活性氧響應的納米顆粒對炎性環境下牙齦成纖維細胞功能的影響及機制

邱心一， 宋璐彤， 任雙雙， 苗雷英

南京大學醫學院附屬口腔醫院，南京市口腔醫院牙體牙髓病科，江蘇 南京（210008）

慢性牙周炎是一種由細菌引起的慢性炎癥性疾病，是導致牙齒松動脫落的主要原因［1］。研究表明，牙周組織局部的氧化應激環境是導致牙周炎癥加重、組織破壞的主要原因［2］。調節局部活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平從而減輕牙周組織炎癥、促進組織再生成為治療牙周炎的新策略［3］，因此，以ROS 為靶點的生物納米材料研發得到研究人員高度關注［4］。

PssL-NAC（PEG-ss-PCL@NAC）是一種能響應細胞內高水平ROS 并按需釋放藥物的納米釋藥顆粒。針對牙周炎癥過程中局部環境中ROS 升高，通過響應ROS 的硫縮酮鍵（thioketal，TK）連接聚己內酯（polycaprolactone，PCL）的疏水端和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的親水端，水相油相自主裝的方式得到內部包裹油溶性的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine-NAC）的PssL-NAC 微球。其中，硫縮酮鍵具有ROS 響應特性，在炎癥環境ROS 高水平下，硫縮酮鍵斷裂，PssL-NAC 微球從疏水蜷縮態轉變為舒展態，微球內的NAC 隨之釋放，實現NAC 在炎癥部位的靶向積累。本課題組前期研究已經成功自主合成、表征PssL-NAC 納米顆粒，證明PssL-NAC 能夠響應高水平ROS，通過自激活調節的方式釋放包裹在內部的抗氧化劑NAC，通過緩釋效果將細胞內ROS 維持在適宜的水平［5］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下維持人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）內兩倍對照組水平的ROS，并促進其成骨分化［5］。此外，PssL-NAC 能夠通過調節絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 核 因 子κB（nuclear factor-κB p65，NF-κB）通路關鍵蛋白的磷酸化從而調節巨噬細胞向抗炎的M2 表型極化［6］。前期的體內實驗中發現PssL-NAC 處理后大鼠牙齦纖維較牙周炎大鼠排列更加整齊、致密，然而PssL-NAC 在細胞水平上對牙齦成纖維細胞的影響和其具體機制仍不清楚。因此本研究利用牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide，P.g-LPS）刺激人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）模擬炎癥反應，觀察PssL-NAC 在抑制炎癥、維持細胞功能中的具體作用及機制，為治療牙周炎治療過程中促進軟組織再生的策略提供理論依據。

1 材料和方法

本研究經南京大學醫學院附屬口腔醫院醫學倫理委員會審查批準（批號：NJSH-2022NL-009）。本研究于2022 年10 月至2023 年7 月在南京大學醫學院附屬口腔醫院中心實驗室進行。

1.1 主要試劑和儀器

DMEM（11965118，Gibco，美國），PBS（G4202，賽維爾，中國），胎牛血清（FSS500，依科賽，中國），NAC（616-91-1，Sigma，美國），P.g-LPS（SMB00610，Sigma，美國），CCK8 試劑盒（CK04，同仁，日本），活性氧檢測試劑盒（S0033S，碧云天，中國），細胞RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-qPCR 試劑盒（RC112，R323，Q711，諾維贊，中國），RIPA 裂解液（P0013B，碧云天，中國），DEPC 水（B501005，生工，中國），一抗抗體TLR4（ab13556，Abcam，美國），一抗抗體p65、p-p65，Tublin（AF5006，AF2006，AF7021，Affinity，中國）；二抗山羊抗兔抗體（Ab_2337913，Jackson，美國）；SurePAGE?預制膠，電泳緩沖液（M42012C，M00138，金斯瑞，中國），TBST（C006161，生 工，中 國），PVDF 膜（IPVH00010，Millipore，美國）。

共聚焦顯微鏡（Nikon Ti A1，Nikon，日本），Nanodrop 核酸蛋白檢測儀（One，Thermo，美國），酶標儀（SpectraMAXM3，Thermo，美國），RT-qPCR 儀（ViiA V7Dx，Thermo，美國），化學發光成像儀（Tanon5200，天能，中國）。

