半夏多糖的制備和表征及抗氧化和免疫增強活性研究

趙小亮 ，郭正磊楊超福王海利王寶忠向紫駿張偉杰 *

（1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅省高校中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050）

半夏來源于天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.） Breit.，又名地文、守田等，為傳統中藥［1］。半夏多糖是半夏中的重要活性成分之一，具有鎮咳止吐［2］、抗氧化［3］、抗腫瘤［4］、免疫增強［5］等活性，具有毒副作用小、來源豐富的特點，逐漸成為當前的研究熱點。

目前已有關于半夏多糖的純化、結構和生物活性方面的研究報道，如Gonda 等［6］從半夏中分離出酸性多糖pinellian PA，具有增強補體活性。楊有林等［7］優化了半夏多糖提取工藝，發現其具有抗氧化活性。黃聰等［8］從清半夏中提取半夏多糖，發現其能夠顯著降低肺組織的MU5AC mRNA 表達來降低黏液分泌，減少痰液生成。Kim 等［9］發現半夏多糖具有抗肥胖活性。Tian 等［10］發現半夏多糖對HepG2 細胞具有一定的抑制作用。Li 等［4］提取了半夏多糖命名為PTPA，發現其可誘導Sk-ChA-1 細胞凋亡。Chen等［11］從半夏中分離的半夏腦苷可有效抑制白色假絲酵母菌生長。盡管已有對半夏多糖制備及活性方面的研究，但由于多糖結構的不均一性及組成的復雜性，對半夏多糖結構分析、抗氧化和免疫增強活性以及構效關系的研究相對較少。

本研究通過提取半夏多糖，并對其進行分離純化，在對不同多糖組分結構分析的基礎上，對抗氧化、免疫增強活性進行評價，以期為半夏多糖的結構及抗氧化、免疫增強活性的深入研究及應用提供參考。

1 材料

1.1 藥材 半夏于2019 年10 月購自甘肅省蘭州市黃河藥材市場，經蘭州理工大學楊林副教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.） Breit.的干燥塊莖。

1.2 試劑 單糖對照品鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、巖藻糖（Fuc） 及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 購自西格瑪奧德里奇（上海） 貿易有限公司； Folin-酚試劑購自上海安耐吉化學有限公司； 二甲亞砜（DMSO）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、香菇多糖（LNT）、牛血清白蛋白（BSA） 購自阿拉丁試劑 （上海） 有限公司； 胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、胰酶購自武漢賽維爾生物科技有限公司； Q-Sephodex Fast Flow （QFF） 陰離子交換填料購自美國Cyctiva 公司； 其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 BJ-800A 多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）； DHG-9030A 恒溫電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）； B220 恒溫水浴鍋、RE53CS 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）； AB104-N 分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）； Agilent 1260 高效液相色譜儀 （美國Agilent 公司）； ZF-7 磁力攪拌器（江蘇省金壇市醫療儀器廠）； FD-1-55 冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）； TG16-WS 低速大容量離心機（長沙湘儀離心機儀器公司）； SHB-IIIA 循環水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）； UV-9200 紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）； Spectrum Two 紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司）。

2 方法

2.1 半夏多糖提取 參考文獻［12］ 方法對半夏進行處理。半夏塊莖500 g 于50 ℃干燥箱烘干，粉碎后過40 目篩，加入5 L 80%乙醇80 ℃回流攪拌脫脂4 次，每次4 h，過濾，收集濾渣，干燥后備用。半夏脫脂粉中加入5 L 蒸餾水于室溫提取6 次，每次2 h，過濾后合并提取液，真空減壓濃縮后加入4 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，7 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，沉淀復溶于蒸餾水，透析（截留分子量7 kDa） 3 d，透析液減壓濃縮后冷凍干燥，得半夏多糖（PT）。

