新疆阿克蘇地區鴨源雞桿菌的分離鑒定和生物學特性分析

郝 斌,張家浩,黎 雙,李雪嬌,陳 鑫,劉淑華,梁樊鑫,侯夢哲,李蓮瑞

(1. 塔里木大學動物科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300;2. 塔里木畜牧科技兵團重點實驗室,新疆 阿拉爾 843300;3. 新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室,新疆 阿拉爾 843300)

鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis,G.anatis)屬于巴氏桿菌科、雞桿菌屬[1-2],是一種條件性致病菌,其致病潛力高度可變[3],且不同菌株的致病力存在較大差異。該菌主要影響禽類的生殖器官和呼吸道,常引起雞輸卵管囊腫等生殖道疾病[4],可導致蛋雞產蛋量出現斷崖式下跌,并引起蛋品質下降,嚴重可造成雞只死亡,給養雞業的健康發展造成了極大的安全隱患,對歐洲、亞洲等家禽產業的生產力產生了嚴重影響[5]。G.anatis可感染多種宿主,不僅能感染禽類,而且可感染豬、牛、羊等動物和人類[6-7]。

G.anatis最早由Kjos-Hansen于1950年報道[8],而后世界范圍內相繼報道了G.anatis的發生和感染[9-10]。我國對G.anatis的研究報道較晚,最早是由王川慶等[11]于2008年通過對國內12個雞場G.anatis進行抗體檢測,發現所檢雞場均有G.anatis感染,平均陽性率為48.4%,表明我國雞群中普遍存在G.anatis感染。2003年,Bojesen等[12]在不同雞群的健康雞中檢測出G.anatis;2009年,國內鄭鹿平等[13]從河南地區健康雞群中分離得到G.anatis,提示該菌對健康雞群有潛在的威脅。鄭鹿平[14]和李喬晶[15]通過SPF雞同居感染試驗發現,健康雞只與感染G.anatis雞只同居后2 d,即可從上腭裂和泄殖腔分離出G.anatis,并可長期、持續帶菌和排菌。

G.anatis可引起家禽輸卵管炎和卵巢炎等疾病,是影響養禽業的一種重要病原菌。目前,國內對G.anatis耐藥狀況的報道較少,臨床用藥缺乏可靠的理論依據和參考標準。2007年,王川慶等首次對60株G.anatis進行藥敏試驗,分離菌僅對頭孢類、阿莫西林、氨芐西林和氟苯尼考等藥物高度敏感,而對其余大多數抗菌藥物均不敏感[11]。而后我國多地都相繼出現G.anatis耐藥性的報道,鄭鹿平等[13-14]、李喬晶[15]、方翟等[16]、陳國權等[17]和唐詩等[18]的研究均表明,G.anatis分離菌株普遍存在多重耐藥現象。

新疆維吾爾自治區阿克蘇地區某雞場120日齡開產蛋雞出現精神沉郁、腹部隆突、喜臥、厭食、嗜睡和行走步態不穩等癥狀,部分雞只存在病死情況。剖檢病死雞可見輸卵管炎和腹膜炎等癥狀,懷疑G.anatis感染。目前,新疆地區G.anatis感染和耐藥性的報道尚不多見。本試驗從病死雞的內臟中分離和鑒定G.anatis,并對其病原學和耐藥性進行分析,為G.anatis感染的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 隨機選取2只癥狀明顯的病雞,無菌采集其內臟,放于-4 ℃保存。

1.2 試驗動物 10只23周齡健康海蘭褐蛋雞和15只1日齡SPF級BWEL雛雞,均購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物實驗中心[許可證編號:SCXK(黑)2017—005],身體健康,表現出較強的活力,采集每只雞的泄殖腔拭子和咽拭子樣本進行細菌分離,所有試驗雞只G.anatis檢測均為陰性。