1.2 人牙齦成纖維細胞的分離、培養

選取3 例知情同意、既往健康無牙周疾病患者拔除阻生齒時需切除的牙齦組織，放入含20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%雙抗（青霉素+鏈霉素）的DMEM 培養基中，1 h 內取出牙齦組織，生理鹽水反復沖洗，在超凈工作臺內將牙齦組織修剪為1 mm3的組織塊，放入T25 培養瓶中，加入5 mL 含10%FBS、1%雙抗的DMEM 培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中倒置培養，4 h 后翻瓶。待細胞在瓶中融合至80%后傳代，后續實驗使用的細胞為3～6 代。

1.3 PssL-NAC 微球制備和NAC 水溶液制備

將PEG-ss-PCL（PssL）納米顆粒溶于50 mL 去離子水（deionized water，ddH2O）中，將5 mg NAC 溶于5 mL 二氯甲烷中，使用水相油相自組裝的方法，在超聲震蕩下，用滴管吸取溶有NAC 的二氯甲烷溶液，緩慢滴加到溶有PssL 的30 mL ddH2O 中，迅速攪拌，超聲震蕩45 min。將獲得的分散于水中的PssL-NAC 溶液超聲1 h，用滴管將該溶液滴加至銅網上（附有20 nm 厚度的碳支持網），靜置干燥后采用JEM-100 透射電鏡觀察納米粒子的形貌及粒徑。將5 mg NAC 溶于30 mL ddH2O 中，超聲下攪拌混勻得到NAC 溶液。

1.4 細胞內ROS 檢測

將HGFs 鋪于直徑為35 mm 玻璃底小皿中，鋪板密度為1×105個/孔。待細胞融合至80%后分別加入P.g-LPS（0、5、10 μg/mL），P.g-LPS（0、5、10 μg/mL）+NAC，P.g-LPS（0、5、10 μg/mL）+ PssL-NAC。共培養24 h 后，去除原培養基，按1：1 000 加入2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧探針，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育20 min，去除培養基，磷酸緩沖生理鹽水（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3 次，共聚焦顯微鏡觀察488 nm 下的細胞熒光強度，確定后續實驗使用的P.g-LPS 濃度。

1.5 實驗分組

將提取的人牙齦成纖維細胞隨機分為空白對照組（不做處理），P.g-LPS 處理細胞為P.g-LPS 組，P.g-LPS+NAC 處理細胞為NAC 組，P.g-LPS+PssLNAC 處理細胞為PssL-NAC 組。NAC 組中，將NAC水溶液按10%（v/v）加入孔板中，使NAC 終濃度為20 μg/mL。PssL-NAC 組中PssL-NAC 的使用濃度為10%（v/v），在該體積比下，PssL-NAC 中NAC 含量與同體積比的20 μg/mL 中NAC 含量一致。

1.6 細胞增殖實驗

將HGFs鋪于96孔板中，鋪板密度為4×103個/孔。待細胞貼壁后分別加入10 μg/mLP.g-LPS；此外，分別加入NAC、PssL-NAC，共培養1、3、5、7 d 后，去除培養基，每孔加入含10% CCK-8 試劑盒工作液的無血清DMEM 培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育1.5 h，酶標儀450 nm 波長下檢測OD 值。

1.7 RT-qPCR 檢測炎癥因子及膠原生成的相關基因表達

將HGFs鋪于6孔板中，鋪板密度為4×105個/孔。待細胞融合至80%后加入NAC 或PssL-NAC 預處理12 h 后去除原培養基，加入P.g-LPS（10 μg/mL）刺激6 h，PBS 沖洗3 次，加入Trizol 裂解液提取細胞總RNA，Nanodrop 核酸蛋白檢測儀檢測RNA 濃度，使用逆轉錄試劑盒轉錄為cDNA。以GAPDH 為內參，使用RT-qPCR 試劑盒檢測炎癥因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和Ⅰ型膠原蛋白（collagen 1，COL1）、Ⅲ型膠原蛋白（collagen 3，COL3）水平。引物序列表見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.8 劃痕實驗觀察各組人牙齦成纖維細胞的遷移能力

