1例梅花鹿狂犬病的病理學診斷及其病原遺傳進化分析

高 雅,智 宇,張 迪,喬 蕾,邵國玉,丁玉林,葛金英,王金玲

(1.內蒙古農業大學獸醫學院,內蒙古 呼和浩特 010018;2. 農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室,內蒙古 呼和浩特 010018;3. 內蒙古自治區農牧業科學院,內蒙古 呼和浩特 010051;4. 內蒙古通遼市科爾沁區畜牧水產工作站,內蒙古 通遼 028000;5. 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001;6. 內蒙古自治區興安盟科爾沁右翼前旗動物疫病預防控制中心,內蒙古 科爾沁右翼前旗 137713)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的侵犯神經系統的一種人獸共患的自然疫源性疾病[1]。RABV是單股負鏈不分節段的RNA病毒,屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒屬(Lyssavirus)[2]。RABV的糖蛋白(Glycoprotein,G)能有效刺激機體產生中和抗體,與病毒的毒力和致病性有關,因此,G基因是檢驗不同病毒株之間關系的最好選擇[3]。核蛋白(Nucleoprotein,N)基因結構高度保守,因此,N基因經常作為病毒基因分型和進化的標準[4]。幾乎所有溫血脊椎動物都易感染RABV,但自然界中最易感染RABV的動物是犬科和貓科動物,以及一些翼手目動物(如蝙蝠)和一些嚙齒類動物[5]。野生動物(如狼、狐貍和鼬獾)是RABV的主要自然宿主。RABV對野生動物的危害是十分巨大的。在韓國[6]、阿根廷[7]和墨西哥[8]等國家均報告過鹿狂犬病病例,其感染與蝙蝠、浣熊和臭鼬有關。但是,目前世界范圍內缺乏野生動物狂犬病散發性病例的相關臨床數據。中國RABV分離株來源于6個進化分支,China Ⅰ、China Ⅱ、China Ⅴ、China Ⅵ屬于Asian譜系,China Ⅲ屬于Cosmopolitan譜系,China IV屬于Arctic-like譜系[9]。本試驗通過組織病理學檢查、直接免疫熒光法(Direct immunofluorescence assay,DFA)和免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)對導致1例梅花鹿病死病例的RABV進行鑒定,同時還進行了RABV分離毒株N和G基因的遺傳進化分析,以期為野生動物狂犬病的診斷和防控提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源 內蒙古自治區包頭市某鹿園共飼養梅花鹿60只,有10余只梅花鹿陸續死亡,其中有1只成年梅花鹿(病例號為IMAU No. 11189)死前有明顯的狂暴型神經癥狀,表現出流涎、流淚、結膜充血和食欲廢絕等癥狀。據飼養員介紹園內常有野狗出入。

1.2 主要試劑 95%酒精和無水乙醇,均購自天津風船化學試劑科技有限公司;二甲苯,購自天津市北聯精細化學品開發有限公司;熒光標記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體和狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠獲得的多克隆抗體,均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供;小鼠/兔通用型SAP試劑盒(貨號:SAP-9100),購自北京中杉金橋生物技術有限公司;胰酶抗原修復液,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;病毒DNA/RNA提取試劑盒、一步法逆轉錄PCR試劑盒和DL-2 000 DNA Marker,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 組織脫水機(Tissue-TeK?VIPTM5 Jr)、組織包埋機(Tissue-TeK?TECT)、水平切片機和烤片機(Tissue-TeK Slide Warmer PS-53),均購自日本Sakuar櫻花公司;展片機,購自德國Leica公司;染色機(Varistain Gemini 371)和蓋片機(Clearvue),購自Thermo Scientific公司;PCR擴增儀(C1000 TouchTM)和全自動凝膠成像分析儀(GelDoc),均購自Bio-Rad公司;電泳儀(DYY-6D),購自北京六一生物科技有限公司;光學顯微鏡(CX40),購自德國萊卡儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 剖檢病變觀察 觀察園區內情況,通過問診飼養員了解發病鹿病史,觀察并記錄發病鹿的臨床癥狀,并對1例發病死亡的梅花鹿進行系統的病理剖檢。

