茶多酚通過抑制NLRP3炎癥小體改善膿毒癥小鼠的急性肺損傷

凌旭光，徐雯雯，龐觀來，洪旭星，劉鳳芹，李 洋

南方醫科大學南方醫院1健康管理科，2門診部，廣東 廣州 510515；3南方醫科大學珠江醫院消化內科，廣東 廣州510280

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，發病后進展迅速并可導致多器官功能障礙。繼發于膿毒癥的急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是膿毒癥患者死亡的主要原因之一［1］。即使聯合應用機械通氣、液體管理和其他支持性治療措施，膿毒癥相關ARDS的死亡率仍較高，目前尚無具體有效的治療方案［2］。因此，闡明膿毒癥相關ALI的發病機制、找尋有效的治療藥物，對拓展其臨床治療策略具有重要意義。

膿毒癥相關ALI的主要病理事件之一是細胞因子和其他炎癥介質所介導的非受控性炎癥反應。宿主來源的危險相關分子模式（DAMPs）可在ALI期間大量生成，并成為先天免疫系統和體內炎癥的關鍵激活因子［3,4］。近年來的研究顯示，炎癥小體途徑的激活是膿毒癥相關ALI期間觸發的先天免疫防御之一［5］。一旦細胞受到危險信號刺激，細胞內信號平臺傳感蛋白即可招募適配蛋白和效應蛋白裝配形成功能性炎癥小體。目前，NLR家族NLRP3 是ALI 中研究最為廣泛的炎癥小體，NLRP3炎癥小體的活化可誘導效應蛋白caspase-1的剪切成熟并促進炎性細胞因子白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-18（IL-18）的生成［6］。IL-1β和IL-18的升高對促進肺部炎癥進展具有重要作用。此外，Caspase-1還可通過裂解Gasdermin D（GSDMD）而產生N端片段，這些片段可在質膜表面寡聚形成孔道結構，進而通過這些孔道分泌IL-1β和IL-18。質膜表面過多孔道的形成損害了質膜的完整性，可進一步導致細胞焦亡的發生。焦亡是一把雙刃劍——它通過釋放炎癥因子將免疫細胞招募到感染部位，攻擊并吞噬病原體，增強適應性免疫反應。然而，過度或不受控制的焦亡和炎癥因子的釋放則可導致器官損傷、循環衰竭甚至死亡等不良后果。臨床研究顯示，在膿毒癥誘導的ALI患者中，循環IL-18水平的升高與不良的遠期預后密切相關［7］。此外，對多種嚙齒動物所建立的ALI模型的研究發現，中和IL-18/IL-1β或拮抗IL-1β受體可減輕肺損傷［8］。因此，以NLRP3及其相關通路組分為靶點，可能是治療膿毒癥ALI的潛在途徑。

茶多酚（TP）是茶葉中多酚的總稱［9］，其主要成分包括兒茶素、黃酮類、黃酮醇、花青素、酚酸、酚酸和多酚等［10］。近期研究顯示，TP對多種因素誘導的肺損傷及ARDS等疾病具有不同程度的治療效果［11,12］。然而在膿毒癥相關ALI方面，以TP為治療手段的相關研究較少，其是否能夠改善膿毒癥相關ALI以及該過程的具體調控機制尚待進一步探索。

研究顯示［13］，TP對多種疾病的治療效果與其強大的抗氧化功能密切相關。細胞內氧化應激水平的升高和活性氧代謝產物（ROS）濃度的增加對NLRP3炎癥小體的裝配與活化具有顯著的誘導作用［14］。目前，針對TP改善NLRP3相關炎癥的機制研究較少，急性肺損傷時，TP對膿毒癥相關肺組織內氧化應激以及活性氧代謝產物的調控尚未見諸報道。因此，TP是否能夠通過下調肺組織內氧化應激水平進而抑制NLRP3相關炎癥，最終改善膿毒癥相關ALI，值得深入探討，對于找尋ALI新的治療靶點和治療方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性SPF級C57 BL/6小鼠60只，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 實驗試劑 蘇木素-伊紅染色試劑盒（雷根生物技術）；髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）及過氧化氫（H2O2）檢測試劑盒，IL-1β、TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附實驗試劑盒（建成生物）；強效RIPA 裂解液（碧云天）；MPO 抗體、caspase-8 抗體、NLRP3 抗體、caspase-1 抗體、ASC抗體、NOX4抗體、GAPDH抗體（Abcam）；生物素高效標記山羊抗兔IgG（碧云天）；DAB顯色試劑盒（中杉金橋）；Cy3標記山羊抗兔熒光二抗、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠熒光二抗（碧云天）。本研究經南方醫院動物實驗《實驗動物倫理委員會》審核批準（NFYY-2020-0139）。