將HGFs鋪于6孔板中，鋪板密度為4×105個/孔。待細胞融合至80%后加入NAC 和PssL-NAC 預處理12 h 后去除原培養基，加入P.g-LPS（10 μg/mL），用移液槍在孔板底部劃痕，劃痕后0、3、6、12 h 后拍攝照片，并半定量分析劃痕距離變化。

1.9 Western blot 測定TLR4-NFκB 通路相關蛋白表達

將HGFs鋪于6孔板中，鋪板密度為4×105個/孔。待細胞融合至80%后NAC 和PssL-NAC 預處理12 h后去除原培養基，隨后加入P.g-LPS（10 μg/mL）共培養30 min，去除原培養基，PBS 沖洗3 次，加入RIPA 裂解液和磷酸酶抑制劑提取細胞總蛋白，Nanodrop 核酸蛋白檢測儀檢測蛋白濃度。加入1×SDS上樣液后95 ℃充分變性。在電泳凝膠均勻加入等量蛋白（40 μg），電泳完成后轉移蛋白至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。將TLR4、p65、p-p65、內參Tublin 一抗抗體以1∶1 000 比例稀釋后均勻覆蓋于PVDF膜上，室溫下孵育2 h后洗膜3次。將1∶5 000稀釋的山羊抗兔二抗抗體于PVDF 膜室溫下孵育1 h，曝光觀察蛋白表達情況。

1.10 統計學分析

應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，正態分布的計量資料以均數± 標準差表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和雙因素方差分析（two-way ANOVA）對各指標進行比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HGFs 細胞原代提取及培養

經組織塊培養法培養后，組織塊周圍可見細胞爬出（圖1a）。體外培養的HGFs 細胞為長梭形或星形，細胞形態均一（圖1b）。

Figure 1 Isolation and culture of human gingival fibroblasts圖1 人牙齦成纖維細胞的分離與培養

2.2 PssL-NAC 納米顆粒成功合成

采用水相油相自主裝合成的PssL-NAC 納米顆粒，電鏡下觀察形態規則呈球形，直徑約為120 nm（圖2）。

Figure 2 TEM images of PssLNAC nanoparticles圖2 PssL-NAC 納米微球透射電鏡圖

2.3 PssL-NAC 維持P.g-LPS 刺激下的HGFs 細胞內適宜濃度ROS

與對照組（P.g-LPS=0 μg/mL）相比，隨著P.g-LPS濃度升高，細胞熒光強度增強，代表細胞內ROS 水平升高（P＜0.001，P＜0.001）。P.g-LPS=5、10 μg/mL時，分別加入NAC 和PssL-NAC 均顯著降低了P.g-LPS 誘導的高水平ROS（P＜0.001，P＜0.001）。在P.g-LPS 濃度升高的情況下，NAC 組的細胞內ROS 水平始終與對照組（P.g-LPS=0 μg/mL）無顯著差異（P＞0.05）。與對照組（P.g-LPS=0 μg/mL）相比，在P.g-LPS=0、5、10 μg/mL 時，PssL-NAC 組細胞內ROS 水平較高（P=0.005，P=0.004，P=0.002），約為對照組（P.g-LPS=0 μg/mL）的2 倍（圖3）。在P.g-LPS=10 μg/mL 時ROS 升高效果最為顯著，因此選擇P.g-LPS=10 μg/mL 進行后續實驗。

Figure 3 Comparison of intracellular reactive oxygen species levels in human gingival fibroblasts with different concentrations of P.gingivalis-lipopolysaccharide圖3 不同濃度牙齦卟啉單胞菌脂多糖處理人牙齦成纖維細胞后細胞內活性氧水平比較

2.4 PssL-NAC 對HGFs 細胞增殖無抑制作用

使用10 μg/mL 的P.g-LPS 處理細胞，在共培養5、7 d 后觀察到細胞增殖抑制（P= 0.039，P=0.003）。與空白對照組相比，在P.g-LPS 存在的條件下，NAC 處理細胞后，在1、3、5、7 d 細胞增殖均未受到明顯抑制（P= 0.981，P= 0.894，P= 0.788，P=0.079），PssL-NAC 處理細胞后，在1、3、5、7 d 細胞增殖也未受到明顯抑制（P= 0.998，P= 0.817，P= 0.999，P= 0.576），表明NAC 與PssL-NAC 均無明顯細胞毒性。在第7 天時，NAC 和PssL-NAC 能恢復P.g-LPS 抑 制的細胞增殖（P＜0.001，P＜0.001）（圖4）。

