分料發酵紅酸湯乳酸菌和酵母菌的分離鑒定及應用

胡悅,劉娜,秦禮康*,包愛明,秦偉軍,梁小央

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550000)2(貴州南山婆食品加工有限公司,貴州 安順,561000)

紅酸湯屬于蔬菜類發酵食品[1],主要以辣椒和番茄為原料發酵制成,因色澤誘人、酸辣適口以及富含多種營養功能成分,成為貴州省內苗族、侗族的一種特色傳統美食。但傳統紅酸湯發酵周期1個月到12個月不等,容易引起微生物菌群波動,導致發酵紅酸湯風味及品質不穩定,這已成為制約紅酸湯發展的關鍵技術瓶頸。民間常見傳統發酵工藝是由紅辣椒和番茄分別輔以糯米飯、食鹽、大蒜等發酵制成“番茄酸湯”和“辣椒酸湯”半成品,再按1∶1比例混合進行二次發酵制成紅酸湯[2],即分料發酵工藝。另一種是直接將番茄、辣椒、糯米、食鹽等混合發酵,即混料發酵工藝。值得注意的是,分料發酵工藝是通過番茄酸湯和辣椒酸湯分料發酵后再將二者混合發酵,更多的、復雜的微生物群落物種在適宜環境下相互作用后發酵產生有機酸、氨基酸等風味成分,從而最大限度保持或增加紅酸湯的風味品質。

發酵紅酸湯因其不同的發酵環境和生態系統,導致微生物菌群結構不同,但乳桿菌科(Lactobacillaceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)作為共性優勢菌,在紅酸湯發酵中發揮著重要作用。何揚波等[3]表明納木雷氏乳桿菌(Lactobacillusnamurensis)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)分別為辣椒酸湯和番茄酸湯的優勢乳酸菌,漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)分別為兩種酸湯發酵后期的優勢真菌。LIN等[4]發現德凱拉菌屬(Dekkera)和畢赤酵母屬(Pichia)是番茄酸湯中的主要優勢菌,酵母菌屬和畢赤酵母屬是辣椒酸湯中的主要真菌,畢赤酵母屬是另一種番茄酸湯中的主要真菌。王琪琪等[5]發現辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯的優勢細菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus),辣椒紅酸湯的優勢真菌為Kazachstania、酵母屬、雙足囊菌屬(Dipodascus)、畢赤酵母屬,番茄紅酸湯的優勢真菌為Kazachstania、畢赤酵母屬。宮路路等[6]發現凱里紅酸湯3個樣品細菌群落多樣性各有差異,ST9和ST10樣品優勢菌屬為乳酸桿菌屬,ST22樣品優勢細菌主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Aeribacillus等。

除高通量測序外,研究者還用傳統培養的方法,對微生物優勢功能微生物進行篩選、分離、鑒定。田永峰[7]在苗酸湯中篩選出了pH下降快、產酸率高的嗜酸乳桿菌,但并未對菌株產酸量進行研究。張玉龍等[8]從紅酸湯篩選出產胞外多糖和抗氧化能力的葡萄球菌H1(StaphylococcusH1),但未對其產酸能力進行研究。鄭莎莎等[9]采用紅酸湯中優勢菌干酪乳桿菌H1(LactobacilluscaseiH1)和鼠李糖乳桿菌H3(LactobacillusrhamnosusH3)強化發酵紅酸湯,但未見菌種特性的報道。XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優勢菌種布氏乳桿菌H9(LactobacillusbuchneriH9),產酸能力為(3.268±0.016) g/L。賀曉潔等[11]從傳統發酵辣椒酸湯中篩選出1株耐鹽植物乳桿菌L-14(LactobacillusplantarumL-14),并測得產酸量為(7.770±0.033) g/L。上述研究中僅對紅酸湯及其半成品的微生物進行了優勢菌種的篩選,局限于紅酸湯微生物區系的探討和菌株的產酸性能研究,對酸湯中菌株的益生特性研究較少。近年來,具備胃腸道耐受性和抗氧化能力的菌株備受關注,相關研究大多集中在泡菜和乳品中乳酸桿菌的耐酸、耐膽鹽和抗氧化性能[12-14]方面,而鮮有關于紅酸湯中功能益酵菌株的相關報道。

