高致病性豬藍耳病RT-PCR檢測

張力超

磐石市動物檢疫站，吉林磐石 132300

近年來，隨著人們生活水平的提高，大家對豬肉的需求和豬肉的品質要求也越來越高，很多人開始加入高標準生豬養殖的隊伍，生豬養殖的數量和規模在不斷地擴大。但同時各種疾病也隨之而來，其中，豬藍耳病是生豬養殖的主要疫病之一，這種病對生豬的危害極大，傳染性很強，一旦發病，很容易造成大面積傳播，豬死亡數量增加，這樣就會導致經濟效益降低。

1 豬藍耳病的概念

豬藍耳病，也被稱為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)，它屬于一種危害很大、流行范圍很廣的傳染病，不同年齡、品種和性別的豬都可以被感染，在臨床上，它的癥狀主要有：懷孕母豬流產、早產、木乃伊胎和死胎繁殖障礙，仔豬和育肥豬出現呼吸道綜合癥狀[1～3]，它屬于一種免疫抑制病，經常會繼發其他病原感染。

2 國內外豬藍耳病現狀

豬藍耳病距今已經有三十多年的歷史，第一次于1987年被美國報道，1990～1991年在歐洲暴發，導致超過一百萬頭豬死亡[4～6]。在1991年，荷蘭的wenswon等人首先從病豬身上提取到了這種病毒。自20世紀90年代初首次發現于亞洲地區后[7～8]，至2006年已在中國10余個省份檢出，累計已達20萬余頭，近50頭豬死亡[9]。該病的主要特點為：在我國該病的發病率高達100%，死亡率高達50%，母豬的流產率高達30%[10]，而且在育肥過程中還會出現病死癥。高致病力豬藍耳病毒（Virus）具有傳染性強、傳播迅速、發病率高、病死率高等特點，在世界范圍內廣泛流行，給我國生豬產業帶來了極大地危害。

3 研究目的和意義

高致病豬藍耳病是一種嚴重危害豬群健康的疾病，但其發病機制尚不明確。另外，由于與其他導致母豬生殖障礙綜合征的疾病具有十分相似的臨床表現，并且PRRS生豬的不同種群和不同的發病時期表現出較大的差別，再加上近年來逐漸增多的亞臨床型和慢性感染，使得該病的確診變得更加困難。所以，從病豬的臨床表現和病理改變來看，都不能明確診斷，還需要通過實驗室檢測來明確診斷。而常用的實驗室診斷有以下幾種方法：①反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)；②酶聯免疫吸附試驗法（ELISA)；③免疫過氧化物酶單層細胞染色試驗法（IPMA)；④血清中和試驗（SN)；⑤間接免疫熒光試驗法（簡稱IFA）。然而，現有的檢測手段或缺乏特異性或靈敏度低，或操作繁瑣費時費力，無法實現對PRRSV和HP-PRRSV的快速識別。用RT-PCR方法檢測高致病性豬藍耳病時,操作較為簡便,對臨床樣品的快速診斷及流行病學調查具有很強的實用價值。

4 材料與方法

4.1 材料

4.1.1 主要試劑

RNA抽提試，PCR試劑。

4.1.2 主要儀器

紫外可見光光度計，超凈工作臺，PCR儀，高速低溫離心機，電子天平，冰箱。

4.1.3 病料

病料采集自本地部分地區具有豬藍耳病臨床癥狀和病理變化的病豬、死豬。

4.2 方法

4.2.1 樣品的采集和處理

稱量取豬組織0.05g（肺，腦，扁桃體，脾），置于粉碎機中，用微量的石英砂進行粉碎機粉碎，然后用1.5mL的生理鹽水繼續進行粉碎，攪拌均勻后，轉移到1.5mL無菌離心管內，以8000r/s的速度離心8min，將100μL的上清液置于1.5mL的EP試管內。

