通心絡膠囊對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的干預作用*

羅瑋敏，龔彥

1 山東第一醫科大學第一附屬醫院，山東省千佛山醫院 山東濟南 250014

2 山東省公共衛生臨床中心影像中心 山東濟南 250102

高血壓病是最常見的慢性非傳染性疾病[1]。而繼發于高血壓病的心、腦、血管、腎臟等靶器官損傷，是高血壓病患者死亡的主要原因[2]。心肌纖維化是高血壓性心臟病最早出現的病理變化，是導致心室重塑與心臟舒縮功能異常的重要環節[3]。但是，臨床缺乏有效安全的抗心肌纖維化治療方法。中醫按癥狀表現可將心肌纖維化歸為“胸痹”“心痛”范疇[4]。因心肌纖維化在高血壓病緩慢進展的病程中出現，與中醫學“久病入絡”與“久瘀入絡”認識疾病證候演變規律有極大的相似性[5]。通心絡膠囊是通絡干預的代表方；在本研究中，我們觀察了通心絡膠囊對自發性高血壓大鼠模型心肌纖維化及促纖維化信號通路的影響。

資料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 40只7周齡體質量180～200 g的雄性SHR大鼠，購自北京維通利華公司（許可證號：SYXK（京）2022-0052）；10只7周齡體質量180～200 g的雄性Wistar大鼠，購濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（許可證號：SCXK（魯）2019-0003）。實驗藥物 通心絡膠囊（國藥準字Z19980015）由河北石家莊以嶺藥業股份有限公司提供，由人參、水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片等藥物組成。

1.2 實驗試劑 Masson三色染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司。PCR引物由博尚生物技術有限公司合成。兔抗Smad3、p-Smad3、小鼠抗β-actin購自美國CST公司。兔抗CTGF購自英國Abcam公司。

2 方法

2.1 實驗分組 大鼠適應性飼養1周后，將8周齡雄性SHR大鼠（約180～200 g） 共40只隨機分為通心絡不同劑量治療組即高劑量治療組（TXL-H組，10只）、中劑量治療組（TXL-M組，10只）和低劑量治療組（TXL-L組，10只）以及陽性對照組（SHR組，10只）。10只8周齡Wistar Kyoto大鼠作為正常對照組（WKY組）。

2.2 給藥方法 通心絡膠囊內容物溶于生理鹽水配成溶液，按通心絡高、中、低劑量治療組，每天分別按每千克體質量給予SHR1.5g、0.75g、0.38g通心絡超微粉溶液灌胃。正常對照組（WKY組）和陽性對照組（SHR組）每天給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 動物取材方法 大鼠20周齡時結束實驗。所用大鼠給予腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉并處死，過程中盡量減少動物痛苦。用酒精棉球清潔胸部，然后用手術刀在左側胸部進行側切，暴露出心臟，使用眼科鑷固定和穩定大鼠的心臟。使用注射器在心尖處取血后，在左室心腔中注入生理鹽水沖洗，注意以保持心臟的形態和結構。沿著心臟的大動脈和靜脈進行切割以便取材。取材后，將心臟放在適當的容器中，用液氮冷凍或用4%多聚甲醛固定其組織結構，為后續實驗做準備。

2.4 組織病理學分析 將大鼠心臟標本制備為石蠟切片，進行心肌膠原的Masson染色，觀察比較各組大鼠心肌纖維化情況。

2.5 實時定量逆轉錄PCR 收集各組大鼠的心臟組織并提取總RNA，利用引物進行逆轉錄和實時定量PCR檢測組織中α-SMA和TGFβ1 mRNA的表達水平。

2.6 蛋白印跡 定量稱取各組大鼠心臟組織勻漿并提取總蛋白，使用BCA法檢測蛋白濃度。通過電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色等過程，分別檢測Smad3、p-Smad3、CTGF等蛋白的表達水平。

3 統計學分析

應用IBM SPSS Statistics 26.0軟件分析處理數據，數據以均數±標準差（±s）表示。兩組比較采用t檢驗；組間比較使用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠心肌纖維化病理改變

結果顯示，在WKY組中，心肌肌束間有少量的膠原纖維。與WKY組比較，SHR組藍色區域明顯擴大，且心肌肌束間隙變大，在心肌絲田胞間質中可見明顯的纖維化改變，且伴有嚴重的膠原沉積。與SHR組比較，通心絡高、中、低劑量組心肌纖維化程度明顯減輕，膠原含量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織Masson染色結果

2 各組大鼠心肌組織α-SMA和TGFβ1 mRNA表達的比較

與WKY組比較，SHR組的α-SMA和TGFβ1 mRNA表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與SHR組比較，通心絡高、中、低劑量組α-SMAmRNA表達明顯降低（P＜0.05）；而TGFβ1 mRNA表達雖有所降低，但差異無統計學意義。見圖2。

