葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母共培養發酵野櫻桃飲品研究

李嬋媛，鄭淼心，鄒玉婷，賀紫涵，許碧濤，張 慶,*，秦 佳，田文強

（1.西華大學食品與生物工程學院，食品微生物四川省重點實驗室，四川成都 610039；2.小金冰峰酒業有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州 624200）

近年來，共培養發酵由于能夠獲得某些純培養發酵無法獲得的產物及提高產率等優點而成為研究熱點[1-2]，其在果汁飲品發酵中也同樣受到關注，如Zhang 等[3]、易鑫等[4]利用釀酒酵母與植物乳桿菌分別共培養發酵了桑葚和柚子飲品，改善了酒體營養品質與感官特性。果酒發酵過程中發揮主要作用的是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母在發酵過程中主要負責酒精的生成，而非釀酒酵母在發酵過程中產生更多的單萜醇和乙酸酯等揮發性物質，對發酵飲品感官特征有積極貢獻[5]。采用非釀酒酵母與釀酒酵母共培養發酵果汁，可以提高果汁發酵飲品的品質和感官。Hu 等[6]、Ge 等[7]、Li 等[8]分別利用了不同的非釀酒酵母與釀酒酵母共培養發酵果汁飲品，結果增加了飲品中揮發性物質含量，提高了感官品質等。

葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）是一種非釀酒酵母，具有的高活性β-葡萄糖苷酶可以在發酵過程中產生豐富的乙酸酯類化合物，對增強產品風味特性及其復雜性方面有積極作用[9-10]。低醇果汁發酵飲品（酒精度＜7% vol）因酒精含量低且含豐富的生物活性物質而備受歡迎[11]，H.uvarum在生產低醇果汁發酵飲品方面有積極貢獻。Mancic 等[12]利用H.uvarum與釀酒酵母共培養發酵葡萄汁，獲得了酒精度5% vol 左右且香氣馥郁的低醇葡萄酒；劇檸等[13]利用H.uvarum與釀酒酵母共培養發酵枸杞汁，制得酒精度7% vol 左右且感官和品質更佳的枸杞酒。

野櫻桃，學名細齒櫻桃（Cerasus serrulaFranch.Yu et Li），主要生長于高寒地區。野櫻桃果實營養豐富，含多種生物活性成分，且不含農藥殘留，屬于無公害果品，深受消費者喜愛。四川四姑娘山野櫻桃資源豐富，但其精深加工產品少，開發發酵飲品可提高其附加值，提升川西高原特色水果發酵產業經濟價值[14]。目前還未有利用葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母共培養發酵四川四姑娘山野櫻桃的研究。

本研究利用實驗室前期從四川四姑娘山野櫻桃發酵底泥中篩選出的一株H.uvarumYT-35，將其與商品化S.cerevisiae共培養釀造野櫻桃發酵飲品，對發酵過程中的微生物數量、還原糖、乙醇等動態變化分析，利用高效液相色譜儀（HPLC）對有機酸進行動態檢測，采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質譜（HSSPME/GC-MS）對發酵飲品的揮發性風味物質進行測定，以增加H.uvarum在實際生產中用于提高果汁發酵飲品品質和感官的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野櫻桃 采自四川省四姑娘山；葡萄汁有孢漢遜酵母YT-35（H.uvarumYT-35，NCBI 登錄號為SUB12134304） 篩選于野櫻桃自然發酵底泥 中國（成都）西華大學四川食品微生物學重點實驗室保藏；商品化釀酒酵母（S.cerevisiae） 安琪酵母股份有限公司；檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸、冰醋酸 色譜純，上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂粉 分析純，北京奧博星生物技術公司；磷酸二氫鉀、氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠 分析純，成都化夏化學試劑有限公司。

2965 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；GCMS2020NX 氣相質譜聯用儀 日本島津公司；FluorMax20 酶標儀 中國上海閃譜生物科技有限公司；Allegra X-15R 冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野櫻桃發酵飲品的釀造 參考 Hu 等[6]并加以修改，分別將釀酒酵母與H.uvarumYT-35 進行活化，再接種1×106CFU/mL 到100 mL 滅菌（巴氏滅菌法60 ℃，30 min）野櫻桃汁（還原糖含量：150.3 g/L，pH=3.53）中單獨發酵；將釀酒酵母與H.uvarumYT-35 以1:1 比例共接種1×106CFU/mL 到100 mL 滅菌野櫻桃汁中進行共培養發酵。每組實驗3 個平行，28 ℃靜置發酵120 h。

