樺褐孔菌提取物對阿托伐他汀致小鼠肝損傷的保護作用

李 毅,李建寬,楊 紅,李青山,

(1. 山西中醫藥大學中藥與食品工程學院,基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室,山西 晉中 030619;2. 山西醫科大學藥學院,山西 晉中 030619)

肝臟作為人體最大的代謝器官,具有合成、解毒、代謝和免疫等功能,在發生損傷時可能會引起肝臟組織異常、代謝紊亂,甚至中毒。藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury,DILI)是指藥物本身和/或其代謝產物導致的肝臟損傷,通常表現為肝細胞壞死、血清轉氨酶升高、膽汁淤積以及各種類型的肝炎等[1],也是臨床上最為常見的急性肝衰竭的主要誘因[2]。目前,藥物性肝損傷產生的機制依舊不確切,可能與肝細胞線粒體受損、氧化應激水平失衡、內質網應激過強或代謝酶和轉運蛋白功能異常等有關[3]。藥物性肝損傷的產生機制不明確與藥物自身因素也有聯系[4],不同藥物導致DILI的原因往往不同,作用機制和損傷類型也多種多樣。他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑,可以抑制人體內低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)和膽固醇的產生,從而起到降低膽固醇的作用。阿托伐他汀(Atorvastatin,ATO)作為臨床一線降脂藥物,研究發現,長期或過量使用阿托伐他汀可能會引發肝毒性[5-6]、橫紋肌溶解[7]和肌病[8]等。其中,阿托伐他汀引起的肝臟損傷[9-10]最為常見,主要與降低線粒體膜電位,造成線粒體損傷,影響機體氧化應激水平和細胞凋亡等有關[11]。臨床中經常會發生患者由于擔心發生肝損傷而停藥或不規則用藥導致的治療失敗,所以尋找能夠有效拮抗他汀類藥物所致肝損傷的藥物具有重要臨床意義。

樺褐孔菌[Inonotusobiquus(Fr.) Pilat]為多孔菌科褐臥孔菌屬真菌樺褐孔菌的干燥子實體[12],有益氣養陰、消癰散結和活血祛瘀之功效。樺褐孔菌具有抗炎[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15-16]和提高機體免疫力[17]等活性。目前已有研究顯示,樺褐孔菌能夠通過加速自由基清除、減少脂質過氧化和增強機體抗氧化等特性,對抗結核藥物導致的藥物性肝損傷[18]、急性酒精性肝損傷[19]和非酒精性脂肪肝[20]等肝損傷產生保護作用。然而,樺褐孔菌是否能夠對阿托伐他汀致小鼠藥物性肝損傷發揮保護作用罕見報道。因此,本試驗以阿托伐他汀所致的小鼠藥物性肝損傷為模型,研究樺褐孔菌提取物(Inonotusobiquusextract,IOE)對其引起的藥物性肝損傷的保護作用及機制,為臨床預防和治療DILI提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性昆明系小鼠48只,體質量(20±2)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2019—0010。實驗動物飼養于溫度和濕度恒定,光照明暗各12 h的清潔級動物房內,自由進食和飲水。本試驗操作過程嚴格遵守實驗動物倫理標準,并經山西中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(AWE20221205)。

1.1.2 藥品 樺褐孔菌(批號:20210723),購自大興安嶺森源山產品有限公司,由山西醫科大學李建寬副教授鑒定為擔子菌亞門、多孔菌科樺褐孔菌;雙環醇片(批號:211116),購自北京協和藥廠;阿托伐他汀(批號:MB1021,純度99%),購自大連美侖生物技術有限公司;羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)(批號:20210302),購自天津市北辰方正試劑廠。試驗時樺褐孔菌提取物、雙環醇和ATO用0.5% CMC-Na水溶液配制成所需濃度藥液。