圖2 心肌組織α-SMA和TGFβ1 mRNA表達的比較

3 各組大鼠心肌組織磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達的比較

與WKY組比較，SHR組及通心絡高、中、低劑量組的磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與SHR組比較，通心絡高、中、低劑量組磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。各劑量組間并沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 心肌組織磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達的比較

討 論

現代醫學研究認為，心肌纖維化是未經良好控制的高血壓病在緩慢進展的病程中常見的靶器官損傷表現之一[6]；按其癥狀表現可歸為中醫“胸痹”“心痛”的范疇。絡病學認為，高血壓病的致病因素不能及時消除，病及于心，心絡虛滯或郁滯，主持營衛氣血交互生化功能障礙，體用俱損，與繼發性產生的痰濁、瘀、毒相互影響，絡息而成積[7]。通絡干預，恢復“絡以通為用”，是切合高血壓病心肌纖維化病機的治法[8]。通心絡膠囊是吳以嶺院士創制的通絡干預的代表方劑。方中用人參補益心氣；用水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻等蟲藥透絡通經、攻毒散結、消癥散積；赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片疏通絡氣、辛宣止痛。組方體現出“搜、剔、疏、通”的用藥規律，共奏益氣活血、通絡行氣、消癥化積之效[9]。

基礎研究顯示，心肌纖維化導致的細胞外基質累積與膠原纖維增加，是心室重塑和結構破壞的關鍵環節，進而會引起心臟舒縮功能紊亂甚至心功能失代償[10-11]。SHR是研究人類原發性高血壓時運用最廣泛的動物模型，在Pubmed上關于SHR的研究超過24000篇文章。SHR是在Wistar-Kyoto大鼠（WKY）遺傳背景基礎上挑選的血壓自然升高者經數代繁育后形成的穩定的高血壓大鼠；因為遺傳背景一致，所以WKY大鼠通常作為SHR的正常對照組[12]。與其他高血壓動物模型（如腎素轉基因大鼠或鹽敏感高血壓大鼠）比較，SHR與人類原發性高血壓具有高度相似的發病機制和緩慢進展的自發性高血壓、逐漸加重的靶器官損傷等表現。在SHR心臟可以觀察到心肌膠原纖維大量沉積，肌束間間隙明顯增加[13]。本實驗顯示，通心絡膠囊顯著改善了SHR心肌纖維化。

心肌成纖維細胞主導心肌纖維化的發生與進展[14]。持續高血壓引起的神經-體液內環境紊亂，會刺激心肌成纖維細胞表型轉化而具有分泌與遷移功能；α-SMA是心肌成纖維細胞轉化的主要標志物[15]。本研究顯示，自發性高血壓大鼠心肌α-SMA表達增加；通心絡膠囊抑制了自發性高血壓大鼠心肌中的α-SMA表達，提示通心絡膠囊減少了心肌成纖維細胞的轉化。

在心肌成纖維細胞轉化相關的信號通路中，Smad3被認為是是與高血壓相關的心臟纖維化和心肌成纖維細胞轉化密切相關的關鍵分子[16]。磷酸化Smad3蛋白由細胞漿轉位至細胞核內，對眾多與促進了與心肌成纖維細胞表型轉化和促纖維形成相關的細胞事件相關的靶基因表達[17-18]。本研究顯示，自發性高血壓大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平增加；通心絡膠囊抑制了自發性高血壓大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平。有研究顯示，Smad3的磷酸化存在TGFβ1依賴性與非依賴性兩條不同的促纖維化信號通路[19]。本實驗顯示，自發性高血壓大鼠心肌組織TGFβ1水平升高；但是，通心絡膠囊未改變自發性高血壓大鼠心肌組織TGFβ1水平，提示通心絡抗心肌纖維化作用可能與TGFβ1無關。CTGF既是Smad3調控的下游靶基因，且具有廣泛的促纖維化作用[20]。自發性高血壓大鼠心肌CTGF表達水平升高；通心絡膠囊抑制了自發性高血壓大鼠心肌中CTGF表達。

綜上所述，通心絡膠囊通過抑制非TGFβ1依賴性Smad3/CTGF促纖維化通路，減少了心肌成纖維細胞主導的心肌纖維化；因此，通絡干預，恢復“絡以通為用”，切合高血壓病心肌纖維化病機，可以作為治療高血壓病心肌纖維化的基礎治療；亦提示在臨床治療中隨證化裁合理運用通絡干預法，將有助于提高高血壓病心肌纖維化的治療效果。