培養基配制：YPD 培養基：酵母膏3 g，蛋白胨6 g，葡萄糖6 g，瓊脂粉6 g 加水至300 mL，121 ℃滅菌15 min。

WL 鑒別培養基：葡萄糖15 g、蛋白胨1.5 g、酵母浸粉1.2 g、瓊脂6 g，儲液A（KH2PO45.5 g，KCl425 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，加水定容至400 mL，4 ℃保存）12 mL、儲液B（FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，加水定容至100 mL，4 ℃保存）0.3 mL、儲液C（0.44 g 溴甲酚綠溶于10 mL 無菌水和10 mL 95%酒精中）0.3 mL，加水至300 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 理化指標測定 菌落計數方法：采用WL 固體培養基進行平板菌落計數法[15]。

還原糖、乙醇含量的測定參照國標GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

有機酸測定：參照盧倩文等[16]方法測定，并加以修改：Aminex HPX-87H 離子排阻色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm），流動相：7 mmol/L 的硫酸溶液（pH=2.20），流速：0.6 mL/min，紫外檢測波長：210 nm，柱溫：60 ℃，進樣量：20 μL。

1.2.3 揮發性物質測定 參照蔡婷等[17]對櫻桃果酒揮發性物質的分析方法。樣品預處理：取7.8 mL 發酵樣品加入0.2 mL 稀釋1×105倍的仲辛醇，置于15 mL 頂空瓶中，加入2 g NaCl，加蓋密封，40 ℃恒溫水浴中平衡10 min，將老化好的固相微萃取器（DVB/CAR/PDMS 三層復合自動探針，50/30 μm，1 cm）插在樣品瓶上，吸附30 min 后拔出，插入氣相色譜儀進樣口，于220 ℃解吸3 min，進行GC-MS檢測分析。氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），進樣溫度為240 ℃。程序升溫：初始溫度50 ℃保持2 min。以3 ℃/min升至80 ℃保持10 min，以5 ℃/min 升至230 ℃保持6 min。載氣為氦氣，線速為1.0 mL/min，分流比5:1。質譜條件：電離方式為電子電離（Electron Ionization，EI）源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃，掃描范圍30.00～500.00 m/z。

定性：GC-MS 分析得到的質譜數據，通過NIST、Wiley 和香精香料標準譜庫進行檢索比對，進行定性分析（選取匹配度不低于80%的組分）。定量：采用內標法進行半定量分析，內標選用1-辛醇。

式中：CT是目標化合物T 的濃度，mg/L；AT是目標化合物T 的色譜峰面積；AI是內標物（1-辛醇）的色譜峰面積；CI是內標物（1-辛醇）的濃度，mg/L。

1.3 數據處理

利用Origin 2021、TBtools 軟件進行數據處理，采用SPSS 26 軟件進行數據統計分析，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中微生物生長的變化

根據WL 鑒別培養基上菌落顏色和形態（如圖1A，釀酒酵母為白色，圓形有凸起，H.uvarumYT-35 為淡綠色扁平狀），可對發酵過程中微生物計數。

圖1 商業釀酒酵母（左）和H. uvarum YT-35（右）在WL 培養基上的形態（A）及發酵過程中的菌落數變化（B）Fig.1 Morphology of commercial S. cerevisiae (left) and H.uvarum YT-35 (right) on WL medium (A) and changes in the number of colonies during fermentation (B)

發酵過程中微生物的生長變化如圖1B 所示，釀酒酵母和H.uvarumYT-35 單獨發酵的菌落均在24 h達到平穩期，72 h 進入衰亡期。共培養發酵中，H.uvarumYT-35 在前期占優勢，在12～24 h 菌落數量超過釀酒酵母，24 h 時達到極大值3.0×107CFU/mL，48 h 之后H.uvarumYT-35 菌落數量迅速減少，在72 h 時H.uvarumYT-35 菌落數量＜1×106CFU/mL；釀酒酵母菌落數量在72 h 時達到極大值約7.8×107CFU/mL，往后發酵過程中呈現快速下降趨勢，直至發酵結束，種群數量約為3.6×105CFU/mL。

研究發現，在單一酵母菌發酵體系中，酵母菌菌落數量一般在48～72 h 便達到最大值，共培養體系中，非釀酒酵母在發酵前期占優勢，隨著發酵的進行而全部死亡，釀酒酵母活菌數變化趨勢與其單獨發酵趨勢相似[10,18]，可知共培養體系中釀酒酵母的生長受葡萄汁有孢漢遜酵母的影響較小。共培養體系中H.uvarumYT-35 在后期消失可能跟發酵過程中營養物質量減少、乙醇濃度增加和酸堿度變化有關。此外，釀酒酵母在發酵過程中會在細胞表面累積抗菌肽，通過胞間接觸可能導致H.uvarumYT-35 數量急劇下降[19]。

