草蓯蓉顆粒提取和成型工藝優化

于 歡,宮敬利,張曉美,吳 迪,馬瑩慧,張慧鋒

(吉林醫藥學院藥學院,吉林 吉林 132013)

草蓯蓉[Boschniakiarossica(Cham. et Schlecht.) Fedtsch.]為列當科草蓯蓉屬寄生肉質草本植物,在中國、印度、日本、韓國和俄羅斯均有分布[1-2]?，F代研究表明,草蓯蓉具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗肝纖維化、保肝和抗氧化活性[3]。草蓯蓉全草入藥可作為中藥肉蓯蓉的代用品,有補腎壯陽、潤腸通便之效,主治腎虛陽萎、腰關節冷痛、便秘等。據文獻記載,肉蓯蓉可以用于牛前胃病的治療,作為肉蓯蓉的代用品,草蓯蓉也具有類似的功效,并且相較肉蓯蓉而言可及性更好[4]。質量源于設計(Quality by design,QbD) 理念是通過試驗設計確定生產工藝的關鍵質量屬性(Critical quality attributes,CQAs) 與關鍵工藝參數(Critical process parameters,CPPs) 之間的關系模型,建立能夠確保產品質量的生產過程輸入和過程參數組合的范圍,從而實現對產品品質和穩定性的控制[5-8]。將制藥過程由基于固定工藝參數的操作方式過渡到對工藝參數范圍的準確控制中,將藥品生產中對經驗操作的依賴轉化為對工藝參數的精準把握,從而保證產品質量穩定[9]。

質量控制和質量評價是制約中藥制劑現代化發展的關鍵因素之一。由于中藥本身的復雜性,結合研究思路和方法、科學技術條件等因素的局限性,現行中藥制劑的質控模式和方法難以對中藥制劑的質量進行有效控制和評價,更難以反映其安全性和有效性[10]。本試驗以QbD 理念為指導,采用單因素試驗結合Box-Behnken 設計響應面法對草蓯蓉顆粒的提取和成型工藝參數進行優化,旨在確保顆粒均一、穩定、安全和可控,從而為顆粒的成型工藝過程和質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 DS-Y400A型中藥粉碎機(上海頂帥電器有限公司);KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲波有限公司);ML203型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-600型數顯恒溫水浴鍋(常州市金壇友聯儀器研究所);DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 主要材料和試劑 草蓯蓉藥材干品,購自吉林市當地藥材市場,經吉林醫藥學院藥學院李景華教授鑒定為正品;糖粉、糊精、乳糖和可溶性淀粉,均為藥用級輔料,均購自北京鳳禮精求商貿有限責任公司;用水為實驗室自制超純水;其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 草蓯蓉浸膏提取工藝優化

1.3.1.1 草蓯蓉浸膏的制備 稱取粉碎的草蓯蓉藥材干品,按照Box-Behnken設計響應面法設計條件進行水提[11],合并提取液,減壓濃縮即得草蓯蓉浸膏。根據公式(1)計算浸膏得率。

(1)

1.3.1.2 Box-Behnken 設計響應面法優化提取工藝 采用Design-Expert 10 軟件,根據Box-Behnken 設計響應面法,以提取時間(A)、液料比(B)和提取次數(C) 為考察因素,以浸膏得率為響應值,設計進行三因素三水平的試驗(表1)。

表1 提取工藝因素水平

1.3.2 草蓯蓉顆粒成型工藝優化

1.3.2.1 草蓯蓉顆粒的制備 精密稱取草蓯蓉浸膏和輔料適量,充分混勻,噴適量乙醇作為潤濕劑,制備軟材,使之呈現“握之成團,輕觸即散”的狀態,然后以14 目篩制粒,65 ℃下常壓干燥1.5 h,經過1和5號篩篩選即得草蓯蓉顆粒。

1.3.2.2 草蓯蓉顆粒合格率測定 參照《中華人民共和國藥典》(2020 版)通則0982 第二法雙篩分法測定草蓯蓉顆粒合格率。將干燥后的草蓯蓉顆粒稱重,依次過1和5號篩,能通過1號篩但不能通過5號篩的顆粒即為合格顆粒,按照公式(2)計算顆粒合格率。

(2)

