壯藥雙路通腦方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經元凋亡的影響

翟 陽，莫雪妮，滕紅麗，胡躍強，鄭光珊，馬 威，楊 鵬，梅小平，鄒 敏，王凱華*

（1.廣西國際壯醫醫院腦病科，廣西 南寧 530200； 2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200； 3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科，廣西 南寧 530200； 4.廣西國際壯醫醫院科技部，廣西 南寧 530200；5.廣西國際壯醫醫院內分泌代謝病科，廣西 南寧 530200； 6.廣西國際壯醫醫院兒科，廣西 南寧 530200）

缺血性腦卒中的主要特征是大腦供血不足，溶栓和取栓是其首選治療方法［1］。但血流恢復（再灌注） 會加重損傷，導致腦缺血再灌注損傷［2］。氧化應激和炎癥反應在缺血性腦卒中的病理過程中起關鍵作用，可直接或間接導致神經元死亡［3-4］。Toll 樣受體4 （TLR4） /核因子-κB （NF-κB） 是腦缺血再灌注損傷后的炎癥級聯反應信號通路。TLR4 在腦缺血再灌注損傷后上調，激活NF-κB，誘導促炎因子釋放，加重組織損傷［5-6］。核因子E2相關因子2 （Nrf2） /血紅素加氧酶-1 （HO-1） 通路是抗氧化應激和細胞凋亡的關鍵保護通路。在腦缺血再灌注損傷后，Nrf2、HO-1 表達降低會增加梗死面積，加重腦損傷［7-8］。因此，靶向TLR4/NF-κB 和Nrf2/HO-1 通路是缺血性腦卒中的重要治療靶點。

壯藥雙路通腦方是在壯醫經驗方壯通飲的基礎上由廣西國際壯醫醫院自主研發的院內復方制劑，由扶芳藤、黃花倒水蓮、茯苓、法半夏、桂枝尖等廣西特色壯藥配伍而成，對缺血性腦卒中有療效［9］，但其作用機制尚不明確。方中多種中藥及其活性成分有抗炎和抗氧化作用，如扶芳藤［10-11］、黃花倒水蓮（總皂苷［12］、多糖［13］）、茯苓（茯苓多糖［14］、茯苓酸［15］）。本研究通過大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R） 建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，初步探討壯藥雙路通腦方對缺血性腦卒中的潛在保護機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康成年雄性SD 大鼠108 只，體質量250～280 g，6 ～7 周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （湘） 2019-0004，經廣西中醫藥大學倫理委員會批準（倫理號DW20200511-078）。大鼠飼養在12 h/12 h 光照/黑暗循環、溫度（23±1）℃、相對濕度45% ～55%的空調房間內，常規飼料喂養，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 壯藥雙路通腦方由扶芳藤20 g、桂枝尖15 g、蒼術15 g、法半夏20 g、茯苓15 g、南山楂20 g、田七15 g、陳皮15 g、黃花倒水蓮15 g、肉蓯蓉15 g、火麻仁15 g、生姜15 g、炙甘草5 g 組成，以上藥材均為精制飲片，購于廣西國際壯醫醫院，經廣西中醫藥大學莫雪妮教授鑒定為正品。按常規方法煎煮、過濾，并濃縮至每1 mL含原藥材2 g，4 ℃冰箱保存備用。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、蘇木精-伊紅（HE） 染色試劑盒（批號T8170、G1120，北京索萊寶科技有限公司）； TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒 （批號11684817910，瑞士Roche 公司）； 超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA） 檢測試劑盒（批號A001-3-2、A006-2-1、A003-1-2，南京建成生物工程研究所）； 白細胞介素6 （IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α （TNF-α） ELISA 試劑盒（批號ml102828、ml003057、ml002859，上海酶聯生物科技有限公司）； 兔源一抗cleaved-caspase-3、caspase-3 （批號9661、9662，美國Cell Signaling Technology 公司）； TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、β-actin（批號PA5-23124、PA5-16545、PA5-37718、PA5-78857、PA5-27094、PA1-183，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Nrf2、HO-1、Lamin B1 （ 批號 ab137550、ab68477、ab16048，英國Abcam 公司）。