2.2 發酵過程中還原糖和乙醇含量的變化

發酵過程中還原糖和乙醇含量的變化（圖2）結果顯示，3 種方式發酵過程中還原糖含量先下降后穩定而乙醇含量先增加后穩定。發酵結束后還原糖含量結果為釀酒酵母單發酵＜共培養發酵＜H.uvarumYT-35 單發酵，乙醇含量結果相反。共培養發酵還原糖含量減少速率和乙醇含量增加速率均介于釀酒酵母單發酵和H.uvarumYT-35 單發酵之間。研究表明[6]，非釀酒酵母不能完全發酵，單菌株發酵通常導致飲品的殘糖含量高、酒精度低。除此之外，非釀酒酵母菌體數量在前期大于釀酒酵母菌體數量，而前者還原糖消耗速率和乙醇積累速率低于后者[6,8]，結合圖1B 中共培養發酵的微生物群體演變規律及圖2中還原糖變化趨勢，可以發現，菌體數量的變化過程正是乙醇含量積累速率和還原糖消耗速率變化的直接原因。

圖2 發酵過程中的還原糖和乙醇含量變化Fig.2 Changes in sugar and ethanol contents during fermentation

2.3 發酵過程中有機酸含量的變化

有機酸對果汁發酵飲品具有一定的抑制致病菌的作用，并能直接影響到飲品的總體品質評價[20]。通過對各組樣品的有機酸含量檢測（圖3）可以看出，共培養發酵過程中檸檬酸、蘋果酸的含量呈先上升后下降趨勢，相較于釀酒酵母單發酵，共培養發酵過程中兩者含量更少，這表明H.uvarumYT-35 可能在發酵體系中產生更少的檸檬酸、蘋果酸，這可能是共培養發酵中檸檬酸、蘋果酸含量減少的原因。降低果汁發酵飲品發酵過程中蘋果酸、檸檬酸的含量有利于合成風味前體物質，可以更好地提高風味[21]?？鼘幩釋l酵飲品的口感有較大的影響[22]，共培養的奎寧酸含量低于釀酒酵母單發酵，且H.uvarumYT-35 單發酵的奎寧酸含量在12 h 后降為0，這表明H.uvarumYT-35 對奎寧酸的生成有影響，H.uvarumYT-35 在共培養發酵體系中影響了奎寧酸的生成。冰醋酸可參與乙酸乙酯等酯類物質的生成，有利于提高成品芳香性[22]，結果顯示冰醋酸含量為緩慢增長，其中共培養發酵中冰醋酸含量最高。研究表明[23]，部分非釀酒酵母可以有效降低果汁發酵飲品中的有機酸含量，改善產品的感官品質，H.uvarumYT-35 與釀酒酵母共培養發酵野櫻桃飲品顯示同樣的結果。

圖3 發酵過程中各有機酸含量的變化Fig.3 Changes in the content of organic acids during fermentation

2.4 發酵過程中揮發性物質含量的變化

通過對發酵結束后取得的樣品進行HS-SPME/GC-MS 分析（表1），可知釀酒酵母單獨發酵、H.uvarumYT-35 單獨發酵、共培養發酵分別檢測出36、47、44 種揮發性物質。較釀酒酵母單獨發酵而言，共培養發酵可產生更多的酯類風味物質，如己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸異戊酯、肉桂酸甲酯、反式肉桂酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲酸芐酯、乙酸異戊酯和鄰苯二甲酸二異丁酯，同時可增強如月桂酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、苯甲醇、辛酸和月桂酸等風味物質的含量，賦予了野櫻桃發酵飲品更豐富的香味。

表1 櫻桃發酵飲品主要揮發性酯類物質含量Table 1 Content of main volatile esters in cherry fermented beverage

2.4.1 酯類物質 酯類化合物對果酒的主體香型具有重要的作用，是構成果酒香氣的重要物質[24]。釀酒酵母單獨發酵對比，共培養發酵提高了月桂酸乙酯、十四酸乙酯、癸酸異戊酯等物質的含量，它們可使酒體產生水果、椰子、玫瑰等香氣。甚至產生了釀酒酵母單獨發酵沒有的8 種酯類物質：己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸異戊酯、肉桂酸甲酯、反式肉桂酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲酸芐酯、鄰苯二甲酸二異丁酯，這些酯類大多呈現植物、水果香味，增加了產品香氣的復雜性[25]。結果表明H.uvarumYT-35 的加入可以增加野櫻桃發酵飲品的酯類含量，這點與Ge[7]等的研究結果類似。