1.4.2 組織病理學檢查 剖檢時取腦、肝臟、肺臟、淋巴結和脾臟等主要的組織器官,立即放入固定液中固定。同時取小腦組織放入-80 ℃冰箱保存備用。將固定好的組織制作成石蠟切片,經蘇木素-伊紅(Hematoxylin eosin,H.E.)染色后于顯微鏡下觀察。

1.4.3 DFA檢測 取1.4.2中制備的梅花鹿小腦組織石蠟切片,按照DFA常規步驟進行[10],以正常梅花鹿的小腦組織作為陰性對照。

1.4.4 IHC檢測 取1.4.2中制備的梅花鹿小腦組織石蠟切片,切片厚4 μm,用75%乙醇梯度脫蠟和水化,0.1%胰酶抗原修復液進行抗原修復,按照小鼠/兔通用型SAP試劑盒說明書,依次滴加內源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清封閉,使用一抗(狂犬病病毒ERA株弱毒疫苗免疫小鼠獲得的多克隆抗體)4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液洗去一抗后,依次滴加生物素標記山羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液。陰性對照使用PBS代替一抗,二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.4.5 PCR擴增 根據NCBI上已發表RABV序列KC193267設計N和G基因特異性引物(表1),交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取梅花鹿小腦組織RNA。對提取的RNA進行N和G基因一步法反轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)鑒定。PCR擴增體系:2×One Step Mix 25 μL,One Step Enzyme Mix 2.5 μL,上、下游引物各2 μL,RNA模板2 μL,用RNase Free dH2O補足至50 μL。PCR擴增程序:反轉錄50 ℃ 30 min,預變性95 ℃ 3 min;變性94 ℃ 30 s、退火50 ℃ 30 s、延伸 72 ℃ 2 min,共30個循環;72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列信息

1.4.6 RABVN和G基因的遺傳進化分析 將1.4.5的陽性PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行N和G基因測序。測序結果用Mega 6生物分析軟件的最大似然法(Maximum likelihood method),通過1 000次重復計算引導值構建系統發育樹,使用DNASTAR 5.0軟件分析比較試驗獲得RABV序列與參考毒株序列的核苷酸同源性。

2 結果

2.1 剖檢病變觀察 對發病死亡的梅花鹿進行病理剖檢,可見腦水腫明顯,腦脊液增多,腦膜靜脈充血擴張(圖1A),腦干切面彌散分布針尖大小的出血點(圖1B)。其他組織器官眼觀無明顯病變。

圖1 病死梅花鹿腦組織剖檢病變觀察

2.2 病理組織學檢查 病死梅花鹿腦充血和水腫,呈現典型的非化膿性腦炎,可見大量以血管為中心的出血灶(圖2A)。部分腦神經細胞變質,偶見大量淋巴細胞和少量巨噬細胞呈圍管性浸潤,形成淋巴細胞性“管套”病變(圖2B)。在腦組織神經細胞的胞漿內可見大小不等的、嗜酸性圓形或橢圓形的RABV包涵體,特別是在小腦浦肯野細胞(圖2C藍色箭頭)、大腦錐體細胞(圖2D藍色箭頭)、大腦多形細胞、海馬多形細胞、錐體細胞和脊髓多極運動神經元胞漿內。肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結和腎臟等實質器官出現充血和出血性變化。

圖2 病死梅花鹿腦組織病理組織學變化(H.E.染色)

2.3 DFA檢測 結果顯示,在陰性對照成立的情況下,在病死梅花鹿的小腦組織中檢測到大量特異性的亮綠色的RABC抗原陽性信號(圖3)。

圖3 DFA檢測病死梅花鹿小腦組織(A)和陰性對照(B)中狂犬病病毒抗原(400×)