1.3 儀器 iMark680 型多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）； BX61 電動顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組，模型組，壯藥雙路通腦方低、中、高劑量組（9.0、18.0、36.0 g/kg），依達拉奉組（3.0 mg/kg），每組18 只，參考文獻［16］ 報道方法采用線栓法構建MCAO/R 模型。稱定各組大鼠體質量，用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g） 腹腔注射麻醉，仰臥固定在大鼠板上，脫去頸部毛發，在頸部中線處切開1 個2 cm 的切口，仔細分離脂肪和結締組織以暴露左側頸總動脈（CCA），進一步分離頸內動脈 （ICA） 和頸外動脈 （ECA），結扎ECA 和CCA 的近端，同時在CCA 的遠端穿上細線，用鑷子提起CCA，在距三叉神經交點約0.5 cm 的CCA 處切開1 個小切口，將預涂有硅膠（直徑0.26 mm） 的線栓從分叉處插入ICA （18 ～20 mm） 中2 h。2 h 后，小心拉出線栓，恢復再灌注。假手術組大鼠除不行閉塞/再灌注外，其余操作同模型組。整個實驗過程中用加熱墊維持每只大鼠的直腸溫度在（37±0.5）℃。

2.2 給藥 在造模前30 min 和再灌注清醒后1 h，壯藥雙路通腦方低、中、高劑量組分別灌胃給予9.0、18.0、36.0 g/kg 壯藥雙路通腦方（臨床等效劑量的0.5、1、2 倍），依達拉奉組腹腔注射3.0 mg/kg 依達拉奉［17］，假手術組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水。之后除依達拉奉組每天給藥1 次外，其余組均于每天上午、下午各灌胃給藥1 次，連續6 d。

2.3 神經功能缺損評分 末次給藥干預后2 h，觀察各組大鼠的神經功能缺損變化，并采用Zeal Longa 5 級評分法進行評分［17］。評分標準為1 級（0 分），無神經缺損體征，動物行為正常； 2 級（1 分），不能充分屈曲對側前爪； 3 級（2 分），向對側轉圈； 4 級（3 分），向對側傾倒； 5 級（4分），不能自發行走，意識喪失。分數越高表明神經功能缺損越嚴重。

2.4 TTC 染色檢測腦梗死面積 每組隨機選取6只大鼠，麻醉后斷頭取腦，用生理鹽水清洗后，放入腦模具中，以視交叉為起點，冠狀切2 mm 的腦片。將腦片放入1%TTC 溶液（現配現用） 中，于37 ℃避光孵育15～20 min，期間翻動1 次腦片使染色均勻，將腦片用4%多聚甲醛固定，拍照。紅色為正常腦組織，白色為梗死部分。通過Image J 軟件檢測梗死面積，計算梗死率。

2.5 HE 染色檢測腦組織缺血半暗帶海馬CA1 區神經元病理損傷 每組隨機選取6 只大鼠，麻醉后取出腦組織，冠狀切分為兩部分，一部分取缺血側制備10%的組織勻漿液； 另一部分在4%多聚甲醛中固定48 h 后進行梯度脫水、石蠟包埋，連續切4 μm冠狀切片，進行HE 染色，在光學顯微鏡下觀察缺血半暗帶海馬CA1 區神經元病理學損傷。

2.6 TUNEL 染色檢測腦組織缺血半暗帶海馬CA1區神經元凋亡 將石蠟組織切片在二甲苯中脫蠟10～20 min 后，在梯度乙醇（100%、100%、95%、80%、70%） 中浸泡5 min，用0.02 μg/μL 蛋白酶K 溶液（pH 7.6） 滲透15 ～20 min，將切片與3%H2O2孵育10 min，再與TUNEL 反應混合液37 ℃避光孵育1 h，加DAB 溶液室溫孵育15 min，蘇木精復染30 s，在光學顯微鏡下觀察結果并拍照。每個樣品制備3 張切片，每張切片隨機選取3 個視野，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件對切片中具有深褐色細胞核的細胞（TUNEL 陽性細胞） 進行計數，計算細胞凋亡率。

2.7 腦組織中氧化應激和炎癥因子水平檢測 取缺血側腦組織約100 mg，加入9 倍量生理鹽水研磨，4 ℃、2 300×g離心15 min，收集上清液。嚴格按照相關試劑盒說明書操作，硫代巴比妥酸（TBA） 法檢測MDA 水平，WST-1 法檢測SOD 活性，微板法檢測GSH 水平，ELISA 法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 水平。