1.2 膿毒癥肺損傷模型小鼠建立

60只C57 BL/6小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、盲腸結扎穿孔組（CLP組）和盲腸結扎穿孔+TP治療組（CLP+TP組），每組20只。CLP組與CLP+TP組小鼠以盲腸結扎穿孔建立膿毒癥肺損傷模型：盲腸結扎穿孔方法：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，將小鼠固定于小動物手術臺，常規備皮消毒，于鼠體正中線右側0.5 cm處肋弓下緣水平縱行逐層切開腹壁，切口約1 cm，游離小鼠盲腸，以4-0手術縫線在距離盲段1.5 cm處結扎小鼠盲腸，隨后以18號注射器針頭于盲腸結扎遠端做2次對穿并擠出少許糞便，最后還納盲腸并置于腹腔前壁，逐層關腹。Sham組小鼠開腹后僅對盲腸進行暴露與探查，不進行結扎穿孔。CLP+TP組小鼠于術前1周開始，按250 mg/（kg·d）劑量給予TP灌胃處理。建模完成后，每組隨機選取10只小鼠觀察記錄死亡時間并繪制生存曲線，其他小鼠于建模后24 h以頸椎脫臼法處死并取材進行后續研究。

1.3 標本采集與檢測

1.3.1 標本采集 建模完成24 h后，以頸椎脫臼法處死小鼠，隨后自胸骨正中線打開胸腔并暴露肺臟，小心將肺臟自胸腔游離后，浸入無菌PBS內漂洗以去除肺葉表面血液。剪取小鼠左肺組織置入RIPA裂解液內（按每20 mg組織配比200 μL裂解液），4 ℃環境充分勻漿后，以4 ℃，12 000 r/min條件離心15 min，取上清以備后續相關蛋白檢測；剪取小鼠右上肺用于檢測肺組織濕/干重比值檢測；剪取小鼠右肺中葉于4%甲醛溶液中固定以制備石蠟標本進行后續病理檢測；剪取小鼠右肺下葉用于MPO、MDA、H2O2檢測。

1.3.2 肺組織濕/干重比檢測 以濾紙吸干右肺上葉表面血液，置入電子天平稱量并記錄肺組織濕質量，隨后將各組小鼠肺組織置于恒溫箱內，設定溫度60 ℃并脫水干燥過夜，再次于電子天平上稱量并記錄各組小鼠肺組織干質量。計算肺組織濕/干質量比。

1.3.3 肺組織病理染色及肺損傷評分 以4%甲醛固定各組小鼠右肺中葉24 h，隨后肺組織行常規脫水及石蠟包埋、切片，以蘇木素-伊紅染色試劑盒對各組小鼠肺組織石蠟切片進行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理結構變化。肺損傷評分參考卜克等［15］文獻報道，從肺泡水腫、出血、肺不張、炎性細胞浸潤及透明膜形成等5方面評分（每項正常0、輕度1、中度2、重度3，最高15分）。

1.3.4 免疫組化及免疫熒光檢測 石蠟切片常規脫蠟至水后，浸入枸櫞酸鹽內進行微波抗原修復，修復完成待玻片冷卻后滴加過氧化氫以滅活內源性過氧化物酶（免疫熒光染色跳過此步驟），5%山羊血清封閉30 min后滴加一抗，4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成后洗滌標本，滴加相應二抗（免疫熒光染色應注意避光操作），37 ℃孵育30 min后，洗滌二抗。免疫組化以蘇木素染核后脫水封片；免疫熒光以DAPI染核后直接封片。

1.3.5 蛋白免疫印跡實驗 提取各組小鼠左肺總蛋白并測定蛋白濃度后，將蛋白與上樣緩沖液混合并于100 ℃下水浴變性5 min。隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳及轉膜。轉膜完成后以5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，隨后加入相關一抗于4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成后洗滌并繼續加入熒光二抗，室溫孵育30 min后壓干，以近紅外掃描儀掃描并分析。