1.3 主要試劑 革蘭染液、生化反應管、藥敏紙片和Mueller-Hinton(MH)培養基,均購自杭州天和微生物試劑有限公司;DNA Marker,購自TaKaRa公司;綿羊血瓊脂固體培養基、Brain Heart Infusion(BHI)固體培養基和Brain Heart Infusion(BHI)液體培養基,均購自青島海博生物技術有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 主要儀器 凝膠成像儀,購自美國Bio-RAD公司;PCR儀,購自英國TECHNE公司;加熱制冷循環器,購自德國JULABO Labortechnik Gmbh公司;穩壓穩流電泳儀,購自北京市六一儀器廠;核酸蛋白檢測儀,購自美國丹諾爾Denovix公司。

1.5 試驗方法

1.5.1 細菌的分離和純化 無菌采集病雞的肝臟、肺臟和輸卵管等病變組織,劃線接種于綿羊血瓊脂固體培養基和BHI固體培養基進行純化培養,37 ℃培養24 h后,選取單一形態的單菌落進行革蘭染色和鏡檢。

1.5.2 分離菌株的生化鑒定 選取硫化氫、葡萄糖等生化反應管,按照說明書對分離菌株進行生化鑒定。

1.5.3 分離菌株的PCR檢測 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的DNA,經核酸蛋白檢測儀檢測OD260 nm/280 nm以判定提取的DNA是否合格。參照參考文獻[19]合成細菌16S rRNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。預期擴增產物長度約為1 400 bp。PCR擴增體系:DNA模板1 μL,EasyTaqSuperMix 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 0.5 min,56 ℃ 0.5 min,72 ℃ 1.5 min,共35個循環;72 ℃ 10 min。將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.5.4 分離菌株16S rRNA序列比對和系統進化樹分析 將測序獲得的分離菌株完整序列在NCBI中GenBank數據庫進行序列比對[20],采用DNASTAR軟件繪制系統進化樹。

1.5.5 分離菌株的藥物敏感性試驗 根據KB紙片法,將適量菌液涂布于MH培養基,再將藥敏紙片貼于培養基上,37 ℃培養24 h后,測量17種抗菌藥物的抑菌圈直徑,根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的標準判定結果。

1.5.6 動物回歸試驗 試驗前使用高錳酸鉀對恒溫室進行消毒處理[21],將所有試驗雞只在恒溫室飼養7 d適應環境。將分離菌株的單菌落接種于BHI液體培養基,使其濃度達到3×108CFU/mL,再用PBS將分離菌株原菌液依次稀釋至3×107和3×106CFU/mL。

1.5.6.1 海蘭褐蛋雞回歸試驗 給予所有海蘭褐蛋雞相同的生活環境、食物和水源,適應飼養7 d后,將海蘭褐蛋雞(編號為1～10)隨機分為2個組。編號1～5為試驗組,分別經生殖道接種0.2 mL濃度為3×108CFU/mL的菌液;編號6～10為對照組,分別經生殖道接種0.2 mL的0.9%生理鹽水(表1)。每日早、晚觀察對照組和試驗組海蘭褐蛋雞的臨床表現,連續觀察10 d。每日采集對照組和試驗組海蘭褐蛋雞泄殖腔拭子和咽拭子樣本進行細菌分離,對照組海蘭褐蛋雞隔離飼養。試驗結束后將所有海蘭褐蛋雞剖檢。

表1 試驗設計

1.5.6.2 雛雞回歸試驗 給予所有雛雞相同的生活環境、食物和水源,適應飼養7 d后,將雛雞(編號為1～15)隨機分為2個組。編號1～3、4～6和7～9分別為試驗組1、試驗組2和試驗組3,分別經腹腔接種0.2 mL濃度為3×106、3×107和3×108CFU/mL的菌液;編號10～12和13～15分別為同居組和對照組,分別經腹腔接種0.2 mL的0.9%生理鹽水(表1)。每日早、晚觀察試驗組、同居組和對照組雛雞的臨床表現,連續觀察10 d。每日采集對照組和試驗組雛雞泄殖腔拭子和咽拭子樣本進行細菌分離,從試驗組分離出G.anatis后將試驗組雛雞與同居組雛雞混合飼養,每日對同居組雛雞同上進行細菌分離[15],對照組雛雞隔離飼養。試驗結束后將所有雛雞剖檢。