1.1.3 主要試劑 谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST,C009-2-1)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT,C009-2-1)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP,A059-2)、過氧化氫酶(Catalase,CAT,A007-1-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,A001-3)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px,A005-1)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA,A003-10)檢測試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α,F2132-A)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β,F2040-A)和白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6,F2163-A)檢測試劑盒,均購自上海泛柯實業有限公司;B細胞淋巴瘤因子相關蛋白X(B-cell lymphoma-2 associated protein X,Bax,#3498)、B細胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2,#2772)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK,9252)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(Phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK,#4668)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,p38,#8690)和磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(Phosphorylated mitogen-activated protein kinase,p-p38,#4511)抗體,均購自美國Cell Signaling Technology公司;其他試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器 Scientz-N型真空冷凍干燥機,購自寧波新芝生物科技有限公司;RE-3000A型旋轉蒸發儀,購自上海亞榮生化儀器廠;SpectraMax i3x多功能酶標儀,購自美谷分子儀器(上海)有限公司;JB-L5包埋機,購自武漢俊杰電子有限公司;Histocore BIOCUT切片機,購自上海徠卡儀器有限公司;Eclipse Ti2倒置熒光顯微鏡,購自尼康儀器(上海)有限公司;PowerPacTMBasic型電泳儀和Trans-Blot?SD Cell型蛋白轉膜儀,均購自美國Bio-Rad公司;Imager600全自動化學發光成像系統,購自美國通用電氣公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樺褐孔菌提取物的制備 取樺褐孔菌干燥子實體的粗粉,按照料液比1∶4加入蒸餾水進行回流提取,共3次,每次1.5 h,合并3次提取液,過濾后使用旋轉蒸發儀濃縮至原體積的1/4。加乙醇至含乙醇體積分數為80%,靜置過夜,抽濾;收集沉淀物,用水溶解后過濾,濾液經真空冷凍干燥機冷凍干燥后得IOE。

1.2.2 動物分組、造模和給藥 48只小鼠適應性喂養1周后,隨機分為對照組、模型組[100 mg/(kg·bw) ATO]、IOE低劑量組[100 mg/(kg·bw)]、IOE中劑量組[200 mg/(kg·bw)]、IOE高劑量組[400 mg/(kg·bw)]和雙環醇組[200 mg/(kg·bw)],每組8只。采用邊造模邊給藥的方法,每日下午6:00除對照組外其余各組按照100 mg/(kg·bw)的劑量灌胃ATO建立DILI模型;于次日早晨7:30 IOE各劑量組和雙環醇組灌胃相應藥液,對照組和模型組灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。給藥體積為10 mL/(kg·bw),連續給藥2個月。以試驗小鼠血清ALT、AST和ALP水平均顯著性升高作為建模成功的標準。

1.2.3 標本采集 在最后1次灌胃給藥結束后,各組小鼠禁食不禁水12 h后摘眼球取血,于4 ℃、3 000 r/min離心15 min,分離血清,用于肝功能指標(ALT、AST和ALP)和炎性指標(TNF-α、IL-1β和IL-6)檢測。采血后頸椎脫臼處死小鼠,剖腹取出肝臟組織,用4 ℃生理鹽水沖去血漬,用濾紙吸干表面水分后稱量記錄肝臟質量。將小鼠肝臟組織切割分為3份,1份置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于小鼠肝臟組織的組織病理學觀察;1份裝入凍存管并置于液氮中,用于檢測小鼠肝臟組織蛋白表達水平;1份裝入凍存管并置于液氮中,用于檢測肝臟組織氧化應激指標(MDA、SOD、CAT和GSH-Px)。

1.2.4 小鼠肝臟指數測定 根據公式(1)計算小鼠肝臟指數。

(1)

式中A1為小鼠肝臟質量(g),A2為小鼠體質量(g)。

1.2.5 小鼠肝功能指標檢測 采用比色法檢測小鼠血清中ALT、AST和ALP水平,均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 肝臟組織氧化應激指標檢測 精確稱取0.1 g肝臟組織,加入0.9 mL于4 ℃預冷的生理鹽水,用勻漿機將肝臟組織勻漿。然后將肝臟組織勻漿液置于低溫離心機中,4 ℃、4 000 r/min離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書測定肝臟組織中SOD、CAT和GSH-Px活性以及MDA含量。

1.2.7 小鼠血清中炎癥指標檢測 使用ELISA試劑盒測定小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8 肝臟組織病理學觀察 取固定液中的小鼠肝臟組織,常規石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

