裂褶菌發酵西洋參工藝優化及體外抗氧化能力研究

王崑侖，管立軍,*，高 揚，嚴 松，李家磊，季妮娜，李 波，周 野

（1.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱 150086；2.黑龍江省食品加工重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150086；3.黑龍江省農業科學院大豆研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

西洋參（Panax quinquefoliusL.），又名洋參、花旗參等，系五加科人參屬植物，原產于美國和加拿大，其化學成分豐富，生物活性廣泛，藥用價值高，受到全世界人民的喜愛[1]。西洋參具有補氣養陰、清熱生津之功效，用于改善氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內熱消渴和口干舌燥等癥狀。西洋參的活性成分主要有人參皂苷、多糖、黃酮等，其中皂苷Rg1、Rb1、Re、Rb2、Rc、Rd、Rg2是西洋參中含量較高的7 種，質量分數占總人參皂苷的90%以上[2]。隨著國內外對西洋參研究的深入，發現西洋參的人參皂苷，尤其是二醇系人參皂苷，在酸、堿、高溫和微生物的作用下，可以分解為西洋參中沒有的稀有皂苷Rg3、s-Rh2、r-Rh2和擬人參皂苷CK 等[3-4]。其中，Rg3具有很強的抗氧化能力，并能提高人體對多種癌細胞的抗增殖作用[5-6]。 Rh2是抗腫瘤效果最好的人參皂苷類，能通過抑制腫瘤細胞分裂周期，來抑制腫瘤細胞擴散[7]。擬人參皂苷CK 在抗腫瘤、抗菌和治療白血病方面具有良好功效[8-10]。西洋參中多糖是僅次于皂苷的活性成分，具有抗氧化、提高機體免疫力和抗腫瘤等作用[11-13]。西洋參黃酮具有抗氧化和降血壓等作用[14-15]。

裂褶菌（Schizophyllum communeFr.）又稱白參、樹花、八擔柴，是一種營養豐富的大型真菌[16]。它多在針葉樹或闊葉樹的腐木、枯枝、倒木上發現，是典型的木腐菌；味道鮮美，口感鮮嫩，具有濃郁菇類香味，可在不同的環境下生長[17]。裂褶菌具有滋補強壯、清肝明目、鎮靜作用，在民間常用于治療白帶異常，藥用價值明顯[18]。目前對裂褶菌的研究頗為廣泛，歐美國家、日本等國在裂褶菌多糖的抗癌活性物質、分子生物學、優良菌株的選育等方面研究較多[19-20]，國內主要在裂褶菌的人工馴化栽培及栽培現狀、裂褶菌多糖利用、藥用價值及發酵條件等方面展開研究[21]。經研究發現裂褶菌主要功效成分裂褶菌多糖具有抗腫瘤[22-23]、提高免疫力[24]、抗疲勞和抗氧化等作用[25-26]。利用裂褶菌進行發酵有效物質生物轉化成為新的熱點。劉海英[27]利用裂褶菌發酵轉化大豆異黃酮，結果表明大豆異黃酮糖苷被轉化為苷元。

鑒于此，本研究以西洋參為原料，創新性采用裂褶菌作為固態發酵西洋參的菌種，將裂褶菌的活性物質與西洋參的活性物質結合，產生稀有人參皂苷，獲得更多的人參皂苷、多糖、黃酮等活性成分，產生極具保健價值的裂褶菌西洋參發酵物。并通過單因素實驗和響應面Box-Behnken 試驗設計，對裂褶菌固態發酵西洋參工藝進行優化，建立一個高效的發酵方法，為西洋參的發酵工藝提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參 黑龍江省海林西洋參種植基地；標準品：人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd、Rg3、s-Rh2、r-Rh2、擬人參皂苷CK 99.5%，上海純優生物科技有限公司；蘆丁對照品 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇 分析純，沈陽邁科麥科技有限公司；裂褶菌（Schizophyllum commune）1 號菌株，編號336356 云南食用菌研究所；裂褶菌（Schizophyllum commune）2 號菌株（編號SHBCC D11505）和3 號菌株（編號SHBCC D61817） 上海保藏生物技術中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖 天津市天力化學試劑有限公司；濃硫酸 天津市祥瑞鑫化工科技有限公司；苯酚 天津市紅巖化學試劑廠；無水乙醇、正丁醇、甲醇（分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，上海阿拉丁股份有限公司；實驗用去離子水 娃哈哈集團。