2.8 Western blot 法檢測腦組織各蛋白表達 各組剩余6 只大鼠，麻醉后取腦并分離缺血半暗帶腦組織，使用核和細胞質提取試劑盒提取核和細胞質蛋白質。BCA 法測定蛋白質濃度后，10% ～15%SDSPAGE 凝膠電泳分離等量（20 μg） 蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜上。將PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，與一抗Bax （1 ∶1 000）、Bcl-2 （1 ∶ 1 000）、caspase-3 （1 ∶ 1 000）、cleaved-caspase-3 （1 ∶500）、TLR4 （1 ∶1 000）、p-NF-κB p65 （1 ∶ 1 000）、NF-κB p65 （1 ∶1 000）、Nrf2 （1 ∶1 000）、HO-1 （1 ∶1 000）、Lamin B1 （1 ∶1 000）、β-actin （1 ∶1 000） 在4 ℃下孵育過夜，次日將PVDF 膜與二抗（1 ∶5 000）在室溫下孵育2 h，用增強型化學發光（ECL） 試劑顯影后捕獲蛋白質電泳條帶，并通過Image J 軟件進行條帶灰度值分析。以目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。βactin 和Lamin B1 分別為細胞質和核蛋白的內參。

2.9 統計學分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 壯藥雙路通腦方對大鼠神經功能缺損評分的影響 與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分升高（P＜0.05），表明造模成功； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠神經功能缺損評分降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s，n＝18）Tab.1 Comparison of rat neurological deficit scores in each group （±s，n＝18）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s，n＝18）Tab.1 Comparison of rat neurological deficit scores in each group （±s，n＝18）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別神經功能缺損評分/分假手術組0模型組2.80±0.31*壯藥雙路通腦方低劑量組2.65±0.27壯藥雙路通腦方中劑量組1.91±0.24＃壯藥雙路通腦方高劑量組1.52±0.20＃依達拉奉組1.47±0.19＃

3.2 壯藥雙路通腦方對大鼠腦梗死面積的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠腦梗死率降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦梗死情況（TTC 染色）Fig.1 Sizes of rat cerebral infarction in each group （TTC staining）

表2 各組大鼠腦梗死率比較（±s，n＝6）Tab.2 Comparison of rat cerebral infarction rate in each group （±s，n＝6）

表2 各組大鼠腦梗死率比較（±s，n＝6）Tab.2 Comparison of rat cerebral infarction rate in each group （±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別腦梗死率/%假手術組0模型組39.25±4.56*壯藥雙路通腦方低劑量組35.48±4.37壯藥雙路通腦方中劑量組24.60±2.85＃壯藥雙路通腦方高劑量組13.17±2.16＃依達拉奉組11.89±2.03＃

3.3 壯藥雙路通腦方對大鼠腦組織缺血半暗帶海馬CA1 區神經元病理損傷的影響 假手術組大鼠腦組織海馬CA1 區神經元形態正常，海馬神經元胞體較大且圓形，核仁明顯，細胞呈多層排列，整齊致密； 模型組大鼠大腦缺血半暗帶海馬CA1 區神經元呈三角形或不規則形，數量減少，核仁不明顯，排列混亂； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠病理損傷有不同程度的改善，大部分神經細胞恢復正常，神經元數量增加，排列較整齊； 且壯藥雙路通腦方高劑量對神經元病理損傷的改善作用優于壯藥雙路通腦方中、低劑量，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織海馬CA1 區神經元病理損傷情況（HE 染色，×400）Fig.2 Pathological damage of neurons in rat hippocampus CA1 area of each group （HE staining，×400）

3.4 壯藥雙路通腦方對大鼠腦組織缺血半暗帶海馬CA1 區神經元凋亡的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1 區神經元凋亡率升高（P＜0.05）； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠海馬CA1 區神經元凋亡率降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腦組織海馬CA1 區神經元凋亡情況（TUNEL 染色，×200）Fig.3 Neuronal apoptosis in rat hippocampal CA1 region of each group （TUNEL staining，×200）

表3 各組大鼠腦組織海馬CA1 區神經元凋亡率比較（±s，n＝6）Tab.3 Comparison of neuronal apoptosis rate in rat hippocampus CA1 area of each group（±s，n＝6）

表3 各組大鼠腦組織海馬CA1 區神經元凋亡率比較（±s，n＝6）Tab.3 Comparison of neuronal apoptosis rate in rat hippocampus CA1 area of each group（±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別凋亡率/%假手術組2.15±0.34模型組26.33±2.87*壯藥雙路通腦方低劑量組23.94±2.65壯藥雙路通腦方中劑量組17.21±2.32＃壯藥雙路通腦方高劑量組10.53±1.64＃依達拉奉組9.75±1.38＃

