BZW1 高表達促進胃癌細胞的侵襲和轉移：基于調控Wnt//βcatenin通路和促進上皮間質轉化

張文靜，張 諾，楊 子，張小鳳，孫奧飛，王 煉，，宋 雪，耿志軍，李 靜，，胡建國，

蚌埠醫學院第一附屬醫院1檢驗科，2胃腸外科，3中心實驗室，安徽 蚌埠 233004；4炎癥相關性疾病基礎與轉化研究安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠233004

胃癌發病率在全球惡性腫瘤中居第5位，死亡率居第4位，造成了極大的社會危害［1,2］。盡管胃癌的治療技術手段取得了長足進步，但患者術后5年生存率并未得到顯著改善，這一定程度上歸咎于胃癌細胞的高轉移率［3］。上皮間質轉化（EMT）是導致胃癌高度侵襲和廣泛轉移的重要機制［4,5］。堿性亮氨酸拉鏈蛋白1（BZW1）是bZIP超家族的成員［6］。研究顯示，BZW1在膠質瘤中高表達并可通過促進腫瘤細胞的遷移進而影響患者預后［7］。同時，既往研究顯示BZW1可通過促進肺腺癌細胞遷移和侵襲加快腫瘤進程，且與患者預后不良有關［8］。此外，BZW1被報道在黏液表皮樣癌組織中呈現高表達，而下調BZW1可抑制癌細胞的遷移和侵襲［6］。然而，BZW1在胃癌中的表達情況及其對患者預后的影響和可能的作用機制尚未見報道。本研究聯合TCGA等在線公共數據庫和本機構臨床病例資料明確BZW1在胃癌組織中的表達情況及其對患者預后的影響，采用細胞學實驗分析BZW1的作用途徑，富集分析聯合體外實驗驗證BZW1可能的作用機制，以期為胃癌臨床診療靶點的選擇及預后評估提供新的參考。

1 資料和方法

1.1 研究對象和資料

選取2014年1月～2016年12月在我院接受胃癌根治術治療的患者。納入標準：確診為原發性胃癌；臨床病理資料完整。排除標準：合并其他組織起源的惡性腫瘤；術前接受過針對胃癌治療的其他方法；死于胃癌以外的其他原因。本研究共納入患者共102例，收集患者如下信息：基線資料：從醫院電子病例系統采集患者性別、年齡、術前外周血癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）、腫瘤臨床分期和手術病理診斷等臨床信息；隨訪資料：術后通過電話隨訪的方式獲取患者術后5年生存情況、死亡時間及原因。手術病理蠟塊：從醫院病理科調取胃癌患者癌組織和配對癌旁組織蠟塊。冰凍組織：從醫院生物標本庫系統調取20例胃癌患者的癌組織和配對癌旁組織冰凍標本。本研究獲得我院倫理委員會的批準（倫科批字[2021]第203號）。

1.2 材料

胃癌細胞株MGC803（國家生物醫學實驗細胞資源庫）；兔抗BZW1多克隆抗體（武漢三鷹）；兔抗Wnt3a多克隆抗體、兔抗β-catenin多克隆抗體、兔抗C-myc多克隆抗體、兔抗N-cadherin多克隆抗體、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗E-cadherin多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體（Abcam）；反轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒（Takara）；胎牛血清、RPMI 1640培養基、抗青霉素鏈霉素雙抗混合液、PBS緩沖液、胰酶（GIBCO）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（上海酶聯生物）；基質膠和Transwell小室（Corning）；特異性過表達和干擾BZW1基因的慢病毒載體及對照空載質粒（上海吉凱基因）；倒置成像顯微鏡（蔡司）。