1.2.9 Western blot檢查肝臟組織中JNK、p-JNK、p38、p-p38、Bax和Bcl-2的蛋白表達水平 稱取小鼠肝臟組織約50 mg,加入含1%蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀試驗(Radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解緩沖液1 mL,于冰上充分裂解,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清液,二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度,加入5×蛋白上樣緩沖液,水浴使蛋白變性;依次進行 SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉和含吐溫20的 Tris 緩沖鹽水(Tris buffered saline with tween-20,TBST)漂洗后加入目的蛋白一抗,4 ℃孵育過夜。TBST漂洗先除去未結合一抗后,加入二抗室溫孵育2 h,TBST漂洗,進行增強化學發光(Enhanced chemiluminescence,ECL)顯影成像。

1.3 統計學方法 試驗數據用“平均值±標準差”表示,采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 9.0軟件,計量資料兩組間數據比較采用t檢驗,多組間數據比較采用方差分析(Analysis of variance,ANOVA),以P<0.01 表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著,P>0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 IOE對小鼠肝臟指數的影響 結果如表1所示,與對照組相比,模型組肝臟指數極顯著升高(P<0.01),增長約30.68%,表明長期服用高劑量阿托伐他汀造成了小鼠肝臟腫大。與模型組相比,IOE低、中、高劑量組小鼠肝臟指數分別減小19.78%、19.35%和20.22%,均極顯著降低(P<0.01),雙環醇組小鼠肝臟指數也顯著降低(P<0.05),減小了10.65%。即IOE各劑量組和雙環醇組小鼠肝臟組織腫脹程度都得到不同程度的改善,特別是IOE各劑量組均能極顯著抑制肝臟異常增大。

表1 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠肝臟指數的影響

2.2 IOE對小鼠肝功能指標的影響 結果如表2所示,與對照組比較,模型組小鼠血清中的ALT、AST和ALP水平均極顯著升高(P<0.01),平均值分別升至(24.36±4.32)、(17.38±2.85)和(16.50±3.84) U/L,表明藥物性肝損傷小鼠模型建立成功。與模型組相比,IOE低、中和高劑量組ALT水平均極顯著降低(P<0.01),平均值分別為(12.86±2.01)、(10.52±1.49)和(10.21±1.80) U/L,并且呈現一定的劑量依賴關系;IOE高劑量組不僅能夠極顯著抑制AST水平的升高(P<0.01),也能顯著降低ALP水平的升高(P<0.05)。

表2 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠肝功能指標的影響

2.3 IOE對小鼠肝臟組織氧化應激指標的影響 結果如表3所示,與對照組相比,模型組小鼠肝臟組織中MDA含量極顯著升高(P<0.01),已達到(11.39±1.03)nmol/mgprot;SOD、CAT和GSH-Px活性分別為(48.15±10.46)、(22.03±3.23)和(487.41±41.64)U/mgprot,均極顯著降低(P<0.01),表明模型組小鼠體內氧化應激水平顯著升高。與模型組相比,IOE中和高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量顯著減少(P<0.05),分別為(10.03±1.06)和(9.85±1.14)U/mgprot;且SOD活性極顯著升高(P<0.01),分別為(72.79±6.12)和(98.64±7.45)U/mgprot;IOE各劑量組CAT和GSH-Px活性均有不同程度地提高,特別是IOE高劑量組CAT和GSH-Px活性均極顯著提高(P<0.01)。結果表明,IOE對ATO致小鼠藥物性肝損傷的保護作用可能與其參與調節氧化應激有關。

表3 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠肝臟組織MDA含量以及SOD、CAT和GSH-Px活性的影響

2.4 IOE對小鼠血清中炎癥指標的影響 結果如表4所示,與對照組相比,模型組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6水平均極顯著升高(P<0.01),分別升至(381.67±26.69)、(49.21±10.53)和(170.54±30.13)pg/mL。與模型組相比,IOE低、中和高劑量組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01),且呈劑量依賴關系;IOE中和高劑量組小鼠血清中IL-1β水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結果表明,IOE對ATO致小鼠肝損傷的保護作用可能與其抑制炎癥反應有關。