2.4 IHC檢測 結果顯示,在病死梅花鹿的小腦浦肯野細胞的胞漿內檢測到大小不等的、圓形或橢圓形的典型的棕色RABV抗原的特異性陽性信號(圖4)。

圖4 IHC檢測病死梅花鹿小腦組織(A)和陰性對照(B)中狂犬病病毒抗原(400×)

2.5 PCR擴增 PCR擴增得到1 675和1 424 bp大小的目的條帶(圖5),符合預期產物大小,將該RABV分離株命名為NM Deer 01。

圖5 病死梅花鹿腦組織RABV G和N基因的PCR擴增

2.6 RABVN基因的遺傳進化分析 通過Mega 6和DNASTAR 5.0軟件對本試驗獲得RABV分離毒株N和G基因序列與參考毒株進行遺傳進化分析。N基因核苷酸序列分析結果顯示,病毒NM Deer 01同2019年河南犬源毒株(MK567666)、2019年甘肅羊源毒株(MK577649)、2015年湖北牛源毒株(KR230090)、2009年福建犬源毒株(FJ866835)、2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2014年山東犬源毒株(JQ970486)位于同一分支,均屬于Asian譜系;NM Deer 01毒株與2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2015年湖北牛源毒株(KR230090)核苷酸同源性最高,均為99.5%,與其他參考毒株核苷酸同源性介于86.4%～99.5%(圖6)。

圖6 基于梅花鹿源RABV N基因構建的遺傳進化樹

2.7 RABVG基因的遺傳進化分析G基因核苷酸序列分析結果顯示,病毒NM Deer 01同2019年河南犬源毒株(MK567666)、2019年甘肅羊源毒株(MK577649)、2015年湖北牛源毒株(KR230090)、2009年福建犬源毒株(FJ866835)、2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)和2014年山東犬源毒株(JQ970486)位于同一分支,均屬于Asian譜系;NM Deer 01毒株與2014年山東犬源毒株(JQ970486)和2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)同源性最高,均為99.3%,與其他參考毒株核苷酸同源性介于83.0%～99.3%(圖7)。

圖7 基于梅花鹿源RABV G基因構建的遺傳進化樹

3 討論

動物狂犬病的臨床表現可分為狂暴型和麻痹型2種[11]?？癖┬捅憩F為極典型的神經癥狀,如興奮、具有攻擊行為,后期會引起咽肌局部發生痙攣或全身肌肉麻痹而造成死亡。而麻痹型狂犬病發病動物從發病初期至死亡一直表現為精神沉郁[12]。本試驗中的病死梅花鹿有流涎、亂跑、頂人和亂撞等明顯的神經癥狀,可判斷該鹿表現為狂暴型?？袢〔煌呐R床類型表現與咬傷部位感染的病毒量和毒株的種類不同有關[13]。

狂犬病的病理組織學診斷標準是在腦神經細胞胞漿內觀察到嗜酸性包涵體,即內基氏小體(Negri body),這種小體主要分布于大腦皮層和海馬回椎體細胞、小腦浦肯野細胞和基底核、脊神經核以及交感神經節等處神經細胞的胞質內[14]。本試驗病死梅花鹿除非化膿性腦炎病變外,在腦組織多數神經細胞胞漿內均發現了典型的嗜酸性RABV包涵體。DFA是世界衛生組織(World Health Organization,WHO)推薦的狂犬病實驗室診斷方法,我國也將此法作為檢測狂犬病的首選方法,該方法具有特異性高、靈敏度強的優點[15]。有研究表明,犬和貓的大腦海馬是RABV檢測的最佳部位;牛在腦干部檢測RABV效果最明顯,其次在小腦;頸脊髓和靠近腦干的區域是馬屬動物檢測RABV抗原的最好部位;浣熊和臭鼬在腦組織的各個部位都可檢測到RABV[16]。本試驗病死梅花鹿采用DFA和IHC均在小腦組織中檢測到RABV特異性陽性信號。