陽性對照組：將100μL的陽性對照組置于1.5mL的EP試管內。

陰性對照組：將100μL的陰性對照組置于1.5mL的EP試管內。

4.2.2 病毒RNA的提取

將200mg的組織取出，放入1.5mL的EP管中，再將1mL的TRIZOL試劑倒入其中，進行勻漿處理。震動30s，在室溫靜置6min,然后添加0.2mL氯仿，猛烈搖晃30s，混合均勻，在12000r/s和4℃下，在5min的室溫靜置15min,把上清移到一個新的離心機中，再加同上清量相同的異丙醇，倒置攪拌均勻。在-20℃下放置30min，在12000r/s下，在4℃下進行20min的離心，除去上清液。之后將75%乙醇1mL加到該沉淀物上，以12000r/s的速度在4℃下進行10min的離心。去掉上層清液，使其保持沉降，然后晾干10min。將所得到的沉淀物溶于20μLDEPC處理過的水中，并將其置于-20℃的環境中。

4.2.3 進行RT-PCR

4.2.3.1 cDNA的制備

以上一步驟獲取的RNA作為模板，按照實驗室設定的反轉錄條件，制備10μL反向錄體系，在PCR儀上進行反轉錄，在30℃退火，42℃延長，99℃變性反應后，得到cDNA。在這里，反向記錄條件被描述如下。

當反應條件為30℃時，作用時間10min，當反應條件為42℃時，作用時間60min，當反應條件99℃時，作用時間5min，當反應條件為4℃時，作用時間60min，然后停止。

4.2.3.2 PCR擴增

以反轉錄產物cDNA作為模板，通過上下游引物（P1/P2）對目標基因進行PCR，然后加入Taq脫氧核酶，將dNTP放入PCR反應管內，最終與ddH20進行配平。接著將PCR反應試條放入PCR放大器內，進行預變、變、退火、伸展、全伸展等反應，并進行35次以上的循環，最后將PCR結果儲存在4℃下。組分為10xbuffer時，反應體積2.5μL，組分為TaqDNA酶時，反應體積0.5μL，當組分為dNTPmixture時，反應體積2.0μL，當組分為P1時，反應體積1.0μL，當組分為P2時，反應體積1.0μL，當組分為cDNA時，反應體積2.0μL，當組分為ddH20時，反應體積16μL。

反應條件。Pcr擴增條件，當反應條件為94℃預變性，作用時間為5min，當反應條件94℃變性，作用時間30s，當反應條件65℃退火，作用時間30s，當反應條件72℃延伸，作用時間30s，如此做35次循環，當反應條件72℃總延伸，作用時間7min，4℃保存。

4.2.4 電泳

4.2.4.1 制備2.0%瓊脂糖凝膠板

準備2%的瓊脂糖（20mL的小橡膠）：在一個圓筒中，將0.4g的瓊脂糖置于其中，再加20mL1xTAE，將小燒杯倒轉過來，在微波爐中加熱三次，直到所有的瓊脂糖都溶解掉，然后把電泳槽關閉，再加一把梳子，把它放到大約65℃的溫度下攪拌，然后把它仔細地倒進一個內槽玻璃板里，讓它慢慢地擴散，一直擴散到玻璃凹陷里，在室溫和溫下靜置，直到它徹底凝結，垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中，再把1xTAE的凹陷進去，一直到它淹沒在凹陷里1～2mm。

4.2.4.2 加樣

將5μLPCR反應的結果和0.5μL的加樣緩沖劑混合后，放入瓊脂糖膠片上的加樣口，用10μL微型吸液器把試樣放入膠片上的試樣凹陷處，每次放入一個試樣后，要重新放入試樣，避免污染，放入試樣時要注意記錄好放入的次序。

4.2.4.3 電泳

將凝膠板放入后，立刻對試片上的凝膠板進行電流電泳，將電泳器上的蓋子和電極插入，在120伏的電壓下，電泳26min，試片從負極（黑）到正極（紅），直到BPA顯示的條條游走到2/3的位置，才結束電泳（以DNA分子量為基準進行電泳）。

4.2.4.4 染膠

在完成電泳后將所述凝膠移除，以0.5μg/mL的1xTAEBrylar為1xTAE，對其進行大約18min的染色，然后用水沖洗9min.