2 結果

2.1 細菌的分離和純化 分離菌株在BHI固體培養基培養24 h后,呈圓形的乳白色菌落;在綿羊血瓊脂固體培養基上呈半透明、圓形、灰白色、β溶血的小菌落。分離菌株革蘭染色呈陰性,為兩端鈍圓、單個或成對分布的桿狀菌(圖1)。

圖1 分離菌株的革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.2 分離菌株的生化鑒定 結果見表2,參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[22],該分離菌株生化特性與G.anatis相符。

表2 分離菌株的生化鑒定

2.3 分離菌株的PCR檢測 提取分離菌株的DNA,經檢測OD260 nm/280 nm值均為1.8～2.0,經16S rRNA基因PCR擴增,可擴增約為1 400 bp的目的條帶(圖2)。

圖2 分離菌株16S rRNA的PCR擴增

2.4 分離菌株16S rRNA序列比對和系統進化樹分析 分離菌株與GenBank中收錄的G.anatis同源性最高,均在99.4%以上,處于同一進化分支(圖3)。綜合判定分離菌株為G.anatis,將其命名為HZ-PJS2022。

圖3 基于分離菌株16S rRNA構建的系統進化樹

2.5 分離菌株的藥物敏感性試驗 結果如表3所示,分離菌株對紅霉素、苯唑西林、復方新諾明、米諾環素、磺胺甲噁唑、多西環素、四環素、氯霉素、克林霉素和環丙沙星耐藥;對慶大霉素、新霉素和丁胺卡那霉素中度敏感;對氨芐西林、頭孢呱酮、頭孢吡肟和恩諾沙星敏感。

表3 分離菌株的藥物敏感性試驗

2.6 動物回歸試驗

2.6.1 海蘭褐蛋雞回歸試驗 試驗組海蘭褐蛋雞于感染后第2天均表現精神萎靡、采食量下降;感染后第7天,采食量進一步下降,出現縮頭閉眼、嗜睡癥狀,個別海蘭褐蛋雞生殖道外翻困難、拉黃色泡沫樣稀糞。試驗結束后剖檢所有海蘭褐蛋雞,結果顯示,試驗組海蘭褐蛋雞均出現程度不一的生殖系統病變,卵泡充血、變形和液化,破裂后卵黃跌入腹腔形成腹膜炎,輸卵管發炎、囊腫、積液、內有白色干酪物和炎性分泌物(圖4A和4B),與發病雞場病雞的剖檢變化一致,其他臟器無異常;對照組海蘭褐蛋雞均無異常。采集試驗組海蘭褐蛋雞的肝臟、卵泡和輸卵管進行細菌分離和純化,與原分離菌株的菌落形態和革蘭染色特征相同(圖4C)。攻菌后試驗組海蘭褐蛋雞日產蛋率在100%～60%波動,第6、7 天產蛋率最低,并維持在60%;產蛋中后期個別海蘭褐蛋雞所產雞蛋的蛋殼質量差,皮薄且易碎。

圖4 分離菌株的動物回歸試驗

2.6.2 雛雞回歸試驗 雛雞感染后12 h,試驗組1雛雞縮頸閉目、精神萎靡、呆立,對外界刺激有反應;試驗組2和試驗組3雛雞站立不穩、食欲廢絕、對外界刺激不敏感;感染后24 h,試驗組2和試驗組3雛雞全部死亡,試驗組1雛雞蹲伏嗜睡、縮頸閉目、羽毛蓬松且零亂;而后雛雞上述癥狀逐漸恢復,至試驗結束無死亡。對死亡雛雞剖檢,可見肝臟、脾臟、腺胃、肌胃和腸道黏膜出血,輸尿管尿酸鹽沉積等病理變化(圖4D)。采集死亡雛雞的肝臟、卵泡和輸卵管進行細菌分離和培養,可再次分離出G.anatis。試驗組2和試驗組3在人工感染后第2天從上顎裂分離出G.anatis,同居組和試驗組1分別在同居第2天和人工感染后第4天從上顎裂分離出G.anatis。在整個試驗過程中,對照組雛雞均未分離出G.anatis。