1.3 生物信息學分析BZW1表達、與胃癌疾病進展的關系及對預后的影響

本研究通過TIMER 數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）中的TCGA 數據（407 例）分析BZW1 在泛癌中的表達情況；通過UALCAN 數據庫（http://ualcan.path.uab.edu）中 的TCGA 數據分析BZW1與胃癌分級（440例）、分期（385例）之間的相關性；采用Kaplan-Meier Plotter 數據庫（https://kmplot.com/analysis/）中的GEO數據分析BZW1對患者預后的影響；采用cBioPortal獲取胃癌中BZW1的共表達基因，并基于DAVID數據庫進行KEGG信號通路富集分析預測BZW1可能的作用機制。

1.4 免疫組化分析BZW1在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況

將手術病理蠟塊制成4 μm厚度的切片，60 ℃烤片2 h，依次經脫蠟水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉，孵育一抗BZW1（1∶800，武漢三鷹）及酶標二抗、DAB顯色、復染細胞核后進行脫水封片。采集圖片，并使用Image-Pro Plus6.0軟件分析目標蛋白的相對積分光密度（IOD）值。以胃癌組織中BZW1相對表達量的中位數為界，將胃癌患者分為BZW1高表達組（n=51）和低表達組（n=51）。

1.5 RT-qPCR 檢測胃癌組織和癌旁組織中BZW1 的mRNA表達水平

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA后，在QuantStudio DX系統進行實驗，并利用2-ΔΔCt法計算BZW1相對mRNA表達量。引物序列由上海生工公司設計合成，序列如下：GAPDH 上游：TGGCCTTCCGTGTTCCTAC，下游：GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA；BZW1上游：5'-ACT GGTGTTCTTCTGGCTAA-3'，下游：5'-GTGCTCATT ACACTTGACCA-3'。

1.6 調控BZW1基因表達對MGC803細胞遷移、侵襲的影響及可能的作用途徑和機制

1.6.1 細胞培養、轉染和分組 將MGC803細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中（37 ℃，5%CO2）；待細胞密度達70%～80%時，分別將空載體、干擾BZW1載體（si-CAGCGTTTTAAAACTAGAAAAAG）和過表達BZW1載體轉染至MGC803細胞中，使用嘌呤霉素篩選穩定表達的細胞株，并通過Western blot驗證轉染效果（實驗分組：Control，Si-BZW1，LVBZW1）。此外，采用Wnt/β-catenin 通路抑制劑XAV-939（10 μmol/L）［9,10］處理過表達BZW1 基因的胃癌細胞，以進一步分析Wnt/β-catenin信號對胃癌細胞EMT的影響（實驗分組：Control，LV-BZW1，XAV-939）。

1.6.2 Transwell 實驗分析BZW1 對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 將轉染成功后的MGC803細胞（5×104）加 入Transwell 上室，下室加入1 mL 含10% FBS 的RPMI 1640培養基，并于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h；經4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色后，于顯微鏡下計數遷移細胞數量。在Transwell上室中預鋪基質膠，按照同樣的方法進行實驗，觀察BZW1對胃癌細胞侵襲能力的影響。

1.6.3 Western blot法檢測蛋白表達 加入RIPA裂解液裂解并提取MGC803細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，各組取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，再經過轉膜、封閉后，滴加一抗BZW1（1∶500，武漢三鷹）、Wnt3a（1∶1000，abcam）、β-catenin（1∶5000，abcam）、Cmyc（1∶1000，abcam）、N-cadherin（1∶5000，abcam）、Vimentin（1∶1000，abcam）、E-cadherin（1∶10 000，abcam）或β-actin（1∶1000，abcam），并置4 ℃孵育過夜；再經TBST洗膜、孵育酶標二抗、ECL超敏發光液顯色及凝膠成像系統采集圖片，最后使用ImageJ軟件對結果進行定量分析，以β-actin為內參，計算目標蛋白的相對表達量。

1.7 統計學分析

采用SPSS 26.0 進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗進行兩組間比較；采用Spearman檢驗進行相關性分析；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier（K-M）曲線用于比較患者術后5年生存率的差異；Cox比例風險回歸模型分析用于多因素分析；采用受試者工作曲線（ROC）評估BZW1預測胃癌患者術后5年生存率的診斷價值；多組之間比較采用單因素方差分析，兩組間比較使用Tukey多重檢驗法；Ρ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BZW1在胃癌組織中高表達