2.2 半夏多糖分離純化 QFF 陰離子交換柱填料按文獻［13］ 方法預處理后，裝填于55 mm×15 cm 柱中，蒸餾水沖洗3 個柱體積。取半夏多糖150 mg，以蒸餾水完全溶解，過0.22 μm 微孔濾膜后上樣，依次用0、0.1、0.2、0.5 mol/L 的NaCl 溶液各洗脫3 個柱體積，自動部分收集器分步收集，苯酚-硫酸法檢測，根據洗脫體積和吸光度繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線合并收集不同組分，減壓濃縮后分別透析（截留分子量7 kDa） 3 d，透析液減壓濃縮后冷凍干燥得半夏多糖QFF 離子交換柱分離各組分。

2.3 總糖含量測定 使用苯酚-硫酸法［14］測定半夏多糖的總糖含量。取葡聚糖對照品溶于蒸餾水中，配制0.1 mg/mL 的對照品溶液，稀釋得到0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的稀釋液，取1 mL 于試管中，每支試管依次加入1 mL 6%苯酚、5 mL 濃硫酸，混勻后沸水浴加熱10 min，冷卻后使用紫外-可見分光光度計在490 nm 波長處測定吸光度，以對照品質量濃度為橫坐標（X），以吸光度為縱坐標（Y） 進行回歸，得回歸方程。半夏多糖各純化組分配制成0.1 mg/mL 的溶液，按上述方法處理并測定吸光度，根據回歸方程計算總糖含量。

2.4 蛋白質含量測定 使用Lowry 法［15］測定蛋白質含量。使用BSA 配制0.1 mg/mL 的蛋白質對照品溶液，使用去離子水分別稀釋至0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL，取1 mL 于試管中，每支試管加入5 mL 試劑甲，25 ℃水浴10 min，逐管加入0.5 mL 試劑乙混勻，25 ℃水浴30 min，使用紫外-可見分光光度計在700 nm 波長處測定吸光度，以蛋白質對照品質量濃度為橫坐標（X），以吸光度為縱坐標（Y） 進行回歸，得回歸方程。同樣方法配制0.1 mg/mL 各多糖樣品溶液并測定吸光度，根據回歸方程計算蛋白質含量。

2.5 半夏多糖單糖組成分析 使用PMP 柱前衍生高效液相色譜法對半夏多糖各組分進行單糖組成分析。參考文獻［16］ 方法對樣品進行降解，取樣品1 ～2 mg 于安瓿瓶中，加入200 μL H2O 完全溶解后加入200 μL 4 mol/L 三氟乙酸（TFA） 溶液，混勻后封口，105 ℃下水解6 h，水解液經氮吹儀吹干，加甲醇反復吹干3 次，除去TFA。參考文獻［17］ 方法對降解單糖進行衍生，降解樣品用100 μL 蒸餾水溶解，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH 溶液混勻，再加入120 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液，密封70 ℃水浴反應60 min，冷卻后加入100 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和。反應液用氯仿萃取5 次，水相用0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用，不同單糖對照品采用同樣方法衍生和處理。

色譜條件為流動相0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 6.7） -乙腈（83 ∶17）； 柱溫30 ℃； DAD 檢測器，檢測波長245 nm； 體積流量1 mL/min； 進樣量20 μL。單糖對照品和樣品進樣分析，根據出峰時間確定單糖組成，根據峰面積計算各單糖相對比例。

2.6 紫外-可見光譜分析 參考文獻［18］ 方法，將樣品溶于適量蒸餾水，分別配制0.1 mg/mL 半夏多糖各組分溶液，用紫外-可見分光光度計在200 ～900 nm 范圍內掃描，記錄紫外-可見光譜圖。

2.7 紅外光譜掃描分析 參考文獻［19］ 方法，半夏多糖樣品在放有P2O5的真空干燥箱中干燥48 h，分別取2～3 mg 樣品用干燥KBr 壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

2.8 抗氧化活性評價 對DPPH 自由基的清除活性： 按文獻［20］ 方法，分別配制39、78、156、313、625、1 250、2 500 μg/mL 半夏多糖各組分樣品，取2 mL 于試管中，等體積蒸餾水為空白對照，分別加入2 mL 0.1 mmol/mL DPPH 乙醇溶液，混勻，避光靜置30 min，維生素C 作為陽性對照。紫外分光光度計517 nm 波長處測定吸光度，計算DPPH 自由基清除率，公式如下：