表4 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

2.5 IOE對小鼠肝臟組織病理學的影響 小鼠肝臟切片的組織病理學觀察結果如圖1所示,對照組小鼠肝小葉結構正常,中央靜脈清晰,肝細胞正常,細胞質保存完好,細胞核突出,細胞核位于中央(圖1A);模型組小鼠肝小葉中心壞死,肝細胞大小不一致,出現以中央靜脈為中心的肝細胞變性、壞死或細胞核異位,可見炎性細胞浸潤和片狀壞死(圖1B),提示模型建立成功;IOE低、中和高劑量組和雙環醇組細胞壞死程度明顯減輕,炎性細胞浸潤得到改善(圖1C～F),肝細胞排列較規律。結果表明,IOE對ATO致小鼠肝損傷的保護作用可能與減輕炎性細胞浸潤、緩解肝臟組織損傷有關。

圖1 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠肝臟組織病理學的影響(H.E.染色,200×)

2.6 IOE對小鼠肝臟組織中JNK、p-JNK、p38、p-p38、Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響 結果如圖2所示,與對照組比較,模型組小鼠肝臟組織中JNK磷酸化相對表達水平極顯著升高(P<0.01);與模型組比較,IOE中和高劑量組小鼠JNK磷酸化相對表達水平極顯著降低(P<0.01)。與對照組比較,模型組小鼠p38磷酸化相對表達水平極顯著升高(P<0.01);與模型組相比較,IOE高劑量組小鼠p38磷酸化相對表達水平極顯著降低(P<0.01)。結果表明,IOE能夠抑制ATO所致小鼠肝臟組織中JNK和p38磷酸化水平的升高。

圖2 IOE對阿托伐他汀致藥物性肝損傷小鼠肝臟組織中JNK和p38蛋白磷酸化以及Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

與對照組比較,模型組小鼠Bax相對表達水平極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,IOE低、中和高劑量組小鼠Bax相對表達水平均有不同程度的降低,各組之間呈劑量依賴關系,并且IOE中和高劑量組均能極顯著抑制Bax相對表達水平(P<0.01)。各組小鼠Bcl-2相對表達水平均無顯著差異(P>0.05)。結果表明,ATO可能增加小鼠肝臟組織中Bax蛋白表達水平而誘導肝細胞凋亡,而IOE能夠抑制ATO誘導的肝臟組織中Bax蛋白表達水平的升高,阻止細胞凋亡而發揮保護肝臟的作用。

3 討論

當肝臟發生藥物性損傷時,肝臟的代謝功能會受到影響,導致相關代謝物種類和含量改變,從而引起人體代謝水平、氧化應激水平和免疫反應等發生改變。研究發現,長期使用阿托伐他汀會引起諸多不良反應[11,21],其中以肝損傷[22]較為常見,其主要表現為體內轉氨酶水平升高,甚至可引起藥物性自身免疫性肝炎[23]。近年來,以ATO作為誘導劑制備肝損傷動物模型的相關文獻越來越多[10,24],使用天然藥物及其有效成分預防或治療藥物性肝損傷的報道也越來越多[9,21,25]。樺褐孔菌作為一種藥用真菌,其主要成分包括多糖、芳香類化合物、萜類化合物、甾體以及少量的生物堿和木質素類化合物[26-27]。研究表明,樺褐孔菌對多種類型的肝損傷都有保護作用[18-20]。因此,本試驗通過建立ATO導致的小鼠肝損傷模型,研究樺褐孔菌提取物對長期使用ATO導致的肝損傷產生的保護作用及其作用機制。

ALT、AST和ALP是常見的反映肝損傷的生化標志物[28]。當肝細胞受損時,細胞膜通透性改變,ALT、AST和ALP釋放進入血液,導致血清中三者水平升高。本試驗結果顯示,經過IOE治療,IOE低、中和高劑量組小鼠血清中轉氨酶ALT和AST水平均能夠得到明顯抑制,這與崔濤等[29]使用樺褐孔菌治療環磷酰胺中毒小鼠時觀察到的轉氨酶變化情況一致。同時,本試驗病理切片結果也顯示,經IOE治療小鼠的肝臟組織病理損傷程度有顯著好轉。以上結果說明,IOE對ATO造成的肝損傷有一定保護作用,能夠抑制肝損傷時伴隨的轉氨酶水平升高。