TCGA數據分析發現，BZW1在包括胃癌在內的多數腫瘤組織中的mRNA表達量均升高（Ρ＜0.05，圖1A）。通過本機構收治的病例標本分析顯示，BZW1在胃癌組織中的蛋白及mRNA 表達水平均高于癌旁組織（Ρ＜0.05，圖1B～D）。

圖1 BZW1在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況Fig.1 Expression of BZW1 in gastric cancer tissues and adjacent tissues.A:Expression of BZW1 in various tumor tissues analyzed by Timer 2.0 database. B, C: Protein expression levels of BZW1 in gastric cancer tissues and adjacent tissues detected by immunohistochemistry. D:Expression levels of BZW1 mRNA in gastric cancer tissues and adjacent tissues detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs cancer.

2.2 胃癌組織中BZW1的表達量與外周血腫瘤標志物水平呈正相關

胃癌組織中BZW1 相對表達量與患者外周血中CEA（r=0.623，Ρ＜0.01，圖2A）及CA19-9（r=0.552，Ρ＜0.01，圖2B）水平均存在正相關關系。

圖2 胃癌組織中BZW1的表達量與外周血腫瘤標志物的相關性Fig.2 Correlation between BZW1 expression levels in gastric cancer tissues and the levels of peripheral blood tumor markers CEA(A)and CA19-9(B).

2.3 BZW1的表達水平與多種臨床病理參數相關

UALCAN數據庫的TCGA數據分析發現，BZW1的表達水平與胃癌患者腫瘤分級（440例）和分期（385例）呈正相關（Ρ＜0.01，圖3A、B）。BZW1 高表達組中CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、G3-4期、T3-4期及N2-3期的患者比例高于低表達組（Ρ＜0.01，表1）。

表1 胃癌組織中BZW1表達量與患者臨床病理參數間的關系Tab.3 Correlation of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues and clinical pathological parameters of the patients

2.4 BZW1在胃癌中高表達與患者預后不良相關

Kaplan-Meier Plotter數據庫中的GEO數據分析顯示，BZW1高表達組患者的總生存期較低表達組降低（Ρ＜0.01，圖4A）。對本機構病例資料進行K-M生存分析顯示，BZW1高表達組患者術后5年生存率低于低表達組（Ρ＜0.01，圖4B）。

圖4 胃癌組織中BZW1表達量對患者術后5年生存率的影響Fig.4 Impact of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues on 5-year survival rate of the patients.A:Prediction of the long-term prognosis of gastric cancer patients based on BZW1 using the Kaplan-Meier Plotter database.B:K-M survival curve analysis of the impact of BZW1 expression levels in gastric cancer tissues on 5-year survival rate of patients.

2.5 BZW1高表達是影響胃癌患者根治術后5年生存率的獨立危險因素

單因素結合Cox多因素分析顯示，BZW1高表達、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3-4期、N2-3期是影響胃癌患者根治術后5年生存率的獨立危險因素（Ρ＜0.05，表2）。

表2 影響胃癌根治術后5年生存率的單因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analyses of the factors affecting the 5-year survival rate after radical surgery for gastric cancer

2.6 BZW1對胃癌患者術后5年生存率的評估價值

ROC分析顯示，以BZW1相對表達量3.61為截點值，BZW1 預測胃癌患者術后5 年死亡的敏感性為75.56%，特異性為71.93%，曲線下面積為0.732（Ρ＜0.01，圖5）。

圖5 BZW1對胃癌患者預后的評估價值Fig.5 Assessment of the prognostic value of BZW1 for gastric cancer patients.