式中A0為空白標準組吸光度，A為樣品吸光度。

對超氧陰離子自由基的清除活性： 按文獻［21］ 方法，分別取39、78、156、313、625、1 250、2 500 μg/mL半夏多糖各組分樣品1 mL 于試管中，等體積蒸餾水為空白對照，立即加入3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl （pH 8.2） 溶液混勻，37 ℃水浴加熱10 min 后，加入2 mL 30 mmol/L 鄰苯三酚溶液反應5 min，加入1 mL 8 mol/L HCl 中止反應，維生素C 作為陽性對照。320 nm 波長處測定吸光度，計算樣品超氧陰離子自由基清除率，公式如下：

式中A0為空白標準組吸光度，A為樣品吸光度。

對羥基自由基的清除活性： 按文獻［22］ 方法，分別取39、78、156、313、625、1 250、2 500 μg/mL 半夏多糖各組分樣品1 mL 于試管中，等體積蒸餾水為空白對照。依次加入1 mL 9 mmol/L Fe2SO4、1 mL 8.8 mmol/L H2O2和1 mL 9 mmol/L 水楊酸溶液混勻，37 ℃水浴恒溫反應15 min，維生素C 作為陽性對照，在510 nm 波長處測定吸光度，計算羥基自由基清除率，公式如下：

式中A0為空白標準組吸光度，A為樣品吸光度。

2.9 免疫增強活性評價

2.9.1 多糖溶液配制 將半夏多糖各組分分別溶于細胞培養液中，配制成800 μg/mL 的多糖溶液，0.22 μm 無菌針式過濾器過濾，備用。

2.9.2 細胞培養 RAW264.7 細胞，用含10% FBS 和1%青鏈霉素的高糖DMEM 培養液在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。用適量胰酶將RAW264.7 細胞消化至脫離瓶壁，1 000 r/min 離心6 min，棄上清液，用培養液吹散細胞團制備細胞懸浮液，計數［23］。

2.9.3 免疫增強活性評價 采用MTT 法［10］測定半夏多糖對RAW264.7 細胞增殖的影響。將100 μL 密度為50 個/μL細胞的懸浮液接種于96 孔板中培養24 h，依次加入100 μL質量濃度分別為0、50、100、200、400、800 μg/mL 的半夏多糖樣品孵育48 h。之后每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h 后除去各孔中的培養液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解結晶物，在570 nm 波長處測吸光度，以LNT 為陽性對照，計算細胞活力，公式如下：

式中A0為空白標準組吸光度，A為樣品吸光度。

2.10 統計學分析 所有樣品均進行3 次重復，采用SPSS 19.0 軟件進行處理，2 組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義，數據以（±s） 表示，使用Origin 8.0 和Graphpad prism 7.0 軟件作圖。

3 結果

3.1 提取與分離 通過水提-醇沉法從半夏中提取半夏多糖，得率為3.49%。通過QFF 陰離子交換柱分離，洗脫曲線見圖1，依次在濃度為0、0.1、0.2、0.5 mol/L NaCl 溶液下洗脫，得到PTC0、PTC01、PTC02、PTC05。

圖1 半夏多糖Q-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離洗脫曲線

3.2 基本化學性質分析 通過PMP 柱前衍生HPLC 法對半夏多糖各組分的單糖組成進行分析，見圖2，不同組分多糖的總糖含量、蛋白質含量以及各單糖相對比例計算結果見表1。

表1 半夏多糖總糖含量、蛋白質含量、單糖組成及相對比例分析結果（±s）

表1 半夏多糖總糖含量、蛋白質含量、單糖組成及相對比例分析結果（±s）

注： —為未檢測到。

樣品總糖含量/%蛋白質含量/%單糖組成及相對比例RhaGlcGalManGlcNGlcAGalAAra PTC072.4±1.23.4±0.18.719.649.810.24.0——7.7 PTC0169.3±0.93.4±0.39.19.959.37.13.67.9—3.1 PTC0274.6±1.13.1±0.29.824.239.710.62.14.03.56.1 PTC0575.9±1.83.1±0.114.226.231.615.04.8—4.04.2

