3D打印含鎂聚己內酯支架修復大鼠顱骨缺損

李筱葉， 李強， 戴卓， 丁夢， 董衡， 董強生， 白晶， 牟永斌

1.南京大學醫學院附屬口腔醫院，江蘇 南京（210008）； 2.東南大學材料科學與工程學院，江蘇 南京（211189）

頜面部骨缺損是指由感染、創傷，腫瘤、手術以及部分先天性疾病引起的骨質局部缺失，其在一定程度上限制了口腔種植手術的應用，因此如何更好地修復骨缺損引起了許多學者的關注［1-2］?；谥Ъ艿墓墙M織工程（bone tissue engineering，BTE）是促進骨再生修復的方法之一［3］。相對于自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植，其優勢在于規避了免疫排斥、感染、移植骨供應有限等不足［4-5］。BTE 支架是一種能在骨缺損部位為骨再生提供特定環境和三維空間、促進骨組織向內生長的生物材料。通過改善其幾何形態、機械性能和生物學活性可以增強其骨修復效果。

聚己內酯（polycaprolactone，PCL）是一種具有良好生物相容性的聚合物材料，其具備優異的生物降解性和可修飾性能，已被FDA 批準應用于臨床試驗［6-8］。相對于天然聚合物，如膠原、殼聚糖、海藻酸鹽等，合成聚合物是經過嚴格設計且可大規模合成的［9-10］。值得關注的是，PCL 由于其較低的熔點表現出極大的設計靈活性，輔以三維打?。?D print），可以定制具有個性化形狀和孔徑/孔隙率的PCL 支架［11］。然而，與天然聚合物相比，PCL支架與細胞間的相互作用能力較弱，不具備骨誘導功能［12］。鎂（magnesium，Mg）元素天然存在于骨組織中，缺乏Mg 會導致骨骼脆性增加、骨再生延遲、骨密度降低等［13-15］。因此，本課題組試想將Mg作為一種摻雜劑應用在骨組織工程中，其可以高效率地提供Mg 離子，以促進細胞黏附及增殖分化、增強骨再生和鈣化。根據本課題組之前的研究［16］，摻雜3 wt% Mg 微粒對比于其他摻雜比例（1 wt%、5 wt%、7 wt%和9 wt%），顯示出最高的成骨效率和良好的綜合性能。因此，本實驗擬構建大鼠顱骨缺損模型，缺損區植入摻雜3 wt% Mg 微粒的3D 打印PCL 基支架，以評估PCL-Mg 支架的骨修復能力，為骨組織工程提供新的潛在材料。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

PCL（阿拉丁化學試劑公司，美國）；Mg 微粒（唐山偉豪鎂粉有限公司，中國）。SD 大鼠由上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部提供，動物合格證號［SCXK（滬）2018-0006］。3D 打印機（FDM3000，Stratasys，美國）；場發射掃描電子顯微鏡（Sigma360，Zeiss，德國）；能譜分析儀（Ultra 55，Zeiss，德國）；接觸角儀（One Attension，Biolin Scientific，瑞典）；電子萬能試驗機（CMT4503，美特斯工業系統有限公司，中國）；電感耦合等離子體質譜儀（iCP 6500，Thermo，美國）；micro-CT（Hiscan XM，蘇州海斯菲德信息科技有限公司，中國）；CT 三維重建分析（Hiscan Reconstruct/Analyzer software V3.0，蘇州海斯菲德信息科技有限公司，中國）。

1.2 3D 支架材料的制備及表征

通過共混合3D 打印制備摻入3wt%鎂微粒的PCL 支架［16-17］。首先，加熱PCL 至200 ℃并保持15 min，直至達到黏稠流動狀態。Mg 微粒以3 wt%加入熔融PCL 中。以50 rpm/min 的速率攪拌熔融的Mg/PCL 混合物160 min，使Mg 微粒在PCL 基質中均勻分布。將凝固后的混合物裝入3D 打印機，然后在3D 打印機的擠出腔中熔化，最后以0°/90°沿z 軸逐層打印。3D 打印溫度設定為160 ℃，打印機噴嘴移動速度為1.5 mm/s，3D 打印的模型為?13 mm × 4.3 mm 圓柱體（用于物理化學表征）或?5 mm×1.5 mm 圓柱體（用于動物實驗）。