1.3.2.3 草蓯蓉顆粒溶化性測定 按照《中華人民共和國藥典》(2020 版)通則0104 所載“可溶顆粒檢查法” 測定草蓯蓉顆粒溶化性。稱取10 g草蓯蓉顆粒,加(75±2) ℃熱水200 mL,攪拌,測定全部顆粒溶化所需時間。如5 min 后仍有顆粒不能完全溶解,則顆粒溶化性不合格。

1.3.2.4 草蓯蓉顆粒吸濕率測定 稱取2 g 草蓯蓉顆粒,于60 ℃鼓風干燥箱中干燥24 h至恒重,將其置于干燥稱量瓶中,分布均勻,打開蓋放在底部盛有NaCl 飽和溶液的干燥器中,將干燥器密封,48 h后精密稱重,按公式(3)計算草蓯蓉顆粒吸濕率。

吸濕率(%)=

(3)

1.3.2.5 草蓯蓉顆粒感官評價 在草蓯蓉顆粒處方優化過程中,選擇以軟材狀態、顆粒外觀、溶液狀態和顆粒氣味作為感官評價的內容[12-13],感官評分標準見表2。

表2 感官評分標準[12-13]

1.3.2.6 草蓯蓉顆粒質量相關指標分析 本試驗采用顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評價作為指標,這4個指標具有不同的量綱和量綱單位,為了避免指標間的量綱影響,需要對數據進行標準化處理。根據 Hassan公式對指標進行歸一化處理[14],取值越大越好的指標按照公式(4)計算歸一化值(di),取值越小越好的指標按照公式(5)計算di。

di=(Yi-Ymin)÷Ymax-Ymin

(4)

di=(Ymax-Yi)÷Ymax-Ymin

(5)

式中Yi為實測值,Ymax和Ymin系每個指標在不同次試驗中測得的所有值中的最大值和最小值。

計算出各指標的d值后,按照公式(6)計算總評歸一值(Overall desirability normalization,OD值)。

OD=(d1×d2…×dn)÷n

(6)

式中n為指標數。

1.3.2.7 填充劑種類對顆粒質量的影響 顆粒常用的填充劑有糖粉、糊精、乳糖和可溶性淀粉等,綜合考慮制粒的吸濕率和成型度問題,本試驗采用麥芽糊精、糖粉、乳糖和可溶性淀粉共4種填充劑,按照1.3.2.1項方法制備草蓯蓉顆粒,以OD值進行評價。

1.3.2.8 填充劑配比對顆粒質量的影響 選擇不同配比的乳糖和糊精作為混合填充劑,按照1.3.2.1項方法制備草蓯蓉顆粒,以OD值進行評價。

1.3.2.9 浸膏用量對顆粒質量的影響 選擇3∶1的乳糖和糊精作為混合填充劑,逐步增加浸膏用量,按照1.3.2.1項方法制備草蓯蓉顆粒,以OD值進行評價。

1.3.2.10 潤濕劑濃度對顆粒質量的影響 選擇3∶1的乳糖和糊精作為混合填充劑,浸膏用量為6%,以不同濃度乙醇作為潤濕劑,按照1.3.2.1項方法制備草蓯蓉顆粒,以OD值進行評價。

1.3.2.11 Box-Behnken設計響應面法優化草蓯蓉顆粒成型工藝 在單因素考察的基礎上確定填充劑配比、浸膏用量和潤濕劑濃度是影響顆粒質量的關鍵因素,各因素設置3個水平進行因素水平設計(表3)。以草蓯蓉顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評價的OD值為評價指標Y進行試驗。

表3 成型工藝因素水平

2 結果

2.1 草蓯蓉浸膏提取工藝優化

2.1.1 Box-Behnken設計響應面法優化提取工藝 結果見表4,各因素對草蓯蓉浸膏得率的回歸方程Y=26.14+0.77×A+0.80×B+0.37×C-1.03×AB-1.48×AC-0.16×BC-2.52×A2-1.76×B2-2.84×C2(R=0.956)。