KQ-400KDE 型高功率超聲波清洗器 濟寧亨達超聲波有限公司；CARY100 型紫外分光光度計上海精科有限公司；XS204 型分析天平 瑞士METTLER TOLEDO 公司；3-18K 型冷凍離心機德國SIGMA 公司；NAI-T1-50 型臺式真空冷凍干燥機 上海那艾精密儀器有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺 上海蘇凈實業有限公司；LHS-250HC-11 型恒溫恒濕箱 上海一恒科學儀器有限公司；HZQ-F100 型振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；BL-50A 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海東亞壓力容器制造有限公司；TSE240V-ULTS 型立式超低溫冰箱、U3000 型高效液相色譜儀 美國賽默飛公司；SHB-III 型循環水式真空泵 無錫市長慶化工防腐設備有限公司；DYF-500 型萬能粉碎機浙江瑞昊機械制造有限公司；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 蘇州德沃斯烘箱制造有限公司；DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；QT-1 型旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 西洋參→冷凍干燥→粉碎（過80 目）→西洋參粉→滅菌→接種裂褶菌→培養→冷凍干燥→粉碎（過80 目）→西洋參發酵產物→活性物質含量檢測

操作要點：將西洋參冷凍干燥磨粉（過80 目）制成西洋參粉。稱取5.0 g 西洋參粉放入50 mL 三角瓶中，加入蒸餾水2.5 g 攪拌均勻，生物透氣膜封口，在滅菌鍋內121 ℃滅菌20 min，放冷，備用。在無菌環境下，向三角瓶中加入6%（w/w）接種量的裂褶菌和2.5 g 無菌水，攪拌均勻后，在25 ℃、80%濕度下培養8 d，使裂褶菌白色菌絲布滿三角瓶，冷凍干燥，粉碎過80 目篩，即得西洋參發酵物。檢測西洋參發酵物中活性物質人參皂苷、粗多糖和總黃酮的含量。

1.2.2 人參皂苷含量測定 人參皂苷對照品溶液的制備：精密稱取標準品人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd、Rg3、CK、s-Rh2、r-Rh2），溶于甲醇溶液中，定容，稀釋成合適的濃度梯度，過濾待檢測。

色譜條件：色譜柱（Waters-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：40 ℃；流動相為乙腈溶液；梯度洗脫程序為：0～25 min，乙腈的體積分數為20%；25～60 min，乙腈的體積分數由20%增至40%；60～90 min，乙腈的體積分數由40%增至55%；90～120 min，乙腈的體積分數55%[28]。

精密稱取1.0 g 西洋參發酵物，加入50.0 mL 水飽和正丁醇，稱定重量，水浴加熱回流1.5 h，放冷再稱定重量，用水飽和正丁醇補足減輕重量，搖勻過濾。精密量取濾液25 mL 蒸干，殘渣加50%甲醇適量使其溶解，定容于10 mL 容量瓶，搖勻濾過，針入高效液相色譜檢測，按下面公式計算人參皂苷含量：

式中：W1表示人參皂苷含量，%；C1表示根據峰面積計算出的溶液質量濃度，mg/mL；V1表示供試品溶液體積，mL；D1表示溶液稀釋倍數；M1表示取樣量，mg。

1.2.3 粗多糖含量測定 葡萄糖對照品溶液的制備：精密稱取葡萄糖對照品若干，配成濃度0.2 mg/mL對照溶液，備用。

標準曲線的繪制：采用苯酚-硫酸法，精密移取葡萄糖對照溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放于20 mL 具塞比色管中，用蒸餾水補至1.0 mL。移液管取1.0 mL 5%苯酚溶液于比色管中，再以較快的速度加入5.0 mL 濃硫酸，靜置10 min。將比色管置于渦旋振蕩器上振蕩十幾秒，使溶液充分反應，然后把試管放置在水浴鍋中30 ℃下反應20 min，于490 mm 波長下，UV 測吸光度[29]。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

西洋參發酵物粗多糖含量的測定：精密稱取1.0 g 西洋參發酵物，加入無水乙醇40 mL，在280 W、60 ℃、超聲提取40 min，提取液在8000 r/min 下離心15 min，去上清，殘渣加15 mL 的水，超聲提取3次，每次30 min，每次8000 r/min 離心15 min，合并三次的上清液于50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得樣品粗多糖待測液。移取粗多糖待測液0.5 mL，照標準曲線的方法測定吸光值，帶入標準曲線中，計算粗多糖濃度。按下面公式計算粗多糖含量：

式中：W2表示粗多糖含量，%；C2表示供試品溶液質量濃度，mg/mL；V2表示供試品溶液體積，mL；D2表示溶液稀釋倍數；M2表示取樣量，mg。

1.2.4 總黃酮含量測定 總黃酮對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁標準品若干，溶于60%乙醇溶液中，配制0.1 mg/mL 的對照溶液，備用。