通過掃描電子顯微鏡觀察PCL 及PCL-Mg 支架的微觀形貌，并計算孔徑、纖維直徑和孔隙率。使用能譜分析儀（energy dispersive spectrometer，EDS）對PCL-Mg 支架表面元素進行分析，以驗證鎂微粒的成功摻入。通過接觸角計測量接觸角，測試液體為2 μL 蒸餾水，待水滴在支架材料表面穩定后，記錄并分析水滴切線與材料水平面夾角。室溫下，支架材料使用電子萬能試驗機以1 mm/min 的壓縮速率測試壓縮性能。此外，為了揭示Mg 離子的釋放行為，將3D 打印的PCL-Mg 支架浸泡在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，溶液體積與支架表面積之比設定為30 mL/cm2，使用電感耦合等離子體質譜法檢測不同時間點PBS 溶液中的Mg2+含量。

1.3 實驗分組

15 只SD 大鼠，隨機分為3 組，每組5 只：根據植入支架材料不同，分為PCL 組和PCL-Mg 組，未行治療的作為對照組。本實驗已獲得南京大學實驗動物福利倫理審查委員會批準（批號：IACUC-2003034）。

1.4 大鼠顱骨缺損模型構建

SD 大鼠行異氟烷吸入麻醉，麻醉產生效果后，顱頂區備皮，消毒，鋪無菌手術孔巾。沿顱頂做正中矢狀全層切口，約15 mm。解剖分離，暴露顱頂區，于顱骨正中縫一側頂骨區使用取骨環鉆，在生理鹽水冷卻下制備出直徑5 mm 圓形顱骨全層缺損，術中避免損傷硬腦膜和矢狀竇。分別將各組支架材料植入缺損處，對照組不植入任何材料。最后縫合封閉骨膜和頭皮。術后3 d 予以青霉素4 萬單位/d，預防感染。

1.5 微型計算機斷層掃描（micro-CT）及數據定量分析

每組SD 大鼠吸入麻醉下，于術后4 周、8 周分別行活體micro-CT 掃描，用于定量評估缺損部位新生骨形成。掃描參數為：80 kV，100 μA，單次曝光時間50 ms，掃描分辨率25 μm，掃描角度間隔0.5度，通過軟件重建及分析定量顱骨缺損區域的新生骨體積（bone volume，BV）、骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）、骨表面積（bone surface，BS）、骨表面積組織體積比（bone surface/total volume，BS/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）、骨小梁數（trabecular number，Tb.N）和骨礦物密度（bone mineral density，BMD）。

1.6 組織學切片及安全性評價

術后8 周，在戊巴比妥麻醉下用頸椎脫位法處死大鼠，獲取顱骨術區樣本，去除顱內容物及軟組織，僅留顱頂骨及植入物，標本經4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣2 周。經石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（H&E）染色、Goldner 染色或VG 染色，封片，干燥。采用光鏡觀察新生骨情況。為了研究支架材料的體內安全性，在植入支架8 周后，通過H&E 染色切片對主要的組織器官（心、肝、脾、肺和腎）進行切片觀察。

1.7 統計學分析

統計分析使用GraphPad Prism 10.0 軟件進行。使用單因素方差分析（ANOVA）評估組間差異，然后使用Tukey 多重比較檢驗。所有計量資料均用均值±標準差表示，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 3D 支架材料表征