本研究分別以分料發酵的優質番茄酸湯、辣椒酸湯和混合酸湯為菌源,分離篩選并鑒定出益酵乳酸菌和酵母菌,并研究其應用特性,初步構建一種可應用于紅酸湯強化發酵模式的級聯發酵體系,為人工接種乳酸菌和酵母菌強化發酵紅酸湯提供理論應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:貴州南山婆食品加工有限公司2020年下半年所產分料發酵紅酸湯的3個組成部分,分別是TA1、TA2和TA3(番茄酸湯),CA1和CA2(辣椒酸湯),MA1和MA2(混合酸湯),均于2021年11月采集,4 ℃條件下運往實驗室。

材料與試劑:牛膽鹽、美藍染液、革蘭氏染色試劑套盒、抗氧化能力檢測試劑盒[羥自由基(·OH)、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力],北京索萊寶科技有限公司;MRS、PDA、YPD瓊脂培養基和MRS、PDB、YEPD液體培養基,上海博微生物科技有限公司;NaCl、H2O2、NaOH、丙三醇、濃鹽酸等均為國產分析純,天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DMEX20電子顯微鏡,寧波舜宇儀器有限公司;SW-CJ-2D0雙人凈化工作臺,浙江蘇凈凈化設備有限公司;HH-B11600BY電熱恒溫生化培養箱,上海躍進醫療器械有限公司;Spectra Max 190光吸收酶標儀,美谷分子有限公司;ZWY-C2112B恒溫搖床,上海智城分析儀器制造有限公司;L5S紫外-可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;LDZF-75KB-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 采樣

取樣品封存至無菌采樣瓶中,分別是TA1、TA2和TA3(番茄酸湯),CA1和CA2(辣椒酸湯),MA1和MA2(混合酸湯),均以4 ℃保存運往實驗室。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌的分離純化

將樣品用無菌生理鹽水稀釋至合適的濃度梯度,分別涂布在MRS瓊脂培養基上37 ℃厭氧培養48 h,在PDA瓊脂培養基上30 ℃培養3～5 d,分別挑出疑似乳酸菌和酵母菌的菌落,用平板劃線法進一步純化,重復純化4～5次,直到獲得單個菌落。分別將純化的單個菌落保存在4 ℃的MRS斜面培養基和YPD斜面培養基中直至使用,每4周進行一次傳代培養。

1.3.3 菌株形態和微觀結構

將在MRS瓊脂培養基上厭氧培養得到的疑似乳酸菌的菌落固定到干凈的載玻片上,進行革蘭氏染色,置于顯微鏡下觀察細菌形態并拍照記錄,紫色和紅色分別代表革蘭氏陽性和革蘭氏陰性。同時進行過氧化氫酶測試,在超凈工作臺用接種環挑取菌落于干凈的載玻片上,加入質量分數為3% H2O2溶液,30 s內出現氣泡為過氧化氫酶陽性,反之為陰性。將過氧化氫酶陰性和革蘭氏陽性的菌株暫視為乳酸菌。將在PDA瓊脂培養基上得到的疑似酵母菌的菌落固定到干凈的載玻片上,用美藍染液染色后于顯微鏡下觀察真菌形態并拍照記錄,具有典型酵母特征的菌株暫視為酵母菌。通過菌株形態和生理生化特征篩選暫視為乳酸菌和酵母菌的菌株保存在4 ℃斜面培養基和-80 ℃凍存管中。

1.3.4 益酵菌株的篩選和功能特性

1.3.4.1 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測定

參考LIU等[15]的方法按照3%接種量將活化的乳酸菌種子液分別接種到pH 2.0和pH 3.0的MRS液體培養基中,含0.3 g/L和0.6 g/L牛膽鹽的MRS液體培養基中,于37 ℃培養16 h后測定菌株的OD600nm。

1.3.4.2 乳酸菌和酵母菌產酸能力的測定

根據ZHENG等[16]的方法稍作修改,吸取10.0 mL菌液于100 mL容量瓶中,加水至刻度,混勻。吸取20.0 mL,置于200 mL燒杯中,加60 mL水,開動磁力攪拌器,用NaOH標準滴定溶液滴定至酸度計指示pH 8.2,同時做空白實驗。