3.5 壯藥雙路通腦方對大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表4。

表4 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較（pg/mg，±s，n＝6）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-1β and TNF-α levels in rat brain tissues of each group （pg/mg，±s，n＝6）

表4 各組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較（pg/mg，±s，n＝6）Tab.4 Comparison of IL-6，IL-1β and TNF-α levels in rat brain tissues of each group （pg/mg，±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別IL-6IL-1βTNF-α假手術組14.23±2.102.40±0.358.68±1.27模型組39.41±4.65*10.61±1.22*26.54±3.12*壯藥雙路通腦方低劑量組35.80±4.249.28±1.1424.31±2.80壯藥雙路通腦方中劑量組28.35±3.60＃6.73±0.85＃19.52±2.24＃壯藥雙路通腦方高劑量組21.47±2.53＃4.65±0.62＃14.67±1.91＃依達拉奉組20.68±2.29＃4.28±0.59＃13.43±1.65＃

3.6 壯藥雙路通腦方對大鼠腦組織MDA、GSH 水平和SOD 活性的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織MDA 水平升高（P＜0.05），GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.05）； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠腦組織MDA 水平降低（P＜0.05），GSH 水平和SOD 活性升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表5。

表5 各組大鼠腦組織MDA、GSH 水平和SOD 活性比較（±s，n＝6）Tab.5 Comparison of MDA and GSH levels，and SOD activity in rat brain tissues of each group （±s，n＝6）

表5 各組大鼠腦組織MDA、GSH 水平和SOD 活性比較（±s，n＝6）Tab.5 Comparison of MDA and GSH levels，and SOD activity in rat brain tissues of each group （±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別MDA/（nmol·mg-1）GSH/（mg·g-1）SOD/（U·mg-1）假手術組0.45±0.0613.80±1.7420.16±2.59模型組1.63±0.17*3.92±0.55*4.58±0.73*壯藥雙路通腦方低劑量組1.48±0.144.36±0.626.12±0.84壯藥雙路通腦方中劑量組1.06±0.12＃6.55±0.83＃9.70±1.35＃壯藥雙路通腦方高劑量組0.85±0.10＃9.11±1.25＃14.52±1.80＃依達拉奉組0.79±0.09＃9.76±1.38＃15.34±2.12＃

3.7 壯藥雙路通腦方對大鼠缺血半暗帶腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3 蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織Bax蛋白表達和cleaved-caspase-3/caspase-3 比值升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠腦組織Bax 蛋白表達和cleaved-caspase-3/caspase-3 比值降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖4、表6。

圖4 各組大鼠缺血半暗帶腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3 蛋白條帶圖Fig.4 Protein bands of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved-caspase-3 in rat ischemic penumbra of each group

表6 各組大鼠缺血半暗帶腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3 蛋白表達比較（±s，n＝6）Tab.6 Comparison of protein expressions of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved-caspase-3 in rat ischemic penumbra of each group （±s，n＝6）

表6 各組大鼠缺血半暗帶腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3 蛋白表達比較（±s，n＝6）Tab.6 Comparison of protein expressions of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved-caspase-3 in rat ischemic penumbra of each group （±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別Bcl-2/β-actinBax/β-actincleaved-caspase-3/caspase-3假手術組0.61±0.080.25±0.050.14±0.02模型組0.23±0.04*0.78±0.09*0.55±0.06*壯藥雙路通腦方低劑量組0.26±0.040.73±0.100.50±0.07壯藥雙路通腦方中劑量組0.37±0.05＃0.59±0.08＃0.40±0.05＃壯藥雙路通腦方高劑量組0.48±0.07＃0.45±0.07＃0.31±0.04＃依達拉奉組0.50±0.06＃0.41±0.06＃0.28±0.03＃

3.8 壯藥雙路通腦方對大鼠缺血半暗帶腦組織TLR4、NF-κB p65、Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠腦組織TLR4 蛋白表達和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值升高 （P＜0.05），Nrf2、HO-1 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，壯藥雙路通腦方中、高劑量組和依達拉奉組大鼠腦組織TLR4 蛋白表達和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值降低（P＜0.05），Nrf2、HO-1 蛋白表達升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見圖5、表7。

圖5 各組大鼠缺血半暗帶腦組織TLR4、NF-κB p65、Nrf2、HO-1 蛋白條帶圖Fig.5 Protein bands of TLR4，NF-κB p65，Nrf2 and HO-1 in rat ischemic penumbra of each group