2.7 BZW1促進胃癌細胞的遷移和侵襲

采用慢病毒轉染的方式分別構建下調和上調BZW1基因的胃癌細胞系（MGC803），Western blot結果顯示慢病毒轉染成功（Ρ＜0.05，圖6A、B）。Transwell實驗結果顯示，下調BZW1可抑制MGC803細胞的遷移和侵襲，而上調則相反（Ρ＜0.05，圖6C～E)。

圖6 BZW1促進胃癌細胞的遷移與侵襲Fig.6 BZW1 overexpression promotes gastric cancer cell migration and invasion.A:Validation of BZW1 protein expression after lentivirus transfection using Western blotting. B: Quantitative analysis of the relative expression levels of BZW1 protein. C:Transwell experiment for analyzing the impact of BZW1 on the migration and invasion abilities of gastric cancer cells. D:Quantitative analysis of the number of migrated cells.E:Quantitative analysis of the number of invaded cells.*P＜0.05 vs Control.

2.8 BZW1促進胃癌細胞的EMT進程

Western blot檢測結果顯示，上調BZW1可促進胃癌細胞中N-cadherin與Vimentin的表達，同時抑制Ecadherin 的表達，而下調BZW1 則呈現相反的結果（Ρ＜0.05，圖7A、B）。

圖7 BZW1促進胃癌細胞EMT進程Fig.7 BZW1 overexpression promotes EMT of gastric cancer cells.A:Detection of expression levels of the key protein markers of EMT using Western blotting.B:Quantitative analysis of the relative expression levels of the protein markers.*P＜0.05 vs Control.

2.9 BZW1通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與促進EMT進程

KEGG通路富集分析顯示，BZW1的功能可能與Wnt信號有關（圖8A）。Western blot實驗結果證實，下調BZW1 可抑制Wnt/β-catenin 信號通路關鍵蛋白Wnt3a、β-Catenin、C-myc的表達，上調則反之（Ρ＜0.05，圖8B、C）。此外，使用Wnt/β-catenin 通路抑制劑XAV-939可削弱BZW1對EMT關鍵蛋白（N-cadherin、Vimentin及E-cadherin）的激活作用（Ρ＜0.05，圖8D、E）。

圖8 BZW1激活Wnt/β-catenin信號通路促進EMT進程Fig.8 BZW1 overexpression activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote EMT of gastric cancer cells.A:KEGG enrichment analysis of co-expressed genes with BZW1. B: Detection of expression levels of the key protein markers of the Wnt/β-catenin signaling pathway using Western blotting. C: Quantitative analysis of the expression levels of the key protein markers of the Wnt/β-catenin signaling pathway.D:Detection of protein expression of the key EMT markers using Western blotting.E:Quantitative analysis of protein expression levels of the key EMT markers.*P＜0.05 vs Control.

3 討論

本研究明確了BZW1在胃癌組織中表達水平，并進一步分析了其與患者遠期預后的關系及可能的作用機制。本研究發現BZW1在胃癌組織中表達升高，并影響胃癌惡性進展和患者術后5年生存率；BZW1對胃癌細胞遷移、侵襲及EMT 進程的促進作用可能與激活Wnt/β-catenin信號有關。