1.3.4.3 產香酵母的篩選

將活化的酵母菌種子液在恒溫搖床(30 ℃,120 r/min)中培養1 d,參考文獻[17-20]用感官嗅聞法篩選產香酵母并稍作修改,請10位食品專業品評人員將樣品置于鼻孔下方,嗅聞揮發的香氣,進行香氣評價,主要內容如表1所示,主要包括勾選香氣類型和香氣濃淡、選填香氣描述,統計結果以票數過半(n≥5)的香氣評價為準,以此篩選有較濃酯香或特殊果香的酵母菌株。

表1 香氣評價表Table 1 Aroma evaluation form

1.3.4.4 乳酸菌和酵母菌抗氧化性能的測定

將所篩選出的菌株種子液用·OH清除能力檢測試劑盒、DPPH自由基清除能力檢測試劑盒和ABTS陽離子自由基清除能力檢測試劑盒測定菌株相應抗氧化能力,按照試劑盒的說明操作和計算。

1.3.5 菌種鑒定和構建系統發育樹

分別按Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒和Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取基因組,用細菌通用引物27 F和1492 R擴增細菌的16S rDNA序列,用酵母通用引物NL1和NL4擴增酵母的26S rDNA D1/D2區序列,PCR產物測序后在核糖體數據庫上進行BLAST對比。設置Bootstrap method重復抽樣次數為1 000,Gaps/Missing Data Treatment 采用Pairwise deletion模型。在NCBI GenBank數據庫中進行BLAST分析,用ClustalX軟件進行多序列比對(multiple alignments),并用Mega軟件構建系統,采用NJ法構建系統發育樹。

1.3.6 級聯發酵模式菌株生長初探

參考張東亞[2]和韋明明[21]的紅酸湯制作方法稍作修改。無損傷的本地新鮮番茄洗凈破碎備用,添加6%食鹽,2%糯米飯,3%菌株lt1-6的二代種子液,30 ℃發酵制得番茄酸湯,發酵96 h期間每12 h涂布1次計算乳酸菌活菌數并測番茄酸湯的pH值;無損傷的新鮮紅美人辣椒、姜、大蒜洗凈破碎備用,添加7%食鹽,3%姜,2%大蒜、4%糯米飯和3%菌株lc2-1的二代種子液,30 ℃發酵制得辣椒酸湯,發酵96 h期間每12 h涂布1次計算乳酸菌活菌數并測辣椒酸湯的pH值;將發酵了96 h的番茄酸湯和辣椒酸湯按照1∶1的比例混合均勻,添加5%菌株ym1-3的二代種子液,30 ℃發酵制得混合酸湯繼續發酵,發酵96 h期間每12 h涂布1次計算酵母菌活菌數并測混合酸湯的pH值。參照何揚波等[3]用酸度計測量樣品pH值;乳酸菌和酵母菌計數分別參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》和GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》。

2 結果與分析

2.1 菌株形態及微觀結構

從圖1乳酸菌的菌落形態和顯微鏡下的菌株微觀結構可以看到不同乳酸菌呈現出球形、短棒狀、中棒狀、長棒狀和橢圓形等形態,初步篩選出43株乳酸菌。從圖2酵母菌的菌落形態和顯微鏡下的菌株微觀結構可以看到不同酵母菌呈現出了變色、淡黃色等菌落形態;顯微鏡下呈現出球形、米粒狀等形態,初步篩選出28株酵母菌。

圖1 乳酸菌菌落形態及微觀結構Fig.1 Colony morphology and microstructure of lactic acid bacteria