Figure 4 Cell proliferation ability of human gingival fibroblasts in different treatment groups圖4 不同處理組人牙齦成纖維細胞的增殖活性

2.5 PssL-NAC 在P.g-LPS 刺激下降低炎癥因子表達，促進膠原蛋白生成

P.g-LPS 處理后細胞炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA 表達上升（P＜0.001，P= 0.005）。PssL-NAC降低了P.g-LPS 誘導的細胞炎癥因子IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.001）的升高。相比于對照組和P.g-LPS 組，PssL-NAC 組COL1 基 因 表 達 升 高（P＜0.001，P＜0.001），但NAC 組細胞COL1 的基因表達較對照組下降（P= 0.022）。與其他三組相比，PssL-NAC 組COL3 基因表達升高，但差異無統計意義（P＞0.05）（圖5）。

Figure 5 mRNA expression of inflammatory factors and collagen of human gingival fibroblasts in different treatment groups圖5 不同處理組人牙齦成纖維細胞相關炎癥因子和膠原蛋白的mRNA 表達情況

2.6 PssL-NAC 在炎癥環境下促進細胞遷移

與對照組相比，P.g-LPS 處理后細胞遷移能力在3、6、12h 后顯著下降（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。與P.g-LPS 組相比，PssL-NAC 組在P.g-LPS刺激3、6、12 h 后能夠顯著促進炎癥狀態下的細胞遷移（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。在P.g-LPS刺激12 h 后，PssL-NAC 組細胞融合程度較NAC 組更高（P= 0.005），細胞融合程度與對照組無顯著差異（P=0.542）（圖6）。

Figure 6 Migration of gingival fibroblast cells in different treatment groups圖6 不同處理組人牙齦成纖維細胞遷移情況

2.7 PssL-NAC 通過TLR4-NF-κB 降低細胞炎癥反應

P.g-LPS 刺激后p65 蛋白表達升高（P=0.008）。NAC 和PssL-NAC 處理后細胞TLR4 蛋白表達較P.g-LPS 組顯著降低（P=0.008，P＜0.001），但與NAC 組相比，PssL-NAC 對TLR4 蛋白水平的抑制更加明顯（P= 0.008）。NAC 處理后細胞p65 蛋白表達較P.g-LPS 組下降（P= 0.034），PssL-NAC 處理細胞后，細胞p65 蛋白表達與P.g-LPS 組差異更加顯著（P＜0.001），但與NAC 組無顯著性差異（P= 0.564）。NAC 處理細胞后，細胞p-p65 蛋白表達升高，但與對照組和P.g-LPS 組無顯著性差異（P= 0.096，P= 0.140）。但PssL-NAC 組p-p65 蛋白的表達較對照組、P.g-LPS 組、NAC 組均下降（P=0.023，P=0.016，P＜0.001）（圖7）。

Figure 7 Protein expression of Toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway of gingival fibroblast cells in different treatment groups圖7 不同處理組人牙齦成纖維細胞Toll 樣受體4-核因子-κB 信號通路蛋白表達情況

3 討 論

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，可導致牙周支持組織的破壞。近年研究認為，大多數牙周組織的損傷是由白細胞、補體和ROS 參與的宿主固有免疫反應的聯合效應［7］。局部過量的ROS 已被認為是牙周炎癥加重的主要原因之一。盡管氧化應激的損傷作用已經十分明確，但生理濃度的ROS 參與的細胞生理信號傳導同樣重要［8］。因此，如何調控氧化應激環境，維持適宜的ROS 水平是治療牙周炎的潛在靶點［9］。