圖2 半夏多糖各組分單糖組成HPLC 分析圖

從圖2 可知，半夏多糖各組分PTC0、PTC01、PTC02和PTC05 單糖組成較復雜，其中PTC0 由Gal、Glc、Man、Rha、Ara 和GlcN 6 種單糖組成，相對比例為49.8 ∶19.6 ∶10.2 ∶8.7 ∶7.7 ∶4.0； PTC01 由Gal、Glc、Rha、GlcA、Man、GlcN 和Ara 7 種單糖組成，相對比例為59.3 ∶9.9 ∶9.1 ∶ 7.9 ∶ 7.1 ∶ 3.6 ∶ 3.1； PTC02 由Gal、Glc、Man、Rha、Ara、GlcA、GalA 和GlcN 8 種單糖組成，相對比例為39.7 ∶24.2 ∶10.6 ∶9.8 ∶6.1 ∶4.0 ∶3.5 ∶2.1； 而PTC05由Gal、Glc、Man、Rha、GlcN、Ara 和GalA 7 種單糖組成，相對比例為31.6 ∶26.2 ∶15.0 ∶14.2 ∶4.8 ∶4.2 ∶4.0，說明半夏多糖是單糖組成極為復雜的雜多糖。

由表1 可知，半夏多糖各純化組分蛋白含量均較低。

3.3 紫外-可見光譜分析 半夏多糖經QFF 純化獲得的4個組分的紫外-可見光譜見圖3?？芍?，PTC0、PTC01、PTC02 和PTC05 在260、280 nm 附近僅有微弱吸收峰，說明半夏多糖各組分核酸和蛋白質含量較低，這與蛋白質含量測定結果一致，可用于后續進一步的研究。

圖3 半夏多糖各組分紫外-可見光譜圖

3.4 紅外光譜分析 半夏多糖經QFF 純化得到的各組分的紅外光譜分析圖見圖4?？芍?，4 個多糖組分存在相似的多糖特征峰。4 個樣品在3 395 cm-1附近均有強且寬大的吸收峰出現，說明多糖存在分子間和分子內氫鍵，為糖鏈中-OH伸縮振動引起［24］； 2 926 cm-1附近出現的吸收峰為糖類物質特征峰，為糖鏈上-CH 伸縮振動引起［25］。1 640 cm-1附近出現-OH 彎曲振動特征吸收峰［26］，1 060 cm-1附近為糖鏈上糖苷鍵C-O-C 伸縮振動引起，1 034 cm-1附近的吸收峰為葡萄糖特征峰，說明4 個組分均含葡萄糖，這與單糖組成分析結果相符，可知PTC0、PTC01、PTC02 和PTC05 均為糖類化合物。

圖4 半夏多糖各組分紅外光譜圖

3.5 半夏多糖不同組分的抗氧化活性 以多糖質量濃度的對數為橫坐標（X），以不同自由基清除率為縱坐標（Y）進行回歸，半夏多糖各組分對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除活性結果見圖5，其IC50值見表2。由圖5A 可知，4 個組分對DPPH 自由基均有清除作用，且隨著質量濃度升高，對DPPH 自由基清除作用增強，其中PTC0 作用最強。由圖5B 可知，與維生素C 相比，4 個組分對超氧陰離子自由基均有清除作用，且隨多糖質量濃度升高而升高，其中PTC0 作用最強。從圖5C 可知，與維生素C 相比，4 個組分對羥基自由基的清除作用較弱，且隨質量濃度升高而升高，其中PTC01 作用最強。說明4 個組分均具有較好的抗氧化活性且呈劑量依賴性，但不同多糖組分對不同自由基的清除活性存在一定差異，這可能與其細微結構的差異有關［27］。