圖2 酵母菌菌落形態及微觀結構Fig.2 Colony morphology and microstructure of yeast

2.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力分析

通過微生物傳統分離培養法分離純化樣品中的可培養微生物,結合本課題組前期研究的高通量測序結果,主要篩選紅酸湯中的乳酸菌和酵母菌。通過菌落形態、顯微鏡微觀結構、生理生化特征等,篩選出了26株乳酸菌進行pH 3.0和2.0下的耐酸能力和膽鹽質量濃度0.3、0.6 g/L下的耐膽鹽能力測定。食物經胃液消化,pH值通常為3.0左右,隨后與腸道內的膽鹽接觸,膽鹽能破壞細胞膜完整度造成細胞死亡,因此耐酸耐膽鹽能力是衡量菌株益生特性的重要指標[22]。從表2可以看出菌株在pH 3.0下的耐酸能力要高于pH 2.0下的耐酸能力,在0.3 g/L膽鹽濃度下菌種的生長能力要高于0.6 g/L膽鹽濃度的菌種生長能力?？紤]到從紅酸湯不同組成成分中(番茄酸湯、辣椒酸湯和混合酸湯)分別選出益酵菌株,并且耐酸耐膽鹽能力均需較好的條件下,選擇了的10株優良的乳酸菌(lt1-2、lt1-3、lt1-4、lt1-6、lt1-7、lt3-5、lc2-1、lm1-4、lm2-1和ly-3)進行產酸能力測定。

表2 乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力(OD600nm)Table 2 Acid and bile salt tolerance of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌和酵母菌產酸能力分析

將10株乳酸菌與通過微生物傳統分離培養法分離純化,菌落形態、顯微鏡微觀結構、生理生化特征等篩選出的10株酵母菌進行產酸能力測定,從表3可以發現番茄酸湯中lt1-3、lt1-6、lt3-5產酸能力較好,且目前未見對番茄酸湯的菌株產酸能力的研究報道。辣椒酸湯中lc2-1產酸能力較好,產酸能力[(7.92±0.01) g/kg]優于賀曉潔等[11]從傳統發酵辣椒酸湯中篩選出1株耐鹽植物乳桿菌L-14產酸能力[(7.770±0.033) g/L]。發酵紅酸湯中lm2-1產酸能力較好,為(8.69±0.03) g/kg,優于XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優勢菌種布氏乳桿菌H9的產酸能力[(3.268±0.016) g/L]。另外,酵母菌的產酸能力都弱于乳酸菌。將此結果與耐酸耐膽鹽能力相結合,篩選出了6株乳酸菌進行抗氧化能力測定,10株酵母菌繼續進行產香特性分析。

表3 乳酸菌、酵母菌的產酸能力Table 3 Acid production capacity of lactic acid bacteria and yeast

2.4 酵母菌的產香能力

根據消費者感官偏好的重要性,香氣濃郁、醇香味和鮮味是重要的香氣評價指標[23]。通過感官嗅聞法評價酵母菌種子液的香氣特征,大多數能產酯香、醇香。表4為10株酵母菌的香氣評價表,據此選出7株較優秀的酵母菌(yt1-1、ym1-1、ym1-3、ym1-6、ym1-7、ym2-1和yy-2)進行抗氧化能力的測定,尤其是ym1-3,能產水果香,香氣濃郁且細膩清新,產香能力較好,目前未有關于紅酸湯及其半成品產香能力菌株的報道。

表4 酵母菌的香氣評價Table 4 Aroma evaluation of yeast

2.5 乳酸菌和酵母菌抗氧化性能分析

由表5和表6可知,菌株的DPPH自由基清除能力較·OH清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力較好。綜合考慮耐酸耐膽鹽、產酸、產香和抗氧化能力后,從番茄酸湯中選擇了lt1-6,辣椒酸湯中選擇了lc2-1,混合酸湯中選擇了ym1-3作為強化發酵菌株。目前對于紅酸湯功能菌種的報道研究較少,僅有張玉龍等[8]從紅酸湯篩選出的產胞外多糖和抗氧化能力的葡萄球菌H1,但未研究其產酸能力。

表5 乳酸菌的抗氧化能力 單位:%

表6 酵母菌的抗氧化能力 單位:%

2.6 菌種鑒定結果

通過16S rRNA 和26S rRNA序列分析構建系統發育樹確定這3株性能優良的菌種lt1-6、lc2-1和ym1-3分別為Lentilactobacillusbuchneri、Pediococcusethanolidurans和Kazachstaniabulderi(圖3、圖4)。對紅酸湯中L.buchneri的研究,僅有XIONG等[10]從凱里紅酸湯中篩選出優勢菌種布氏乳桿菌H9,產酸能力為(3.268±0.016) g/L。劉玉凌等[24]從傳統榨菜中分離出的一株發酵性能優良的酵母菌ZH2為Kazachstaniabulderi,不產膜,產氣、產醇能力強,且能耐受較低pH值和較高鹽濃度(10%)。但目前未見P.ethanolidurans和K.bulderi的相關紅酸湯篩菌報道。

a-lt1-6系統發育樹;b-lc2-1系統發育樹

圖4 基于26S rRNA序列的同源性繪制的ym1-3的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ym1-3 based on homology of 26S rRNA sequences