近年來研究者們針對高水平ROS 環境研發了各類納米遞送系統［10-11］，其中智能響應型納米釋藥體系具有生物安全性好、藥物利用率高、減少藥物局部積累等優勢［12-14］。PssL-NAC 是一種智能響應釋放、藥物的納米顆粒，其智能響應特性依賴連接PEG-PCL 分子［15-16］的硫縮酮鍵（thioketal linkages，TK）。在ROS 升高時TK 斷裂，納米顆粒裂解，納米顆粒內部包裹的藥物隨之釋放［5,17-18］。牙齦成纖維細胞是牙周組織再生修復的關鍵細胞之一［19-20］，在以P.g-LPS 為主的細菌毒力因子刺激下，牙齦成纖維細胞長期處于氧化應激狀態，細胞內炎癥介質激活，加重牙周組織炎癥反應［21］，影響細胞遷移［22］，不利于組織再生。因此本實驗使用PssLNAC 作用于炎癥狀態下的人牙齦成纖維細胞，觀察PssL-NAC 的作用效果及機制。

雖然過量ROS 會造成組織損傷，加劇炎癥發展，但其作為生理活動必備的第二信使，適宜濃度的ROS 對組織再生是有利的［23-25］。在本實驗研究結果顯示PssL-NAC 能在P.g-LPS 濃度升高的情況下維持細胞內ROS 在約2 倍對照組水平，而NAC清除由P.g-LPS 誘導的全部ROS，最終細胞內ROS 水平與對照組相當。根據RT-qPCR 實驗結果，P.g-LPS 升高導致IL-6 和TNF-α 基因表達升高，NAC 和PssL-NAC 均能使炎癥因子表達下調，但PssL-NAC 維持了稍高水平ROS 后，膠原蛋白表達較NAC 組高。細胞遷移實驗也同樣證明了維持了稍高水平ROS 能使炎癥情況下細胞遷移能力更接近于對照組。

在牙周愈合過程中，HGFs 是增殖期和重塑期的關鍵細胞。HGFs 在傷口愈合的早期和晚期分別分泌COL1 和COL3。COL1 主要存在于牙齦結締組織中，分布于整個固有層,纖維粗大成束，是促進傷口修復和硬組織再生（包括骨、牙本質和牙骨質）的必要膠原纖維。COL3 含量較少，且只在固有層中彌散分布，在增強細胞黏附和細胞增殖方面發揮著重要作用，并在軟組織傷口收縮中促進彈性血管生成［26］。有研究表明，在牙齦成纖維細胞中COL1 的表達不及牙周膜細胞多，COL3 的表達更低，其原因可能是成纖維細胞分泌的COL1 和COL3分泌到細胞外作為基質成分，因此在細胞內的膠原蛋白水平顯著下降［27］。在本實驗中觀察了PssLNAC 預處理12 h 和P.g-LPS 處理6 h 后細胞內COL1 和COL3 的表達差異，細胞內基因的表達能夠反映牙齦成纖維細胞的功能狀態，但不能反映細胞內外的膠原纖維總生成量，未來仍需進一步實驗觀察PssL-NAC 對膠原沉積的影響。因此本實驗的局限性在于并未取得PssL-NAC 在促進膠原生成的直接證據，但RT-qPCR 的結果也側面反映了PssL-NAC 通過調節細胞內適宜濃度的ROS，細胞合成膠原能力增強，細胞功能得到恢復。

研究表明細菌LPS 刺激后主要通過Toll 樣受體激活轉導信號，激活細胞內炎癥信號通路［28-29］。TLR4-NF-κB 與炎癥反應和氧化應激高度相關，ROS 激活NF-κB 信號通路，促進NF-κB 磷酸化［30］，進一步導致促炎細胞因子和趨化因子的表達［31］，觸發炎癥反應，加重牙周組織破壞［32］。本實驗中，P.g-LPS 導致HGF 細胞中p65 蛋白表達升高，PssLNAC 比起NAC 更能顯著降低TLR4-NF-κB 通路的關鍵蛋白表達，揭示了PssL-NAC 調節HGFs 細胞ROS、緩解細胞炎癥反應的機制。

綜上所述，PssL-NAC 能夠智能調節細胞內適宜濃度的ROS，通過TLR4-NF-κB 通路緩解細胞炎癥反應、促進膠原生成，保護炎癥狀態下的細胞遷移功能，本研究為PssL-NAC 作為牙周治療的新策略奠定了實驗基礎。

【Author contributions】Qiu XY performed the experiments and wrote the article.Song LT analyzed the data and wrote the article.Ren SS analyzed the data and revised the article.Miao LY designed the study, conceptualized and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.