鹿主要通過被帶毒犬咬傷以及在放牧、交配爭斗和鋸鹿角時損傷而感染RABV[17]。有報道顯示,我國自1950年以來,鹿狂犬病在部分地區的發病率高達30%,多出現于一些養殖場和養殖戶中[18]。野生鹿群感染狂犬病大多數由于與蝙蝠、浣熊和臭鼬接觸或鹿群的飲水和飼料被RABV污染。本試驗根據對現場環境調查結合問診園內獸醫得知,鹿園內常有流浪犬進出引起鹿群不安,個別梅花鹿身體上出現過咬傷,因此推測本例梅花鹿發生狂犬病與被帶毒流浪犬咬傷密切相關。RABV從傷口處進入并繁殖,然后通過逆行軸突運輸到中樞神經系統,導致大腦或脊髓發生炎癥;RABV在中樞神經系統中經過一段時間的復制后,病毒粒子可通過軸突進入唾液腺,從而很容易地完成傳播周期并感染下一個新的易感宿主[19]。

亞洲和非洲是狂犬病的高發地區,RABV在人、寵物、家畜和野生動物之間不斷循環感染[20]。截至2014年,內蒙古地區共報道了30多種動物患狂犬病,包括狗、貉、紅狐、牛、羊和駱駝等[21]。2018年,于明洋等[22]報道了2014—2016年內蒙古地區5起野生狐貍、牛、駱駝和犬的狂犬病疫情,對6株RABVN基因序列進行遺傳進化分析,結果顯示,6株毒株均屬于Cosmopolitan譜系草原型RABV,該型毒株廣泛在俄羅斯、蒙古和哈薩克斯坦的野生狐貍和狼群中傳播。2022年,Feng等[23]報道了2019—2021年內蒙古地區家畜和野生食肉動物(狐貍、獾和浣熊)的狂犬病發生情況,并對80株RABVN基因序列進行遺傳進化分析,結果顯示,97.5%的病毒株屬于Cosmopolitan譜系草原型,其余毒株屬于Arctic-related譜系和Asian譜系。2011年,Shao等[24]報道了內蒙古地區5例浣熊狂犬病病例,對RABVN基因和G基因的遺傳進化分析顯示,分離毒株與俄羅斯遠東地區和韓國分離的Arctic-like譜系RABV密切相關,但不同于中國流行地區廣泛分布的Asian譜系RABV。不同于上述文獻對內蒙古地區野生動物RABV譜系的報道,本試驗對病死梅花鹿的N和G基因序列進行遺傳進化分析,結果顯示,分離毒株NM Deer 01的N和G基因均與2015年呼和浩特牛源毒株(KC193267)同源性最高,從基因層面上證明了該梅花鹿感染了RABV,分離毒株的N和G基因同呼和浩特、河南、甘肅、山東、湖北和福建等地毒株位于同一分支,同屬于Asian譜系,這與該鹿園與呼和浩特、河南、甘肅和山東的地理位置較近有關。依據疾病發生的時間和位置,推測該病毒有從北方逐漸向南方擴散蔓延的趨勢。

近年來,RABV依舊在世界范圍內不斷感染野生動物和家畜,因此,對動物狂犬病進行防治十分必要。建議本試驗中的鹿場加強飼養管理,將鹿園周圍圍欄加裝細鐵絲網,以防再有流浪犬進入鹿園;立即對未感染鹿群集體注射狂犬病疫苗,公梅花鹿2.5～3.5 mL/頭,母梅花鹿2.5 mL/頭[25];患病鹿立即處死,焚燒或緊急接種治療;病死鹿尸體立即焚燒,禁止取皮或食用;飼養人員也應盡早注射狂犬病疫苗,以防人員感染。