表4 Box-Behnken 設計響應面法優化草蓯蓉提取工藝試驗設計和結果

對模型的分析結果如表5所示,回歸模型顯著度高(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),相關系數R=0.956,說明回歸方程擬合度和可信度適當,該模型能夠分析草蓯蓉浸膏得率與相應提取因素之間的關系,模型與實際情況擬合較好,適用于分析和預測草蓯蓉浸膏得率的實際情況。分析可知,提取時間(A)和液料比(B)對浸膏得率影響顯著(P<0.05),提取次數(C)對浸膏得率的影響相對較弱(P>0.05);交互項AB和AC對浸膏得率影響顯著(P<0.05),二次項均對浸膏得率有明顯影響(P<0.05);各因素對浸膏得率的影響順序為液料比(B)>提取時間(A)>提取次數(C)。

表5 Box-Behnken設計響應面法方差分析(Ⅰ)

2.1.2 草蓯蓉浸膏得率工藝Box-Behnken設計響應面法分析 影響草蓯蓉浸膏得率自變量與因變量關系的等高線和響應面曲線見圖1。響應面曲線的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對浸膏得率的影響,曲面越陡峭說明因素間的交互作用越顯著;交互效應的強弱可以從等高線的形狀得出,等高線形狀越接近圓形則兩因素的交互作用越弱。由圖1可知,各因素對綜合評分的影響交互項強弱順序為AC>AB>BC,這一結果與2.1.1中方差分析的結果一致。

圖1 各因素對草蓯蓉浸膏得率影響的響應面曲線和等高線

2.1.3 浸膏得率回歸模型驗證 采用Design-Expert 10軟件預測草蓯蓉浸膏最優提取工藝參數為:提取時間62 min,液料比10.4∶1,提取次數2次?？紤]到實施工藝參數的實際可操作性,將最佳工藝條件修正為:提取時間60 min,液料比10∶1,提取次數2次。為檢驗修正后工藝參數的合理性,在此條件下進行3次平行驗證試驗,經模型預測浸膏得率為26.14%,驗證試驗浸膏得率平均為(25.96±0.59)%,觀察值和模型預測值比較接近,說明模型預測性良好。

2.2 草蓯蓉顆粒成型工藝優化

2.2.1 填充劑種類對顆粒質量的影響 不同填充劑種類對草蓯蓉顆粒質量的影響結果見表6,以乳糖作為填充劑時,OD值最高,但在制粒過程中產生粉末較多,所以選擇與其評分接近且成本較低的糊精作為填充劑,以改善顆粒成型工藝。

表6 不同填充劑種類對顆粒質量的影響

2.2.2 填充劑配比對顆粒質量的影響 不同配比的乳糖和糊精對顆粒質量的影響結果見表7。由于乳糖吸濕性較低,隨著乳糖比例的升高,草蓯蓉顆粒的吸濕率不斷下降,同時合格率逐步升高,溶化時間呈降低趨勢。但乳糖比例過高會出現粉末增多,制粒性不好的問題,并且會提高成本,同時進一步增加乳糖比例對顆粒質量的改善并不顯著,綜合考量乳糖與糊精的比例為3∶1較為合適。

表7 不同填充劑配比對顆粒質量的影響

2.2.3 浸膏用量對顆粒質量的影響 不同浸膏用量對顆粒質量的影響結果見表8,隨著浸膏用量的增加,草蓯蓉顆粒合格率逐步下降,吸濕率上升,溶化時間延長,綜合藥效和成本考慮,選擇浸膏用量為6%。

表8 不同浸膏用量對顆粒質量的影響

2.2.4 潤濕劑濃度對顆粒質量的影響 不同潤濕劑濃度對顆粒質量的影響結果見表9,隨著乙醇濃度的升高,草蓯蓉顆粒合格率和溶化時間都隨之改善,但當乙醇濃度過高時,制粒過程中有較多粉末生產,所得顆粒松散性提高,故得到較為適合的乙醇濃度為75%。

表9 不同潤濕劑濃度對顆粒質量的影響

2.2.5 Box-Behnken設計響應面法優化草蓯蓉顆粒成型工藝 結果見表10,各因素對草蓯蓉顆粒質量影響的回歸方程為Y=0.55+0.021×A+0.089×B+0.014×C+0.011×AB-0.032×AC+0.060×BC-0.047×A2-0.090×B2-0.109×C2。