雖然既往并無BZW1參與胃癌進展的報道，但有研究表明，BZW1在前列腺癌、胰腺導管癌等腫瘤組織中表達升高，并參與了腫瘤細胞的惡性進展［11,12］，而本研究結合生物信息學和臨床病例分析發現，BZW1在胃癌組織中高表達并影響患者預后。本研究利用癌癥公共數據庫證實BZW1在包括胃癌在內的多種腫瘤組織中高表達，且通過本機構納入的胃癌患者病理標本分析進一步證實，BZW1在胃癌組織中的蛋白和mRNA水平均顯著增加，提示BZW1在胃癌發生或發展中可能發揮某種作用。外周血CEA和CA19-9在胃腸道腫瘤診斷、病情評估及預后判斷中的重要價值受到高度認可，是當前應用較為廣泛的腫瘤標志物［13,14］。然而，本研究發現胃癌組織中BZW1 的表達量與患者外周血CEA 和CA19-9水平呈顯著正相關，也與胃癌病理G分級和浸潤程度等臨床病理參數密切相關，提示BZW1參與了胃癌的惡性進展。為進一步探究BZW1在胃癌診療中的潛在價值，我們通過Kaplan-Meier Plotter數據庫及對本機構納入的臨床病例資料進行分析，發現。BZW1在胃癌組織中高表達與患者預后不良相關。更為重要的是，單因素結合Cox多因素分析提示BZW1高表達是影響胃癌患者術后5年生存率的獨立危險因子。此外，ROC分析顯示BZW1對胃癌患者術后5年生存率具有較高的判斷價值。以上結果說明BZW1在胃癌組織中高表達與疾病惡性進展和患者預后密切相關，但其具體作用途徑有待進一步研究。

腫瘤細胞的遷移和侵襲是影響胃癌疾病進展和患者預后的關鍵因素［15,16］。為探究BZW1影響胃癌患者遠期預后的功能學途徑，我們采用慢病毒轉染的方式分別上調和下調胃癌細胞中BZW1的表達水平，并通過Transwell實驗發現下調BZW1可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，上調則反之。EMT是腫瘤細胞發生轉移重要的途徑之一［17,18］，且既往有多項研究表明調控腫瘤細胞的EMT進程可抑制胃癌細胞的惡性行為，如FBL1M1可促進胃癌細胞EMT過程從而參與胃癌惡性行為的調控［19］，以及敲減CPNE7可通過影響EMT進程抑制胃癌細胞增殖、遷移與侵襲［20］。而該過程伴隨著上皮細胞表面標志物E-cadherin表達降低和間質細胞表面標志物N-cadherin和Vimentin表達升高［21,22］。本研究發現，上調BZW1可促進胃癌細胞EMT進程，而下調BZW1則抑制其進程。以上結果證明BZW1可能通過促進胃癌細胞EMT進程參與其惡性行為，從而部分解釋了我們臨床研究中發現的BZW1促進胃癌疾病進展及與患者預后不良的關系；同時，也拓展了胃癌EMT生物過程新的調控因子。

最后，本研究嘗試探討BZW1調控胃癌細胞EMT進程的分子機制。首先，通過生物信息學富集分析我們發現BZW1在胃癌中的作用可能與Wnt信號有關。既往研究表明Wnt/β-catenin信號是調控細胞EMT進程的重要通路［24,25］，下調其關鍵通路蛋白Wnt3a、β-catenin、C-myc的表達可抑制腫瘤細胞的EMT進程［5,25-27］。通過細胞學實驗我們發現，下調BZW1 可抑制Wnt3a、βcatenin、C-myc蛋白的表達，上調則反之；而使用Wnt/βcatenin信號抑制劑XAV-939可部分消除上調BZW1對胃癌細胞EMT 的促進作用。XAV-939 是一種靶向Wnt/β-catenin信號通路特異性的小分子抑制劑，可通過抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶使Axin 蛋白穩定，抑制β-catenin介導的轉錄從而阻斷Wnt/β-catenin信號通路［28］。這些結果表明BZW1對胃癌細胞EMT進程的促進作用，可能與激活Wnt/β-catenin信號有關。這一研究結果不僅拓展了對BZW1生物學功能的認識，還有望為胃癌的臨床診療提供新的靶標。

本研究尚存在以下不足：由于納入臨床病例樣本量較少，本研究所得結果仍需進一步擴大樣本量進行驗證；盡管本研究證實BZW1可能通過激活Wnt/β-catenin信號促進胃癌EMT進程，但仍不能排除其通過其他途徑參與胃癌疾病進展的可能。

綜上所述，BZW1在胃癌組織中表達升高影響胃癌惡性進展和患者預后，可能與激活Wnt/β-catenin信號促進胃癌細胞EMT進程有關。