1.3.6 MPO、MDA、H2O2檢測 取各組小鼠右肺下葉組織進行檢測，相應檢測步驟嚴格遵照各檢測試劑盒說明書進行。

1.4 統計與繪圖

使用Graph Pad Prism version 7.0軟件，數據以均數±標準差表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，當Ρ＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TP緩解CLP誘導的小鼠ALI

生存曲線顯示術后12～36 h CLP組小鼠存活率明顯下降，術后72 h內CLP組小鼠存活率較Sham組小鼠顯著降低；而與CLP組相比，CLP+TP組小鼠術后72 h內死亡率顯著降低，生存曲線可見CLP+TP組小鼠于術后36～48 h呈明顯下降趨勢，較CLP組小鼠顯著延后（圖1A，Ρ＜0.05）。肺濕/干質量比及MPO測定顯示，與假手術組相比，CLP組小鼠肺濕/干質量比及MPO含量顯著升高，而CLP+TP組小鼠肺濕/干質量比及MPO含量則較CLP組顯著下降（圖1B、C，Ρ＜0.05）。H&E染色可見CLP組小鼠肺組織內充血、間質水腫，肺泡結構損傷，肺泡腔范圍減少，淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞等炎性細胞大量浸潤，而TP治療組小鼠肺組織內病變程度較CLP組顯著減輕，ALI評分提示，與CLP組小鼠相比，TP治療組小鼠ALI評分顯著降低（圖1D、E，Ρ＜0.05）。

2.2 TP減輕CLP小鼠肺內NLRP3相關炎癥

ELISA檢測結果顯示，CLP術后小鼠肺組織內IL-1β、TNF-α及IL-6等炎癥因子含量顯著升高，而CLP+TP組小鼠肺組織內上述炎癥因子水平則較CLP組顯著降低（圖2A，Ρ＜0.05）；Western blot檢測結果顯示，與假手術組相比，CLP組小鼠肺組織內NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達水平顯著升高，而CLP+TP組小鼠肺組織內上述蛋白表達水平較CLP組顯著降低（圖2B，Ρ＜0.05）。免疫組化檢測結果顯示，與Sham組相比，CLP組小鼠肺組織內MPO、caspase-8及NLRP3蛋白表達顯著上調，而TP治療則可顯著抑制CLP所誘導的上述蛋白在肺組織內的表達（圖2C）。

圖2 TP抑制CLP小鼠肺組織內炎癥相關蛋白表達Fig.2 TP inhibits expressions of inflammationrelated proteins in the lung tissues of CLP mice detected using ELISA(A),Western blotting(B)and immunohistochemistry (C).*P＜0.05 vs Sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

2.3 TP抑制CLP小鼠肺內氧化應激

各組小鼠肺組織MDA及H2O2水平檢測結果顯示，CLP術后小鼠肺內MDA及H2O2水平較假手術組顯著升高，而TP治療組小鼠肺組織內MDA及H2O2水平則較CLP組顯著降低（圖3A、B，Ρ＜0.05）。對氧化應激相關蛋白NOX4的免疫組化檢測結果顯示，TP治療可顯著抑制CLP 所誘導的小鼠肺組織內NOX4 蛋白表達（圖3C）。NLRP3及NOX4蛋白的免疫熒光共染檢測結果顯示，CLP組小鼠肺組織內上述2種蛋白表達顯著增多且具有明顯共定位，而TP可抑制CLP術后小鼠肺組織內NLRP3及NOX4蛋白表達并減少二者的共定位（圖3D）。

圖3 TP影響CLP小鼠肺組織內氧化應激水平Fig.3 TP lowers oxidative stress level in the lung tissue of CLP mice.A:MDA level in the lung tissues.B:H2O2 level in the lung tissues.C: Immunohistochemical staining of NOX4 in the lung tissues. D: Immunofluorescence detection of NLRP3 and NOX4 in the lung tissues.*P＜0.05 vs Sham group;#P＜0.05 vs CLP group.