線粒體氧化應激是導致藥物性肝損傷發生和發展的重要因素[30-31]。線粒體氧化應激通常伴隨氧自由基的產生和脂質過氧化,機體對脂質過氧化的防御主要是通過提高抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px等的活性,以保證其清除活性氧的能力,阻止自由基鏈鎖反應。本試驗結果顯示,與對照組對比,模型組小鼠體內SOD、CAT和GSH-Px活性皆顯著下降,且MDA含量顯著增多,說明ATO可引起小鼠體內氧化應激水平升高而造成肝臟組織損傷,這與Heeba等[25]研究生姜與ATO合用預防其肝毒性中得到的結論一致。本試驗中,與模型組小鼠相比,不同劑量IOE對3種抗氧化酶的活性都有不同程度的增強作用,且均能降低MDA的生成,其中以IOE高劑量組效果最佳。鐘秀宏等[18]在研究樺褐孔菌提取物對抗結核藥異煙肼和利福平導致的小鼠藥物性肝損傷的保護作用中也證實,樺褐孔菌發揮保護肝臟作用可能與其抗氧化作用有關。

炎癥反應是藥物性肝損傷的易感因素,會加重肝損傷的發展進程。據報道,阿托伐他汀誘導的藥物性肝損傷的發展過程中也有炎癥反應的產生[11,32],抑制炎癥因子的釋放將有助于該類型藥物性肝損傷的治療。TNF-α是重要的促炎因子和免疫調節因子,既能加重炎癥反應程度也能刺激免疫細胞吞噬能力增強[33]。IL-6作為一種促炎因子,和其激活的下游因子IL-1β均能引起肝臟發生炎癥,并且兩者與血清轉氨酶水平的升高有關[34]。在本試驗中,IOE能夠顯著抑制ATO誘導的肝損傷小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,這與王思霽[20]研究發現樺褐孔菌多糖能夠抑制非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)小鼠肝臟炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平升高的結果相同,表明IOE對ATO誘導的肝損傷出現的炎癥反應有一定的抑制作用。

絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)在肝臟代謝疾病的發生和發展過程中具有重要意義[35-37]。一方面,JNK和p38在維持肝臟代謝功能中發揮重要作用。JNK能夠通過維持肝細胞糖異生、增強胰島素敏感性和調控脂肪代謝來調節葡萄糖代謝和能量穩態[36]。p38能夠通過調節JAK-STAT信號通路、減少中性粒細胞浸潤和減少活性氧積累等方式維持肝臟正常代謝功能,預防多種肝病(NAFLD、肝纖維化,甚至是肝癌)的發生[38-40]。另一方面,受到生長因子、細胞因子、藥物和紫外線(Ultraviolet,UV)等多種因素的影響,JNK和p38的磷酸化常常引起肝臟代謝紊亂和肝臟損傷。JNK通過磷酸化激活后與線粒體外膜層Sh3bp5或Sab相互作用而介導肝毒性,導致膜間Scr磷酸化,從而造成線粒體呼吸受損和ROS釋放增強,最終導致肝細胞損傷[41]。越來越多的研究顯示,抑制JNK和p38的磷酸化可能是治療肝臟疾病發生和發展的重要靶點[42-43]。在本試驗中也證明了這一觀點,IOE高劑量組能夠明顯地抑制肝臟組織中JNK和p38的磷酸化以及p-JNK和p-p38蛋白表達,從而起到保護肝臟的作用。此外,JNK的激活也會影響Bax激活和易位,使其從細胞質轉移到線粒體,這種易位往往會導致線粒體膜損壞,影響線粒體呼吸和功能異常[30]。在本試驗中,模型組小鼠肝臟組織JNK磷酸化升高的同時,Bax蛋白表達也顯著升高,IOE中、高劑量組都能顯著降低小鼠Bax蛋白的表達,說明IOE能通過抑制JNK和p38的磷酸化以及Bax的表達而起到拮抗ATO致藥物性肝損傷的作用。

綜上所述,本試驗通過研究IOE對阿托伐他汀所致藥物性肝損傷小鼠的保護作用,發現其發揮保護肝臟作用可能與抑制氧化應激、抑制炎癥反應和調控MAPK信號通路有關,這為樺褐孔菌的開發和利用提供了參考依據。