PCL 支架及PCL-Mg 支架的宏觀及微觀形貌見圖1a，均為多孔結構，孔徑為（480 ± 25）μm，纖維直徑為（300±25）μm，孔隙率約為66%。EDS 分析結果顯示（圖1b），PCL-Mg 支架表面可見含Mg 元素的凸起（Mg 含量為1.0 At%），表明成功摻入了Mg 微粒；占75.0 At%的C 元素和23.7 At%的O 元素為PCL 的主要成分?；谒佑|角對支架潤濕性的評估結果顯示（圖1c），PCL 的水接觸角為97.63°± 2.66°，PCL-Mg 的水接觸角為68.97° ± 1.39°，相較于PCL 降低，具有統計學差異（P＜0.001），表明Mg微粒的摻雜增加了材料表面親水性。機械性能測試結果顯示（圖1d），PCL-Mg 支架的壓縮模量（57.37 ± 8.33）MPa 優 于PCL 支 架（36.27 ± 1.65）MPa，差異具有統計學意義（P= 0.025）。Mg2+的體外釋放行為結果顯示（圖1e），在28 d 中Mg2+被持續釋放到浸泡溶液中。

Figure 1 Morphologies and characterization of the PCL and PCL-Mg scaffolds圖1 PCL 和PCL-Mg 支架材料的形貌及材料學表征結果

2.2 不同材料支架對大鼠顱骨缺損的修復效果比較

不同材料對顱骨缺損修復的效果見圖2，對照組（無植入物）手術后4 周和8 周，骨缺損底部及邊緣均未見新增阻射影，表明無明顯骨再生現象；PCL 組缺損底部形成少量不規則點狀骨，缺損邊緣出現少量不規則新生骨，空洞缺損略有縮小，缺損區大部分未修復；PCL-Mg 組中新生骨在手術后4 周即生長到支架中，且在手術8 周后繼續增長，在骨缺損上形成較厚的新骨組織層。

Figure 2 Micro-CT reconstructed images of SD rats with skull defects after 4 and 8 weeks of scaffolds implantation surgery圖2 SD 大鼠顱骨缺損行支架植入術后4 周及8 周骨缺損區micro-CT 三維重建圖像

新生骨定量分析結果見圖3，支架植入后4 周，對 照 組、PCL 組 和PCL-Mg 組 的BV/TV 分 別 為7.17% ± 0.44%、7.49% ± 0.67%和10.29 ± 1.28%，BMD 分別為（1 680.91±17.67）mg/cm3、（1 692.67 ±17.5）mg/cm3和（1 715.88±6.48）mg/cm3；8 周后對照組、PCL 組和PCL-Mg 組的BV/TV 分別為7.90% ±0.50%、9.53%±1.12%和13.51%±0.53%，BMD分別為（1 690.66±13.85）mg/cm3、（1 715.65±12.67）mg/cm3和（1 743.55 ± 11.21）mg/cm3，對照組與PCL 組比較BV/TV、BMD的差異無統計學意義（P＞0.05），PCL-Mg組與對照組差異具有統計學意義（BV/TV：4 周：P＜0.001，8 周：P＜0.001；BMD：4 周：P= 0.016，8 周：P＜0.001）。此外，PCL-Mg 組大鼠新生BV、BS、BS/TV、Tb.Th、Tb.N 在4 周和8 周均顯著高于其余兩組，而Tb.Sp 顯著降低。

Figure 3 Quantitative analysis of the new bone in bone defect areas of SD rats after 4 and 8 weeks of scaffolds implantation surgery圖3 SD 大鼠顱骨缺損行支架植入術后4 周及8 周后骨缺損區新生骨定量分析

通過H&E 染色、Glodner 染色和VG 染色從組織層面上觀察顱骨缺損修復水平，組織形態學染色結果與micro-CT 有相似的趨勢（圖4）。對照組僅有薄層纖維結締組織覆蓋于骨缺損部位，骨缺損幾乎無愈合；PCL 組沿著支架表面形成少量未礦化的骨組織，留有大量未充填的間隙，同時骨缺損區域表面形成了較厚的纖維組織；PCL-Mg 組在支架處形成較厚的礦化新骨，在支架相互連接的孔隙中充滿了骨膠原纖維組織，表現出增強的骨再生行為。