3 討論

自1950年G.anatis被Kjos-Hansen[7]首次分離報道至今,NCBI中GenBank數據庫僅收錄30余株G.anatis的全基因組序列。目前,國內對G.anatis的研究報道較少,本試驗結果表明,新疆維吾爾自治區雞群存在G.anatis感染。

G.anatis是一種機會致病菌,常與禽肺病毒、雞毒支原體等病原混合感染[23],并可導致感染加劇。Christensen等[24]報道顯示,在對G.anatis進行分離和純化時,經常會受到大腸桿菌等其他細菌的影響。該菌培養條件較苛刻,在普通瓊脂、麥康凱、伊紅美蘭、三糖鐵和SS等培養基上均不生長,在LB液體培養基中生長不良,在綿羊血瓊脂和BHI固體培養基上生長良好。而大腸桿菌等其他細菌相較于G.anatis,在分離培養細菌時具有明顯的生長優勢,因此容易覆蓋G.anatis。另外,G.anatis形成的菌落較小,往往容易被忽視,從而降低了其分離率,這可能是G.anatis沒有引起足夠重視的原因之一。另一原因是G.anatis導致的輸卵管炎和腹膜炎等癥狀,常被誤認為由其他原因引起,如霉菌毒素、衣原體感染和玉米赤霉烯酮等[25]。

G.anatis通常存在于輸卵管、氣管、腸道和泄殖腔中,以水平傳播為主[26]。鄭鹿平[14]和李喬晶[15]的研究結果證明,健康雞只與感染G.anatis雞只同居后2 d,即可從上腭裂和泄殖腔分離出G.anatis,并可長期、持續帶菌和排菌,與本試驗結果一致。有研究報道顯示,從感染G.anatis的病雞所產蛋中能夠分離到G.anatis[20,27],說明該菌還可以垂直傳播,這對養禽業影響很大。而目前養雞生產主要以籠養為主,這就意味著雞舍中一旦存在G.anatis,全群都有被感染的風險。Bojesen等[27]研究表明,雞隱性感染G.anatis時,其主要存在于雞的上呼吸道,生殖系統幾乎不存在。若雞因應激等原因導致抵抗力下降時,該菌則可入侵生殖系統,引起嚴重的生殖障礙疾病。故加強對未開產蛋雞體內G.anatis的檢測,做好飼養管理和生物安全措施,對降低G.anatis感染和提高養殖經濟效益具有重要意義。

G.anatis的血清型眾多,且各血清型之間無交叉免疫保護作用,加上其具有多重耐藥性,感染率高而發病率低,病例的發生無規律可循[28],導致對該菌感染的防治十分棘手。本試驗中G.anatis分離菌株存在多重耐藥性,在以往的研究中也有類似的結果[13-18]。藥敏試驗結果顯示,分離菌株HZ-PJS2022對紅霉素、苯唑西林、復方新諾明、米諾環素、磺胺甲噁唑、多西環素、四環素、氯霉素、克林霉素和環丙沙星耐藥;對氨芐西林、頭孢呱酮、頭孢吡肟和恩諾沙星敏感。結合以往研究可知,我國G.anatis已對常用的多種抗菌藥物產生了廣泛的耐藥性。海蘭褐蛋雞回歸試驗和雛雞回歸試驗結果顯示,該分離菌株可在雞體內存活,引起蛋雞生殖系統疾病,造成產蛋率下降,并有較強的致病性。

綜上所述,本試驗從新疆維吾爾自治區阿克蘇地區某雞場病雞內臟中分離出1株G.anatis,藥敏試驗表明分離菌株具有多重耐藥性,可以使用氨芐西林、頭孢呱酮、頭孢吡肟和恩諾沙星進行治療。