鉑耐藥上皮性卵巢癌組織中CXCL5的表達與患者臨床特征的關系

何 瀅,馬曉玲,高璐璐,祖逸崢,張瑞琪 ,哈春芳,4

卵巢癌是女性生殖系統三大常見惡性腫瘤之一,其死亡率位居所有婦科惡性腫瘤之首[1]。因為卵巢所特有的解剖位置及結構,就診時70%的患者已處于晚期。目前晚期上皮性卵巢癌的標準診治流程為初始腫瘤細胞減滅術后給予 6個療程的含鉑方案化療[2]。但經初始治療后患者3年累積復發率高達70%,5年總生存率不足50%[3]。鉑類耐藥是目前卵巢癌復發的主要原因之一[4]。因此,化療耐藥已成為提高卵巢癌治愈率的關鍵限制因素。已有實驗證實,CXCL5即CXC趨化因子配體-5在非小細胞肺癌、肝細胞癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達[5],可促進非小細胞肺癌放療敏感[6],還可作為腎癌、乳腺癌中促溶酶藥物耐藥的生物標志物[7]。課題組前期采用轉錄組測序篩選出上皮性卵巢癌患者差異基因5個,其中CXCL5基因表達最為明顯并行qRT-PCR 驗證。故本研究探討 CXCL5 在鉑耐藥上皮性卵巢癌中的表達情況及其與臨床特征之間的關年2月就診于寧夏醫科大學總系,旨在為臨床上卵巢癌鉑類耐藥探索有效的靶向治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2015年1月至2021年12月在寧夏醫科大學總醫院婦科行滿意腫瘤細胞減滅術聯合鉑類為主規范化療(至少6次),并且治療結束后隨訪時間不少于6個月的134名上皮性卵巢癌患者。其中根據停止化療6個月后是否復發分為鉑耐藥組(實驗組)70例和鉑敏感組(對照組)64例,鉑耐藥組平均年齡為(56.14±8.97)歲,鉑敏感組平均年齡為(54.50±6.91)歲。所有入選者的組織石蠟標本均為手術切除組織蠟塊,由寧夏醫科大學總醫院病理科制備。全部病例均經組織病理學明確診斷,該實驗已獲得寧夏醫科大學總醫院倫理委員會的批準與授權,實驗參與者均已簽署知情同意書。

1.1.1 納入標準 ①符合《中華婦產科學》(第3版)中相關卵巢癌診斷標準的患者;②于寧夏醫科大學總醫院進行初始腫瘤細胞減滅術且術后病理確診為上皮性卵巢癌的患者;③于寧夏醫科大學總醫院術后接受至少6個療程含鉑方案化療的患者;④治療結束后隨訪時間大于6個月且病例資料完整可靠的患者。

1.1.2 排除標準 ①非上皮性卵巢癌的惡性腫瘤患者;②合并嚴重內科疾病的患者;③術后未規范化療的患者;④隨訪時間小于6個月或失訪的患者。

1.2 鉑耐藥復發的診斷標準[8]經規范治療達到臨床癥狀緩解的患者出現腫瘤標志物CA125升高、胸腹水,查體或影像學資料發現包塊、不明原因腸梗阻,其中2項陽性或幾項陽性提示卵巢癌復發。

1.3 鉑耐藥組各相關因素分組依據 根據課題組前期研究改良的Suidan 評分[2],將CA125、HE4分為高低水平組,CA125組又分為CA125<545.6 U/mL組和 CA125≥545.6 U/mL組;HE4組又分為HE4<246.7 pmol/L組和HE4≥246.7 pmol/L組。參考人民衛生出版社出版的第九版《診斷學》,將NEUT、PLT分為高低水平組,NEUT組又分為NEUT<7.0×109/L組和NEUT≥7.0×109/L組;PLT組又分為PLT<300×109/L組和PLT≥300×109/L組?；颊呤状沃委煏r的影像學檢查(超聲、CT等)[9]或未行新輔助化療手術探查體現的腹水量,以500 mL為界值,分為腹水量<500 mL組和腹水量≥500 mL組。

