關于PFOA的毒性研究主要集中于小鼠,對生產實踐動物的研究較少。因此,本試驗通過檢測肉雞生長性能和胸肌肉品質,肝臟和十二指腸中炎癥因子,觀察肉雞肝臟和十二指腸形態變化,檢測肝臟組織中轉氨酶和抗氧化指標,以探究飲水中暴露不同質量濃度的PFOA對肉雞生長性能、胸肌肉品質、肝臟和十二指腸的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PFOA(純度為95%),購自Sigma-Aldrich公司;丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Plasma glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成科技有限公司;白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)試劑盒、白介素-6(Interleukin 6,IL-6)試劑盒和腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor α,TNF-α)試劑盒,均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 Synergy HTX多功能酶標儀(BioTek,USA);Seven CompactTM多參數測試儀(梅特勒-托利多儀器有限公司);三恩馳NR60CP手持式色差儀(深圳市三恩馳科技有限公司)。

1.3 試驗動物和分組 1日齡健康愛拔益佳肉雞160羽,由天津靜海慶源有限公司提供。將肉雞隨機分為4個組:0 mg/L PFOA組(C組)、0.5 mg/L PFOA組(D組)、1.0 mg/L PFOA組(Z組)和1.5 mg/L PFOA組(G組),每組4個重復,每個重復10羽。試驗期間采用3層籠養,24 h恒定光照,自由采食和飲水,按正常免疫程序進行免疫接種。適應環境飼養3 d,第4天在飲水中添加不同質量濃度的PFOA,連續添加至42日齡。于42 d試驗結束時,于每組中的每個重復隨機選取4羽肉雞,翅下靜脈采血,處死后采取肉雞的胸肌、肝臟和十二指腸,保存待測。

1.4 指標測定

1.4.1 平均日增重和肝臟指數 試驗肉雞1日齡和42日齡清晨空腹稱重。按公式(1)計算平均日增重(Average daily gain,ADG)。將收集的肝臟用生理鹽水沖洗,去除表面結締組織和脂肪,稱重,按公式(2)計算肝臟指數。

平均日增重=(末重-初始重)÷試驗天數

(1)

肝臟指數(%)=肝臟重量(g)÷體重(g)×100%

(2)

1.4.2 胸肌肉品質和常規指標測定 取肉雞左側胸肌用于測定屠宰后24 h的肉品質和常規指標的測定,包括肉色、pH和蒸煮損失。

肉色:采用三恩馳NR60CP手持式色差儀,測定胸肌的亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)。同一樣品測定3次,取平均值。

pH:將胸肌放入4 ℃冰箱保存,用Seven CompactTM多參數測試儀測定胸肌的pH,測定時將電極完全插入胸肌樣品中。同一樣品測定3次,取平均值。

蒸煮損失:剪下厚約3 cm、重約30 g的樣品,剔除脂肪和結締組織,裝入蒸煮袋置于90 ℃水浴,測得胸肌樣品中心溫度為70 ℃時,取出并冷卻至室溫,用濾紙將表面水分吸干后稱重,按公式(3)計算蒸煮損失。

蒸煮損失(%)=(樣品煮前重-樣品煮后重)÷樣品煮前重×100%

(3)

1.4.3 肝臟中ALT和AST活力測定 將0.1 g肝臟組織和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的肝臟組織勻漿。按照試劑盒說明書進行操作,測定肝臟中ALT和AST的活力。

1.4.4 肝臟和十二指腸組織病理學觀察 將肉雞的肝臟和十二指腸用4%多聚甲醛固定24 h。每組選取3份樣品,經過修塊,流水過夜,梯度酒精脫水,透明,浸蠟,包埋,制成5 μm石蠟切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色后于光學顯微鏡下進行組織病理學觀察。取3張不同的十二指腸切片,每張切片選取6處走向完整的腸絨毛,用Image J圖像分析軟件測量絨毛高度(V)和隱窩深度(C),并計算V/C值。

1.4.5 肝臟氧化指標測定 將0.1 g肝臟組織和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的肝臟組織勻漿。按照試劑盒說明書進行操作,測定肝臟中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量。

1.4.6 肝臟和十二指腸中炎性因子含量測定 將0.1 g組織(肝臟或十二指腸)和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的組織勻漿。按照試劑盒說明書進行操作,測定組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.5 數據分析 試驗數據通過SPSS 19.0(Statistical Package for The Social Sciences,SPSS)軟件進行單因素方差分析,若方差齊性,采用最小顯著差異法(Least significance difference,LSD)檢驗;若方差不齊,采用Dunnett法檢驗。試驗數據用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示無顯著差異。

2 結果

2.1 PFOA對肉雞平均日增重和肝臟指數的影響 由表1可知,飲水中暴露PFOA后能降低肉雞的平均日增重,與C組(0 mg/L)相比,G組(1.5 mg/L)的平均日增重極顯著降低(P<0.01)。飲水中暴露PFOA后能升高肝臟指數,與C組(0 mg/L)相比,Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)的肝臟指數極顯著升高(P<0.01),且呈劑量依賴性。