2.4.2 醇類物質 較釀酒酵母單發酵而言，共培養提高了苯乙醇、苯甲醇、反式-橙花叔醇的含量。這些醇屬于高級醇，是酒體重要的風味物質之一[24]。雖然高級醇能提高酒體風味，但若含量過高（＞2 g/L），不僅會導致酒體風味變糟，甚至會對人體有毒害作用，其中對人體危害最大的是異戊醇和異丁醇[26-28]。釀酒酵母單發酵檢出1.533 mg/L 的異丁醇，而共培養發酵中未檢出異丁醇，這表明共培養發酵可以大幅度減少異丁醇的生成，降低發酵飲品對人體的傷害，此結果與Mancic 等[12]和劇檸[13]等的研究結果類似。

2.4.3 酸類、酚類、醚類 酸類、酚類、醚類揮發性風味物質含量較少，但它們對酒體的香味呈現也有重要的影響[24]。共培養發酵較釀酒酵母單發酵提高了辛酸、9-癸烯酸、月桂酸、己酸的含量，它們呈現果香、乳香等氣味。僅在H.uvarumYT-35 單獨發酵中檢測到一種酚類，即2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，其能散發出香辛料香。三組樣品中均檢測出了二乙二醇乙醚，該物質能散發令人愉快的氣味，其中共培養的含量最高。

酯類物質是發酵飲品重要的香氣物質，它們大多以無味的糖苷鍵結合態存在于水果中，包括單糖苷、雙糖苷和三糖苷[29]，糖苷鍵結合態揮發性物質在發酵過程中可通過β-葡萄糖苷酶和其他糖苷酶的共同作用釋放，H.uvarum具有β-葡萄糖苷酶活性，這可能解釋了H.uvarumYT-35 的加入使共培養發酵飲品酯類物質含量、種類增加的原因。結合2.2 發酵過程中還原糖和乙醇含量的變化可知，共培養體系中H.uvarumYT-35 可能將還原糖轉化為其它物質，而非醇類物質[12-13]，這可能是共培養發揮飲品中揮發性醇類物質含量較少的原因。

2.4.4 聚類分析 對發酵野櫻桃飲品揮發性香氣成分定量結果進行歸一化，繪制聚類熱圖（圖4），以展現不同發酵方式最終樣品各芳香物質含量的差異及聚類過程。由圖4 結果可知，H.uvarumYT-35 單獨發酵和共培養發酵的揮發性香氣成分總量較釀酒酵母單發酵更加豐富。聚類結果表明，H.uvarumYT-35 單發酵與共培養發酵為一類，說明兩種發酵方式樣品中揮發性物質較相近，釀酒酵母單發酵單獨為一類，且與另兩組靠近。由此可推斷，共培養發酵揮發性香氣成分總量更豐富與H.uvarumYT-35 相關，H.uvarumYT-35 的加入可以增加野櫻桃發酵飲品的風味。

圖4 櫻桃發酵飲品揮發性芳香成分聚類熱圖Fig.4 Clustering heat map of volatile aromatic components in in cherry fermented beverage

3 結論

本研究以葡萄汁有孢漢遜酵母與商品化釀酒酵母共培養制備野櫻桃發酵飲品，在共培養發酵過程中，H.uvarumYT-35 在發酵前期占優勢；共培養發酵可降低乙醇含量，獲得低醇發酵飲品，同時可降低檸檬酸、蘋果酸和奎寧酸等有機酸含量。揮發性香氣成分檢測發現，共培養發酵可豐富酯類物質種類，增加如己酸乙酯、苯甲酸甲酯、辛酸異戊酯、肉桂酸甲酯、反式肉桂酸乙酯、十八酸乙酯、苯甲酸芐酯和鄰苯二甲酸二異丁酯等，并可提高月桂酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇、苯甲醇、辛酸和月桂酸等揮發性物質的含量。揮發性香氣成分聚類分析也表明H.uvarumYT-35 可明顯提升共發酵野櫻桃飲品中的揮發性成分的種類及含量。研究表明H.uvarumYT-35 協同釀酒酵母可釀造出低醇且風味物質更為豐富的野櫻桃飲品。后續將進一步對菌株H.uvarumYT-35 進行全基因組分析，并結合關鍵揮發性香氣成分的代謝轉變等探究其轉化機理，旨在為果汁發酵飲品開發提供優質菌種資源。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).