1.4 主要試劑 兔來源多克隆CXCL5抗體 (美國Affinity Biosciences 公司) ,HRP標記山羊抗兔和二氨基聯苯胺(DAB)濃縮液及稀釋液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.5 實驗方法 采用免疫組織化學的方法進行石蠟組織中抗原檢測。所有腫瘤組織標本均經10%甲醛固定,石蠟包埋,連續3μm切片。將載玻片以30°角度放置在60 ℃漂烘機上烘干30 min后插入染色架,并放入60 ℃烤箱過夜。用二甲苯脫蠟后用依次遞減濃度酒精脫去二甲苯并水化;微波抗原修復后加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑來消除內源性過氧化物酶;加入適量的山羊血清封閉液完全覆蓋組織塊,在室溫孵育30 min后再加入適當比例稀釋的一抗 (稀釋濃度為1∶200 ),放入4 ℃冰箱過夜后室溫孵育1h,用PBS溶液清洗2～3次(每次5 min);然后滴加黃色加強劑,放入保溫盒里15 min,PBS溶液清洗2次后甩干放入保溫盒里滴加二抗,蓋上保溫蓋放置1個小時,清洗2遍后DAB顯色液顯色;蘇木素染液復染;梯度乙醇脫水;凝膠封片;顯微鏡觀察組織染色情況,并在相同條件下拍照記錄。

1.6 結果判讀 CXCL5以細胞漿或細胞膜呈現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達,所有結果均需由兩位病理醫師獨立閱片判讀,每張切片在(200×)高倍鏡下隨機選取5個視野(必須保證所有圖像在同一條件下采集),用軟件Image J進行圖像分析,測量陽性細胞的平均光密度(AOD),計算5個視野的平均數值作為本張切片的平均光密度值。

2 結果

2.1 CXCL5在卵巢癌患者組織中的表達情況 免疫組織化學檢測結果顯示,CXCL5表達主要在卵巢癌上皮細胞的細胞質中。CXCL5在鉑耐藥卵巢癌細胞中弱表達或無表達,而在血管中高表達,染色為淺棕色;在鉑敏感卵巢癌細胞中強表達,染色為深棕色或棕褐色,見圖1至圖3(封二)。

2.2 鉑耐藥組與鉑敏感組患者卵巢癌組織中CXCL5表達水平比較 本實驗采用陽性細胞的平均光密度(AOD)來表示2組患者卵巢癌組織中CXCL5的相對表達水平。CXCL5在鉑耐藥組卵巢癌組織中的表達水平明顯低于鉑敏感組卵巢癌,差異具有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 鉑耐藥組與鉑敏感組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達比較

2.3 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與一般臨床特征的關系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達在年齡、絕經狀態、病灶大小間差異無統計學意義(P>0.05) ,而在是否接受新輔助化療和總化療次數(總化療次6次與總化療次數>6次)組間差異有統計學意義(P<0.05)。其中,CXCL5 蛋白在未接受新輔助化療的鉑耐藥患者卵巢癌組織中的表達明顯高于接受新輔助化療的鉑耐藥患者(P<0.05),在總化療次數為 6 次組鉑耐藥患者卵巢癌組織中的表達明顯高于總化療次數>6次組的鉑耐藥患者(P<0.05)。提示CXCL5在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達與新輔助化療和總化療次數有關且呈負相關(P<0.05),而與年齡、絕經狀態、病灶大小無相關性(P>0.05) ,見表2。

2.4 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與術前血清學指標的關系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與血清中CA125的表達水平差異無統計學意義(P>0.05) ,而與HE4、NEUT、PLT的表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。其中,CXCL5在HE4低水平組患者卵巢癌組織中的表達水平明顯高于HE4高水平組患者(P<0.05),但在NEUT高水平組患者的表達水平明顯高于NEUT低水平組患者(P<0.05),在PLT高水平組患者卵巢癌組織中的表達水平明顯高于PLT低水平組患者(P<0.05)。提示CXCL5 在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達與血清中HE4、NEUT、PLT的表達水平有關,且與HE4呈正相關(P<0.05),與 NEUT、PLT呈負相關(P<0.05),而與CA125無相關性(P>0.05),見表3。

表2 鉑耐藥患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與一般臨床特征的相關性

表3 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與術前血清學指標的相關性

2.5 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與臨床病理特征的關系 鉑耐藥組患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與腫瘤單雙側、脈管陽性差異無統計學意義(P>0.05) ,而與FIGO分期、組織分化程度、腹水量比較差異有統計學意義(P<0.05)。其中,CXCL5在FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期組的患者卵巢癌組織中的表達水平明顯高于FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組的患者(P<0.05),在中-高分化組的患者卵巢癌組織中的表達水平明顯高于低分化組的患者(P<0.05),在腹水量<500 mL組患者卵巢癌組織中的表達水平明顯高于腹水量≥500 mL組的患者(P<0.05)。提示CXCL5在鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中的表達與與FIGO分期、組織分化程度、腹水量有關(P<0.05),且與FIGO分期、腹水量呈負相關(P<0.05),組織學分化程度呈正相關(P<0.05),而與腫瘤單雙側、脈管陽性無相關性(P>0.05),見表4。