表7 各組大鼠缺血半暗帶腦組織TLR4、NF-κB p65、Nrf2、HO-1 蛋白表達比較（±s，n＝6）Tab.7 Comparison of protein expressions of LR4，NF-κB p65，Nrf2 and HO-1 in rat ischemic penumbra of each group（±s，n＝6）

表7 各組大鼠缺血半暗帶腦組織TLR4、NF-κB p65、Nrf2、HO-1 蛋白表達比較（±s，n＝6）Tab.7 Comparison of protein expressions of LR4，NF-κB p65，Nrf2 and HO-1 in rat ischemic penumbra of each group（±s，n＝6）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別TLR4/β-actinp-NF-κB p65/NF-κB p65Nrf2/Lamin B1HO-1/β-actin假手術組0.40±0.030.21±0.040.53±0.070.61±0.08模型組0.92±0.10*0.64±0.08*0.12±0.02*0.20±0.04*壯藥雙路通腦方低劑量組0.87±0.090.60±0.080.16±0.030.24±0.04壯藥雙路通腦方中劑量組0.72±0.08＃0.48±0.07＃0.25±0.04＃0.35±0.05＃壯藥雙路通腦方高劑量組0.58±0.07＃0.35±0.06＃0.37±0.04＃0.48±0.06＃依達拉奉組0.55±0.07＃0.33±0.05＃0.39±0.05＃0.50±0.07＃

4 討論

壯醫認為龍路、火路閉塞不通是缺血性腦卒中發病的根本［18-19］。疏通龍路和火路為壯醫治療缺血性腦卒中的治本之法［20］。壯藥雙路通腦方具有疏通兩路、調治巧塢（大腦） 的功效，已被證實在防治缺血性中風方面有療效，可改善患者神經功能缺損程度，提高其活動能力和生活質量［9］，對缺血性腦卒中的保護作用可能與抑制氧化應激和炎癥反應有關。

本研究發現，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織神經元凋亡水平升高，同時炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 水平升高，SOD 活性和GSH 水平降低，MDA水平升高，表明大鼠腦組織出現氧化應激和神經炎癥。經壯藥雙路通腦方干預后，大鼠的神經功能明顯改善，梗死面積和腦損傷明顯減輕，神經元凋亡減少； 且壯藥雙路通腦方可增加大鼠腦組織中SOD 活性和GSH 水平，降低MDA、IL-1β、TNFα、IL-6 水平，表明壯藥雙路通腦方可通過抑制氧化應激和炎癥反應來減輕腦缺血再灌注損傷。

TLR4 在缺血發生期間受到刺激后表達增加，并進一步激活NF-κB 信號通路，誘導炎癥介質（如TNF-α、IL-1β、IL-6） 的釋放，加重組織損傷［21］。本研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷誘導TLR4 和NF-κB p65 磷酸化水平升高； 而壯藥雙路通腦方可降低TLR4 表達、抑制NF-κB p65 的磷酸化，提示壯藥雙路通腦方對缺血性腦卒中的抗炎作用可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路有關。

Nrf2 信號通路可通過抗氧化應激、抗凋亡、抗炎等途徑緩解腦缺血再灌注損傷，為缺血性腦卒中的關鍵靶點［22］。在正常情況下，Nrf2 以非活性形式存在于細胞質中，維持低水平的Nrf2 調節基因表達。腦缺血再灌注損傷后，Nrf2 從細胞質轉移到細胞核，啟動下游靶基因HO-1 的轉錄，并誘導多種內源性抗氧化酶的產生。研究發現，在MCAO/R 大鼠模型中，當Nrf2 核蛋白受到抑制時，Bax 表達升高，Bcl-2 表達降低，細胞凋亡增加［23］；且抑制Nrf2/HO-1 通路也會加重氧化應激［24］。本研究發現，壯藥雙路通腦方以劑量依賴性方式增加核Nrf2 和HO-1 的蛋白表達，并升高Bcl-2 表達，降低cleaved-caspase-3、Bax 表達，提示壯藥雙路通腦方的神經保護機制可能與激活Nrf2/HO-1 信號通路有關。

綜上所述，壯藥雙路通腦方可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠的神經炎癥和氧化應激，抑制神經元凋亡，減輕腦損傷，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路和激活Nrf2/HO-1 通路相關。本研究為壯藥雙路通腦方作為抗缺血性腦卒中藥物提供基礎證據，將有助于指導其臨床應用。由于壯藥雙路通腦方的藥物組成復雜，仍需進一步的實驗驗證其抗缺血性腦卒中的機制。