表1 PFOA對肉雞平均日增重和肝臟指數的影響

2.2 PFOA對肉雞胸肌肉品質和常規指標的影響 由表2可知,與C組(0 mg/L)相比,暴露于PFOA對屠宰后24 h的肉色(L*、a*、b*)和pH均無顯著影響(P>0.05);與C組(0 mg/L)相比,僅G組(1.5 mg/L)屠宰后24 h的蒸煮損失顯著升高(P<0.05)。

表2 PFOA對肉雞胸肌肉品質的影響

2.3 PFOA對肉雞肝臟中AST和ALT活力的影響 由圖1可知,與C組(0 mg/L)相比,在飲水中暴露PFOA后,肉雞肝臟中AST和ALT的活力都升高,其中Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)的AST和ALT的活力都極顯著升高(P<0.01)。結果表明,飲水中暴露PFOA會造成肉雞肝臟損傷,且隨著PFOA質量濃度增加,肉雞肝臟中AST和ALT活力逐漸升高。

圖1 PFOA對肉雞肝臟中AST和ALT活力的影響

2.4 PFOA對肉雞肝臟組織病理學的影響 如圖2所示,C組(0 mg/L)肝細胞結構完整,細胞核清晰,無明顯變性。飲水中暴露PFOA會破壞肉雞肝臟組織的正常結構,其中D組(0.5 mg/L)肝索排列較整齊,肝細胞有空泡變性和細胞核固縮;Z組(1.0 mg/L)肝索結構紊亂,細胞發生空泡變性和細胞核固縮;G組(1.5 mg/L)肝索紊亂,肝細胞空泡變性并伴有炎性浸潤。

圖2 PFOA對肉雞肝臟組織形態學的影響(400×)

2.5 PFOA對肉雞十二指腸絨毛形態的影響 如圖3所示,C組(0 mg/L)十二指腸絨毛形態結構完整,絨毛排列整;Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)絨毛高度降低且絨毛出現水腫。如表3所示,與C組(0 mg/L)相比,在飲水中暴露不同質量濃度的PFOA后,十二指腸絨毛高度和隱窩深度及其比值均有極顯著差異(P<0.01)。

圖3 PFOA對肉雞十二指腸絨毛形態的影響(200×)

表3 PFOA對肉雞十二指腸絨毛高度和隱窩深度的影響

2.6 PFOA對肉雞肝臟氧化指標的影響 如圖4所示,與C組(0 mg/L)相比,D組(0.5 mg/L)肉雞肝臟中SOD活性顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05);Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)肝臟中SOD、GSH-Px和CAT活性極顯著降低(P<0.01),MDA含量極顯著升高(P<0.01)。

圖4 PFOA對肉雞肝臟氧化指標的影響

2.7 PFOA對肉雞肝臟中炎癥因子的影響 如圖5所示,與C組(0 mg/L)相比,Z組(1.0 mg/L)肉雞肝臟中IL-6含量顯著升高(P<0.05),IL-1β和TNF-α含量極顯著升高(P<0.01);G組(1.5 mg/L)肉雞肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都極顯著升高(P<0.01)。

圖5 PFOA對肉雞肝臟中炎癥因子的影響

2.8 PFOA對肉雞十二指腸中炎癥因子的影響 如圖6所示,與C組(0 mg/L)相比,D組(0.5 mg/L)肉雞十二指腸中TNF-α含量顯著升高(P<0.05);Z組(1.0 mg/L)肉雞十二指腸中IL-1β和TNF-α含量顯著升高(P<0.05);G組(1.5 mg/L)肉雞十二指腸中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都極顯著升高(P<0.01)。

圖6 PFOA對肉雞十二指腸中炎癥因子的影響

3 討論

PFOA的廣泛存在對全球環境和人類健康存在嚴重威脅[18]。近幾年研究發現,PFOA對機體的影響主要表現在生殖毒性[19]、神經毒性、腎臟毒性、心臟毒性和肝臟毒性等方面,而肝臟是機體最重要的代謝和解毒器官,也是PFOA毒性損傷作用的靶器官[20]。李丹陽等[21]研究妊娠期暴露PFOA對子代小鼠肝臟的損傷作用,發現PFOA可以極顯著增加子代小鼠肝臟指數,導致肝細胞腫大,并發生空泡變性。胥夢晨[22]研究發現,PFOA可導致小鼠肝臟腫大并產生氧化應激,進而造成肝臟損傷。大量研究表明,PFOA引起的肝臟毒性與過氧化物酶體增殖物激活受體及其下游功能密切相關[23-24]。目前,飲水和飲食是機體暴露于PFOA的主要途徑[25]。因此,本試驗通過在肉雞飲水中暴露不同質量濃度的PFOA,研究PFOA對肉雞肝臟和十二指腸的損傷作用。