表4 鉑耐藥患者卵巢癌組織中CXCL5的表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

卵巢癌僅占女性癌癥的 3%,卻是女性癌癥死亡的第五大原因之一[10]。據報道,卵巢癌的發病率為12.5/10萬婦女,發病率在過去20年里下降了不到1%,死亡率基本沒有改變[10]。鉑耐藥是導致卵巢癌患者治療失敗甚至死亡的重要原因,即使患者治療初期對鉑類藥物敏感,但是經過多次復發后,最終都會對鉑類藥物產生耐藥性[11]。因此,探索新的治療靶點從而克服鉑類耐藥是提高癌癥治療效果的迫切需要。

CXCL5是CXC趨化因子的家族成員,作為中性粒細胞強大的誘導劑和炎癥介質,可介導血管增生,促進細胞遷移、吞噬、鈣離子內流和呼吸爆發,在纖維化、細胞增殖及凋亡等活動中具有重要作用[12]。Zhao等人[13]證實,CXCL5可激活ERK/Elk-1/Snail通路和AKT/GSK3β/β-catenin/MMP7通路,進而通過CXCL5/CXCR2軸誘導癌細胞發生上皮-間充質轉化,增強了結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。目前有關CXCL5在卵巢癌中作用的研究較少,本研究證實在上皮性卵巢癌患者組織中低水平的CXCL5提示卵巢癌患者有產生鉑耐藥的可能。

人附睪蛋白4(HE4)是近年來發現的一種新的生物標志物,在檢測上皮性卵巢癌方面具有更高的敏感性和特異性,并且在疾病早期發展過程中比 CA125更早升高[14]。Lee等人[15]進行體外研究發現,HE4 能夠激活ERK和AKT途徑誘導癌細胞產生化療耐藥,并且這與患者更差的預后相關。本研究結果顯示,CXCL5在鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達水平與患者術前血清HE4水平有明顯相關性,且兩者呈負相關關系,這與既往研究基本一致。

中性粒細胞從脈管系統向腫瘤微環境的遷移主要由CXC趨化因子(如CXCL5)介導,CXCL5從血管系統向組織招募并激活中性粒細胞,進而殺死微生物和/或啟動組織修復重塑[16]。據報道,CXCL5的高水平與腫瘤內中性粒細胞浸潤顯著相關[17]。本研究中,CXCL5在鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達水平與患者NEUT水平有明顯相關性,且兩者呈正相關關系,這與以往的研究結果相符。

對于新輔助化療可否導致上皮性卵巢癌鉑耐藥這一問題尚有爭議。Rauh Hain[18]等人研究發現,新輔助化療導致患者術后發生鉑耐藥的機率增高。有學者在影響鉑耐藥相關因素的研究中發現,患者的化療次數越多其發生鉑耐藥的風險越高[19]。這與本研究結果基本一致。有研究發現[20],卵巢癌術后發生鉑耐藥復發與臨床分期晚和組織分化程度的降低有關,其原因可能是隨著組織分化程度的降低,癌細胞更容易發生上皮-間充質轉化(EMT),腫瘤更容易發生轉移;隨著臨床分期的推遲,腫瘤細胞生長脫落,造成腹盆腔種植轉移。本研究結果表明,CXCL5在FIGO分期晚、組織學分化低的鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達水平較低,這與既往研究結果相似。本實驗研究發現,CXCL5在≥500ml腹水量的鉑耐藥卵巢癌患者組織中的表達明顯低于<500 mL腹水量的患者。有大量證據表明,至少三分之一的卵巢癌癥患者腹腔積聚的惡性腹水有助于腫瘤細胞增殖、進展、化療抵抗和免疫逃避,促進疾病在腹部的轉移,這往往提示著預后不良[21]。

綜上所述,鉑耐藥上皮性卵巢癌患者組織中CXCL5的低表達與新輔助化療、總化療次數、HE4、NEUT、PLT、FIGO分期、組織學分化程度、腹水量有關。提示CXCL5的低表達可能與上皮性卵巢癌鉑耐藥相關。近年來,CXCL5的預后價值仍然存在爭議,到目前為止報道的大多數研究在離散的結果和樣本量方面都是有限的。本研究是回顧性的單因素分析研究,缺少動物模型和細胞模型驗證,會在一定程度上影響研究結果的準確性,后續需進一步擴大樣本量并拓展實驗對研究成果進行驗證。