2.7 菌株生長曲線

研究菌種生長是否適合于食品發酵體系具有十分重要的意義[25]。對3株菌種的生長特性進行了研究,結果如圖5,lt1-6在6 h進入生長對數期,OD600nm值為0.140,pH值為5.78;菌株lc2-1則需要16 h進入生長對數期,pH值為5.78左右;菌株ym1-3在6 h進入對數期,OD600nm值為0.160,pH值為5.48。本部分研究可為后續在特定時間進行強化發酵接種紅酸湯提供數據參考。

a-lt1-6生長曲線;b-lc2-1生長曲線;c-ym1-3生長曲線

2.8 級聯發酵模式菌株生長情況

從圖6可知,lt1-6接種至番茄酸湯后,0～36 h生長緩慢,pH值降低幅度較慢;36～96 h時生長快速,pH值從4.0下降到3.5;在96 h時菌濃度為(4.925±0.020)×107CFU/mL,pH值為3.51±0.02,此時微生物已適應環境,且能最大程度地發揮其生物學功能,與韋明明[21]的結論相同,即乳酸菌在番茄酸湯中能夠良好生長。lc2-1接種至辣椒酸湯后,12～72 h pH值下降較快;72～96 h pH值下降較為緩慢,活菌數呈現先上升后下降的變化,84 h達到生長最高點,菌濃度為(10.000±0.000)×107CFU/mL,pH值為3.41±0.01;在96 h時菌濃度為(5.900±0.020)×107CFU/mL,pH值為3.32±0.02,菌落總數稍有回落,可能是發酵后期基質營養有限而限制微生物生長[26]。番茄酸湯與辣椒酸湯發酵96 h后二者1∶1混合,接種ym1-3,菌株生長情況良好,pH值在接種12 h下降后基本穩定在3.29。結果表明這3株菌種分別在發酵底物中生長情況良好,且加速酸湯成熟,可考慮作為紅酸湯級聯發酵體系的強化發酵菌株進行研究并應用于生產。

a-番茄酸湯接種lt1-6生長情況;b-辣椒酸湯接種lc2-1生長情況;c-混合酸湯接種ym1-3生長情況

3 結論

本研究從紅酸湯半成品番茄酸湯中篩選出一株產酸功能菌種為lt1-6[產酸能力(7.41±0.02) g/kg,·OH清除能力(0.15±0.00)%,DPPH自由基清除能力(30.38±0.00)%,ABTS陽離子自由基清除能力(6.73±0.03)%],辣椒酸湯中篩選出一株產酸功能菌種為lc2-1[產酸能力(7.92±0.01) g/kg,·OH清除能力(2.05±0.02)%,DPPH自由基清除能力(34.65±0.01)%,ABTS陽離子自由基清除能力(4.82±0.04)%],二次發酵混合酸湯中篩選出一株產香功能菌種為ym1-3[可產濃郁水果香,·OH清除能力(5.75±0.02)%,DPPH自由基清除能力(30.90±0.02)%,ABTS陽離子自由基清除能力(0.53±0.03)%],通過分子生物學鑒定和構建系統發育樹確定這3株性能優良的菌種分別為L.buchneri、P.ethanolidurans和K.bulderi,通過級聯發酵體系(用L.buchneri和P.ethanolidurans分別發酵96 h后的番茄酸湯和辣椒酸湯按1∶1復配再接種K.bulderi發酵96 h)驗證,菌株生長情況良好,番茄酸湯中L.buchneri濃度為(4.925±0.020)×107CFU/mL,辣椒酸湯中P.ethanolidurans濃度為(5.900±0.021)×107CFU/mL,混合酸湯中K.bulderi濃度為(0.150±0.031)×107CFU/mL,發酵酸度高(pH值均小于3.51±0.02),初步構建一種可應用于紅酸湯強化發酵模式的級聯發酵體系,將為人工接種乳酸菌和酵母菌強化發酵紅酸湯提供技術參考。