4.2.4.5 觀察照相

將所制備的凝集素置于長波長紫外線燈膠體成像機和紫外線透光機上，對其進行紫外透射儀觀察和記錄。

4.2.4.6 判斷片段大小

用分子量標準比較判斷PCR片段大小。

5 結果與討論

5.1 陽性、陰性對照檢測結果

當陽性對照顯示421bpHP-PRRSV/511bp美國型擴增帶時，陰性對照沒有對應的靶帶，該次檢測成立，并判定結果。

5.2 待檢樣品檢測結果

待檢樣品RT-PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳后，在紫外分析儀下出現了目的性擴增條帶，說明該養豬場有高致病性豬藍耳病流行，且病毒呈陽性。

5.3 討論

5.3.1 RT—PCR結果判定的影響因素

5.3.1.1 混合感染的影響

在各地表現出相似的臨床表現，只不過是因為病毒的變異而產生的。由于在中國暴發了這場疫情，在各個地方都會出現不一樣的病理學特征，有些是單一的病毒感染，有些是多種的細菌組合感染，在進行了細菌學的檢測之后，沒有發現任何由其他細菌導致的并發癥。

5.3.1.2 操作過程中的影響

在進行RT-PCR檢測時其中最重要的一步，就是抽取RNA。用變性試劑將組織或細胞粉碎，再用氯仿等有機溶劑提取，再進行沉淀、洗滌、干燥，最終溶解。RNase普遍且穩定性好，能抵抗高壓滅菌、煮沸等環境條件，且通常無需輔酶。因此，在RNA制劑中，哪怕是有一點點的RNA酶，都會導致RNA在生產與分析的過程中發生分解，而所生產的RNA的完整性和純度，則會對RNA分析的結果產生直接地影響，因此，RNA的生產與分析的操作具有很大的難度。試驗中要注意的問題有很多，一是要盡量減少內源RNase；此外，還需對外來核酸酶進行嚴格地控制。在操作者的手汗、唾液等中發現了一種外來的核酸酶，它還可以在粉塵中發現，用于其他分子生物試驗的核酸酶也可能引起污染。

5.3.2 如何做好高致病性豬藍耳病防治工作

預防高致病性豬藍耳病必須從推廣科學飼喂、改進飼喂條件、強化綜合性防治、實施有效的疫苗接種等方面進行探討。要做好以下工作。

5.3.2.1 強化飼養的管理

采取“全進全出”的飼養方式，夏季要做好防熱、防風的工作，冬季則要兼顧室內的溫度和空氣流通。大型場一定要對其進行封閉式的管理。

5.3.2.2 科學免疫

一般情況，育肥豬在24日齡左右，接種一次高致病性豬藍耳病疫苗，種母豬除了24日齡左右進行免疫外，配種前應加強一次免疫，種公豬除了在24日齡左右免疫外，間隔6個月也要進行一次免疫。

5.3.2.3 規范補欄

在購買仔豬的時候，要盡量挑選沒有發生疾病的地區，并且要檢查是否有檢驗合格的檢驗報告，買回來之后先進行半個月的隔離，待體溫恢復正常后，才可以進行混群。

5.3.2.4 加強消毒工作

做好養豬場的環境衛生工作，用復合醛類等消毒劑給養殖場、豬舍和周邊環境消毒，養豬場的糞便要及時清理干凈。

5.3.2.5 藥物預防

選用合適的抗菌藥，并且要有一個科學地使用方法，這樣才能防止豬的細菌感染，從而改善豬的身體狀況。

6 結論

本次試驗利用RT-PCR法檢測豬高致病性藍耳病，結果表明此方法檢測高致病性藍耳病具有操作簡單、價格低廉、檢測時間短、速度快、受環境因素影響低、準確性高、實用等特點，非常適用于基層有條件的獸醫站等部門進行疫病的診斷與檢測。