表10 Box-Behnken 設計響應面法優化草蓯蓉顆粒成型工藝試驗設計和結果

對模型的分析結果如表11所示,回歸模型顯著度高(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),相關系數R= 0.984,說明回歸方程擬合度和可信度適當,該模型能夠分析草蓯蓉顆粒質量與相應成型因素之間的關系,模型與實際情況擬合較好,適用于分析和預測草蓯蓉顆粒成型過程的實際情況。分析可知,填充劑配比和浸膏用量對草蓯蓉顆粒質量影響顯著(P<0.05),潤濕劑濃度的影響相對較弱(P>0.05);交互項AC和BC對草蓯蓉顆粒質量影響顯著(P<0.05),二次項均對草蓯蓉顆粒質量有明顯影響(P<0.05);在所選的各因素水平范圍內,各因素對草蓯蓉顆粒質量的影響程度依次為B>A>C,即浸膏用量>填充劑配比>潤濕劑濃度。

表11 Box-Behnken設計響應面法方差分析(Ⅱ)

2.2.6 草蓯蓉顆粒成型工藝Box-Behnken設計響應面法分析 影響草蓯蓉顆粒質量自變量與因變量關系的等高線和響應面曲線如圖2所示,各因素對綜合評分的影響交互項強弱順序為BC>AC>AB,這一結果與2.2.5中方差分析的結果一致。

圖2 各因素對草蓯蓉顆粒成型影響的響應面曲線和等高線

2.2.7 草蓯蓉顆粒成型工藝回歸模型驗證 采用Design-Expert 10軟件預測草蓯顆粒最佳成型工藝參數:填充劑配比3.223∶1,浸膏用量7.15%,潤濕劑濃度75.97%,考慮到實施工藝參數的實際可操作性,將最佳工藝條件修正為:輔料配比3∶1,浸膏用量7%,潤濕劑濃度75%。根據篩選得到的最佳成型工藝條件,進行5批次驗證試驗,實際測得平均OD值為0.561(RSD為0.43%),觀察值和模型預測值0.575比較接近,說明模型預測性良好。故優化后的工藝參數合理可行。

3 討論

本試驗基于QbD理念,研究草蓯蓉的提取工藝及其顆粒成型工藝,通過Box-Behnken 設計響應面法建立模型,預測工藝參數對于浸膏得率的影響,研究發現各工藝參數對于草蓯蓉浸膏得率影響大小順序為:液料比>提取時間>提取次數,經過回歸分析得到草蓯蓉浸膏最優提取工藝為:提取時間60 min,液料比10∶1,提取2次;實測值與預測值的吻合度較好,說明回歸方程可以較好的預測真實條件下的工藝狀況。本試驗進一步采用單因素試驗結合Box-Behnken設計響應面法優化草蓯蓉顆粒成型工藝,以填充劑配比、浸膏用量和潤濕劑濃度為考察因素,以顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評價作為評價指標,采用Hassan法對上述指標進行歸一化,求算出OD值作為優化使用的響應值,避免了各指標優化條件間的沖突。結果顯示,各工藝因素對于顆粒質量影響程度存在顯著差異,影響大小依次為:浸膏用量>填充劑配比>潤濕劑濃度,優化得到成型工藝為:輔料乳糖∶糊精=3∶1,浸膏用量為7%、潤濕劑為75%乙醇,實測值與預測值基本吻合,說明方程預測得到工藝參數具有可行性。

Box-Behnken 設計響應面法可以在小區域內用簡單的一次或多次多項式模型來擬合復雜的未知函數關系。常用的試驗設計的方法(例如單因素和正交試驗)建立的均是線性模型,而現實操作中的工藝參數和質量之間的關系通常是非線性的,并且參數之間可能存在交互作用,Box-Behnken 設計響應面法在試驗條件優化過程中可以連續地對試驗因素的各個水平進行分析,克服了正交試驗只能對每個孤立的試驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷,適用于解決非線性數據處理的相關問題,可彌補正交設計和均勻設計等線性模型精密度低的不足,能更好地揭示自變量和非自變量之間的關系。Box-Behnken 設計響應面法是優化工藝條件、提高產品質量、降低開發成本和解決生產過程中實際問題的一種有效方法。本試驗中對于草蓯蓉提取工藝和顆粒成型性的驗證試驗結果與模型方程理論值之間的偏差在合理范圍內,表明所擬合模型預測結果準確,優選出的工藝穩定可行,可以為工業化大規模生產提供一定參考。