Figure 4 Histological staining images of SD rats with skull defects after 8 weeks of scaffolds implantation surgery圖4 SD 大鼠顱骨缺損行支架植入術后8 周骨缺損區組織學染色結果

大鼠主要組織器官（心、肝、脾、肺和腎）H&E染色切片如圖5 所示，各組大鼠的主要組織器官未見明顯差異，無明顯炎癥或異常破壞。

Figure 5 H&E staining images of major organ sections(heart,liver,spleen,lung,and kidney)of SD rats with skull defects after 8 weeks of scaffolds implantation surgery圖5 SD 大鼠顱骨缺損行支架植入術后8 周主要臟器切片（心、肝、脾、肺和腎）的H&E 染色結果

3 討 論

骨組織工程支架雖然已經從傳統細胞種子支架發展到無細胞支架，但這也對其生物活性提出了更高的要求，以募集、誘導和活化內源性細胞解決骨缺損修復的挑戰［18-19］，目前已經開發了許多生物材料來制備BTE 支架［20-22］，包括天然或合成聚合物（例如膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸、殼聚糖或聚乳酸、PCL、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等）、生物金屬（例如鉭、鈦、鐵、鎂等）、生物陶瓷（例如羥基磷灰石，磷酸鈣、生物活性玻璃等）及生物復合材料（如金屬涂覆磷酸鈣，羥基磷灰石/殼聚糖凝膠等）。而關于PCL 基支架與可生物降解金屬Mg 結合的報道較少。研究表明，Mg 在降解的過程中，釋放的Mg2+增強了降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的合成及其在骨膜感覺神經末梢的釋放，CGRP可以提高骨膜干細胞（periosteum derived stem cells，PDSCs）的成骨分化能力，是骨缺損愈合過程中Mg2+促進骨再生的主要機制［23-25］。而與其他含Mg 化合物或鎂合金相比，純Mg 微粒的降解速度更快，可以高效提供鎂離子［26］。本研究中PCL-Mg 支架孔徑約為（480 ± 25）μm，孔隙率約為66%，有研究提出孔徑200～600 μm 是確保細胞生長、營養擴散、維持成骨和成血管潛在空間的最佳孔徑［14,27］，本研究設計的多孔結構為可以滿足細胞遷移和營養交換，并提供必要的機械支撐。此外，適當的金屬Mg 摻入增加了粗糙度，改善了其潤濕性，其親水性的增加有利于植入支架上的細胞黏附、增殖和分化［28］。壓縮強度的提高表明適當的Mg 摻入有助于機械性能的增強，這可能與顆粒分散或鍵能增加有關［29-30］，但其具體機制仍然未知。另外，通過與靜電紡絲和鹽浸等方法制備的含Mg 支架相比，3D 打印制備的PCL-Mg 支架在相同孔隙率的條件下具有更高的壓縮模量［31-34］。在本實驗中，應用于大鼠顱骨缺損修復的PCL 支架含3 wt%Mg，micro-CT 數據結合組織學切片結果證實了Mg 在骨缺損愈合中的促進作用，相較于PCL 支架，其獲得了更多的骨體積以及更優的骨小梁結構，并觀察到從術后4～8 周缺損區域內的持續成骨，表明PCL-Mg 組在早期和晚期均能促進骨形成。此外，本實驗通過大鼠主要臟器H&E 切片評估支架材料的長期安全性，支架材料及其緩慢釋放的Mg2+離子不會造成任何實質性損傷。

綜上，本研究通過3D 打印制備了Mg 摻雜的PCL 基支架。PCL-Mg 支架具有良好的生物相容性和增強的成骨活性，這為3D 打印骨組織工程支架材料應用于頜面部骨缺損修復提供了一定依據。

【Author contributions】Li XY performed the experiments and wrote the article.Li Q, Dai Z, Ding M performed the experiments and revised the article.Dong H, Dong QS, Bai J, Mou YB revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.