3 討論

膿毒癥相關肺損傷是一種嚴重的肺部疾病，以肺部毛細血管水腫為特征并可導致急性呼吸衰竭［16］。促炎細胞因子的大量生成和肺內細胞過度的炎癥反應是膿毒癥相關肺損傷的關鍵病理因素［17］。因此，探索和開發新的抗炎物質對預防和治療膿毒癥相關肺損傷至關重要。

目前，針對TP改善NLRP3相關炎癥的機制研究較少，急性肺損傷時，TP對膿毒癥相關肺組織內氧化應激以及活性氧代謝產物的調控尚未見諸報道。因此，TP是否能夠通過下調肺組織內氧化應激水平進而抑制NLRP3相關炎癥，最終改善膿毒癥相關ALI，值得深入探討。本研究利用CLP法成功建立膿毒癥相關ALI小鼠模型，通過給予小鼠TP處理后，發現TP可有效減少CLP術后小鼠肺組織內炎癥因子水平、減輕CLP引起的小鼠ALI并降低小鼠死亡率。同時，本研究的免疫熒光共染檢測結果提示，TP改善CLP小鼠ALI的機制可能與其減輕CLP后肺內氧化應激、抑制小鼠肺組織內NLRP3炎癥小體相關炎癥因子釋放有關。

既往研究證實，TP具有廣泛的抗炎活性［18］。Li等［19］研究發現，在脂多糖誘導的膿毒血癥動物模型中，TP可明顯抑制內毒素誘導的TNF-α分泌，改善血流動力學狀態，降低內毒素的致死率。研究顯示，TP的主要有效成分之一，表沒食子兒茶酚胺（EGCG）可通過調控IL-1β抑制白細胞活化，從而發揮抗炎作用［20］。由此可見，TP對感染性炎癥相關的多種疾病具有一定的治療作用。與本研究一致的，Bae等［21］通過脂多糖誘導建立小鼠ALI模型后，觀察到EGCG可通過調控ERK1/2信號通路和JNK蛋白的磷酸化水平降低炎性因子表達，抑中性粒細胞在肺內的聚集，進而減輕脂多糖造成的肺損傷。因此，TP的抗炎特性使其在膿毒癥相關ALI中具有良好的潛在轉化價值。

有研究認為［22］，NLRP3炎癥小體參與了多種炎癥相關疾病，可能是炎癥性疾病發生發展過程中的關鍵調控因子。研究顯示［23］，胞內氧化還原失衡是NLRP3的活化的關鍵途徑之一。研究顯示，失血性休克時，高遷移率蛋白1可通過TLR4模式激活肺內皮細胞NAD(P)H氧化酶，而激活后的NAD(P)H氧化酶所生成的ROS可進一步解離與硫氧還原蛋白互作的蛋白，使之轉而與NLRP3蛋白結合，而誘導NLRP3炎癥小體活化和IL-1β的分泌［24］。因此，對細胞內氧化還原平衡的調控可能是抑制NLRP3炎癥小體活化、改善相關疾病炎癥反應的潛在有效靶點。

由于細胞內氧化應激水平升高所引起的ROS大量生成是NLRP3活化的關鍵誘導劑之一。多項研究證實TP具有顯著的抗氧化作用［25］，與本研究一致。本研究首次發現TP可抑制CLP小鼠肺組織內氧化應激相關蛋白NOX4表達并減少ROS生成；同時，對膿毒癥肺損傷小鼠肺組織的免疫熒光染色檢測結果顯示：氧化應激相關蛋白NOX4與NLRP3蛋白在CLP小鼠肺組織內表達顯著增多且具有明顯的共定位，而應用TP治療后，上述2種蛋白在小鼠肺組織內的表達下調、共定位減少，提示TP可能通過抑制NOX4相關氧化應激反應，下調肺組織內ROS含量，阻礙NLRP3炎癥小體的活化，進而減少膿毒癥相關肺損傷時肺內炎癥因子的釋放，最終改善膿毒癥相關肺損傷。值得指出的是，Wang等［26］在近期研究中指出，GSDMD并非誘導焦亡的唯一途徑，LPS刺激可通過caspase-3和GSDME相關信號通路誘導細胞焦亡從而替代傳統的GSDMD或caspase-1信號通路而發揮NLRP3的促炎和促焦亡作用。本研究關于TP對NLRP3與氧化應激相關通路的探討，受限于臨床樣本獲取的困難，未能其下游對GSDMD和GSDME炎癥信號通路的調控作進一步研究。此外，TP對肺內巨噬細胞炎癥的調控機制可能存在多種效應，相關的挽救機制亦有待深入探討。

綜上所述，本研究明確了TP治療可抑制NLRP3炎癥小體并減輕膿毒癥小鼠肺損傷，且這一作用可能依賴TP通過抑制NOX4所發揮的抗氧化效應。但由于本研究局限于動物組織和病理層面觀察，因此NOX4 與NLRP3蛋白的相互作用關系及TP對膿毒癥時肺組織內氧化應激與炎癥小體調控的具體機制仍有待進一步探討。