肝臟是動物機體能量供應、物質代謝和轉換的主要器官。PFOA因其特殊結構,在體內難以降解,如果長期在機體中富集,就會對肝臟帶來負面影響。有研究表明,暴露于PFOA可以誘發肝臟炎癥,破壞抗氧化穩態,造成肝臟腫大,并最終導致肝臟損傷[26]。肝臟指數在一定程度上能夠反映動物機體的健康狀況。在本試驗中,與C組(0 mg/L)相比,PFOA組中肉雞肝臟指數逐漸增加;其中,Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)肝臟指數極顯著增加。AST主要存在于心肌、線粒體和肝細胞胞漿中,ALT主要分布在肝細胞胞漿中,因此,肝臟中AST和ALT的水平可以反映肝臟的受損程度。本試驗飲水中暴露PFOA后,肉雞肝臟中AST和ALT的活力隨著PFOA濃度的增加而上升。大量研究表明,PFOA能導致哺乳動物肝細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平上升[27-28]。當機體長時間暴露于高氧環境而導致ROS水平超過肝細胞抗氧化能力時,肝細胞就會遭受到氧化應激損傷。SOD、CAT和GSH-Px是機體清除自由基的抗氧化酶,在防止細胞氧化損傷方面起著重要的作用。MDA是機體脂質過氧化過程的最終產物,具有細胞毒性,其含量可以直接反映出機體脂質過氧化和細胞損傷的程度。本試驗結果顯示,暴露于PFOA肉雞的肝臟組織中SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶活性降低,MDA含量升高,這可能是因為PFOA在體內積累,誘導過量的ROS產生從而導致肝臟發生氧化損傷。

小腸是動物機體營養物質消化吸收的主要場所。腸黏膜的形態、結構和功能的完整性是維持腸道健康的有效屏障[29]。Rashid等[30]研究發現,給予CD1小鼠PFOA[1、5、10和20 mg/(kg·bw·d)]10 d后,小鼠的小腸和結腸組織中會積累大量的PFOA;與結腸相比,小腸中PFOA的蓄積水平更高,并且腸道上皮內層的結構完整性和功能受到影響。小腸絨毛是機體吸收營養的主要途徑,絨毛高度和隱窩深度是衡量腸道黏膜功能的重要指標:小腸絨毛高度越高,說明腸上皮細胞發育越好,可以增加與腸道內容物的接觸面積,促進消化酶的合成和分泌;小腸隱窩深度可以反映出上皮細胞的增殖速度,隱窩越淺,說明小腸上皮細胞增殖越快,有利于更好的吸收營養物質。本試驗結果顯示,在飲水中暴露PFOA可導致肉雞十二指腸絨毛高度變低、隱窩深度變深、絨毛高度與隱窩深度比值降低,并且絨毛腫脹,最終破壞了十二指腸的形態結構和功能。

炎癥反應是機體對各種刺激所發生的防御反應。通常來說,炎癥對機體是有益的:當機體受到損傷和感染時,可通過炎癥反應來促進組織的恢復,起到一種自我保護的作用。有研究表明,PFOA能夠增加肝臟中促炎因子IL-6的表達,從而誘導機體發生炎癥反應[31]。IL-1β主要由單核細胞產生,可引起機體局部發生炎癥反應。IL-6可由多種免疫細胞合成和分泌,影響著T細胞的分裂和B細胞的增殖,并且參與肝臟細胞和腸黏膜上皮細胞的免疫反應。TNF-α是目前發現的生物活性因子之一,主要由單核巨噬細胞產生,其可以促使一氧化氮和趨化因子等產生,加劇機體炎癥的發生。本試驗結果顯示,飲水中暴露PFOA會使肉雞肝臟和十二指腸中促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量升高,從而導致肝臟和十二指腸發生炎癥反應。

肉品質的測定主要包括肉色、pH、蒸煮損失、滴水損失和嫩度等指標。在指標測定中,L*表示亮度,L*值越低,顏色越淺,肉質越好;a*值表示肌肉的紅度;b*值表示肌肉的黃度。pH對肌肉的顏色、保質期和系水力等均有影響,是評價肉品質性狀的重要指標之一[32]。肌肉系水力是指肌肉保水能力,通常用蒸煮損失和滴水損失進行評估,一般蒸煮損失越低,系水力越高,肉質越好。本試驗結果顯示,飲水中暴露PFOA對肉色和pH無顯著影響,G組(1.5 mg/L)蒸煮損失顯著增加,說明PFOA會降低肉雞胸肌的保水性能。

目前,環境中存在的是PFAS的混合物,而不是單獨的物質,因此應更好地了解PFAS的聯合效應對我國畜禽業發展的影響。后續試驗應進一步探究PFAS暴露于飲水后對家禽生長性能、肉品質的影響以及在機體內殘留等問題。綜上所述,飲水中暴露PFOA會對肉雞的肝臟和十二指腸造成損傷,其中1.5 mg/L的PFOA會增加肉雞胸肌蒸煮損失,導致肉雞肝臟細胞損傷和炎癥反應,使抗氧化能力降低;且導致肉雞十二指腸絨毛變短、水腫和炎癥反應。