表2 半夏多糖各組分抑制自由基的IC50值（±s，n＝3）

表2 半夏多糖各組分抑制自由基的IC50值（±s，n＝3）

注：*P＜0.05。

樣品IC50/（μg·mL-1）DPPH 自由基超氧陰離子自由基羥基自由基VC102.3±9.6* 316.4±12.3* 158.2±15.8*PTC01 011.4±32.3*999.8±29.7*3 162.5±25.4*PTC011 653.1±14.5*3 981.3±45.5*1 003.3±10.7*PTC025 623.2±58.1*6 309.7±25.4*2 238.6±12.5*PTC052 213.1±22.9*1 258.1±10.2*6 309.4±47.4*

圖5 半夏多糖對3 種自由基的清除活性

3.6 免疫增強活性 由圖6 可知，4 個半夏多糖組分均有促進RAW264.7 細胞增殖的作用，PTC0 在100～400 μg/mL范圍內能促進RAW264.7 細胞增殖，且細胞活力隨多糖質量濃度增大而增大，在400 μg/mL 時促進RAW264.7 細胞增殖作用最強，細胞活力為118.8%； PTC01 在各質量濃度均有促增殖作用，在400 μg/mL 時細胞活力最大，為128.8%； PTC02 在各質量濃度均能促進RAW264.7 細胞增殖，且作用效果與質量濃度呈正相關，細胞活力在400 μg/mL時達到161.9%，與空白組比較，對RAW264.7 促增殖作用極顯著（P＜0.01），與陽性對照LNT 作用相當（LNT 在400 μg/mL 時細胞活力為163.1%）； PTC05 在各質量濃度均有促增殖作用，但與空白組比較，促增殖作用不顯著，在400 μg/mL 時細胞活力為最大值111.8%。表明PTC02 具有較強的免疫增強活性。

圖6 半夏多糖對RAW264.7 細胞的作用

4 討論

多糖是半夏的主要活性成分，本研究以半夏為原料，通過水提醇沉獲得半夏多糖，并經過QFF 陰離子交換柱進行分離純化，得到4 個組分。通過紅外光譜分析發現，4 個組分均為糖類化合物； 紫外-可見光譜和化學分析發現其蛋白質和核酸含量較低，總糖含量高。半夏多糖各組分組成復雜，其中PTC0 由6 種單糖組成，PTC01 和PTC05 由7 種單糖組成，PTC02 由8 種單糖組成，并且不同組分單糖組成的相對比例也存在較大差異。多糖的活性與其結構密切相關，特別是決定一級結構的單糖殘基組成及相對比例，半夏多糖不同組分結構的復雜性也預示不同組分可能具有不同的活性。

生物體內活性氧過量時會引起細胞器損傷、蛋白質變質和DNA 損傷等，導致病理損傷。對DPPH、超氧陰離子和羥基自由基清除活性的評價是常用的體外抗氧化活性評價方法，本研究結果表明半夏多糖各組分對3 種自由基的清除活性具有量效關系，不同組分的IC50差異較大，推測可能與4 個多糖的單糖組成和相對比例有關，可能還與分子量、空間結構等因素有關［28］，其抗氧化活性與結構的關系還需進一步深入研究。

免疫調節藥物常用于免疫失調，但研究發現有些免疫調節劑會產生有害作用［29］。天然多糖不僅具有免疫調節活性，且毒副作用小，這使其成為研究熱點。本研究發現4個組分在25 ～400 μg/mL 范圍內對RAW264.7 細胞增殖均有促進作用，其中PTC02 作用最強，與臨床使用的免疫調節藥物LNT 活性相當，并且呈明顯的劑量依賴性。單糖組成及相對比例分析結果表明，和其他組分相比，PTC02 的單糖組成最復雜，這使其一級結構與空間結構變化更多樣，可能是其高免疫增強活性的原因［30］。

綜上所述，從半夏中制備的4 個組分均為雜多糖，具有較好的抗氧化活性和免疫增強活性，其中PTC02 作用最強，具有進一步開發為免疫調節藥物的潛力。本研究為半夏多糖進一步的結構表征奠定了基礎，并為其作為天然抗氧化劑和免疫增強藥物的開發提供了參考。