標準曲線的繪制：采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，從蘆丁對照溶液中分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 放入10 mL 比色管，加60%乙醇溶至總體積5 mL。加入0.3 mL 質量分數為5%的NaNO2，震蕩混勻后，靜置8 min，再加0.3 mL 質量分數為10%的Al（NO3）3，振蕩搖勻后，靜置10 min，最后加4 mL 質量分數為4%的NaOH 溶液，用60%乙醇定容，搖勻靜置10 min 后，在500 nm 最大吸收波長測定吸光度[30]。繪制蘆丁濃度與吸光度的標準曲線。

西洋參發酵物總黃酮含量的測定：精密稱取1.0 g 西洋參發酵物，加入60%乙醇溶液30 mL，在280 W、50 ℃條件下，超聲提取3 次，每次40 min，每次8000 r/min 離心15 min，合并三次的上清液于100 mL 容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得樣品總黃酮待測液。精密移取總黃酮待測液1.0 mL，照標準曲線的方法測定吸光值，帶入標準曲線中，計算總黃酮濃度。按下面公式計算總黃酮含量：

式中：W3表示總黃酮含量，%；C3表示供試品溶液質量濃度，mg/mL；V3表示供試品溶液體積，mL；D3表示溶液稀釋倍數；M3表示取樣量，mg。

1.2.5 裂褶菌菌株的篩選 初選用于培養裂褶菌子實體的裂褶菌1 號菌株（編號336356）、用于科研生產L-蘋果酸的裂褶菌2 號菌株（編號SHBCC D11505）和用于分解木質素的裂褶菌3 號菌株（編號SHBCC D61817），以期通過1 號菌株旺盛生長能力，2 號菌株分泌的L-蘋果酸和3 號菌株分解木質素能力來轉化西洋參中人參皂苷、粗多糖和黃酮等活性成分。按1.2.1 方法分別制備西洋參發酵物。并檢測裂褶菌1 號菌株西洋參發酵物、裂褶菌2 號菌株西洋參發酵物、裂褶菌3 號菌株西洋參發酵物和未發酵西洋參中的總人參皂苷的含量、粗多糖的含量和總黃酮含量，選取適合菌株。

1.2.6 單因素實驗 根據1.2.1 方法，恒定培養濕度80%，選取在條件pH7，接種量8%，發酵8 d，考察不同發酵溫度（20、25、30、35 和40 ℃）對發酵物中總人參皂苷含量的影響；固定條件pH7，溫度為30 ℃，裂褶菌固態發酵西洋參8 d，考察不同裂褶菌的接種量（4%、6%、8%、10%、12%和14%）對發酵物中總人參皂苷含量的影響；固定條件發酵溫度30 ℃，接種量10%，發酵8 d，考察不同pH（4、5、6、7、8 和9）對發酵物中總人參皂苷含量的影響；固定條件pH7，發酵溫度30 ℃，接種量10%，考察不同發酵時間（2、4、6、8、10 和12 d）對發酵物中總人參皂苷含量的影響。

1.2.7 響應面優化試驗 為全面考察裂褶菌發酵西洋參工藝中各因素的影響，在單因素實驗結果的基礎上，運用響應面軟件Design-expert 8.0 進行Box-Benhnken 試驗設計。精密稱取5.0 g 西洋參粉放入50 mL 三角瓶中，以裂褶菌接種量（X1）、發酵溫度（X2）、發酵時間（X3）和發酵pH（X4）為自變量，總人參皂苷含量（Y1）為響應值，采用4 因素3 水平響應面試驗模型進行優化。因素水平和編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Response surface test factor level coding table

1.2.8 裂褶菌固態發酵西洋參對活性成分的影響在優化裂褶菌固態發酵工藝后，檢測裂褶菌西洋參發酵物中各人參皂苷的變化、粗多糖含量的變化和總黃酮含量的變化，闡明裂褶菌固態發酵西洋參過程中對各活性成分的影響。

1.3 體外抗氧化實驗

1.3.1 DPPH 自由基清除率實驗 通過DPPH 自由基清除率實驗評價未發酵西洋參、西洋參發酵物及VC對照品的清除自由基的能力。分別稱取10.0 g未發酵西洋參和西洋參發酵物用100 mL 40%乙醇超聲提取1 h，50 ℃減壓旋蒸去乙醇，凍干成粉。參考Bai 等[31]的方法略有修改，分別配制（62.5、1000、2500、5000、10000、20000、40000 和80000 μg/mL）濃度的未發酵西洋參和西洋參發酵物凍干粉溶液，再配制（62.5、125、250、500、1000、1500、5000、10000、20000、40000 和80000 μg/mL）濃度的VC對照品溶液，取樣品溶液1.5 mL 到比色管中，再加入等體積的0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min，517 nm 波長下檢測吸光值，按公式計算DPPH 自由基清除率：

式中：A 為DPPH 待測樣品的吸光值；A0為空白樣品的吸光值。

1.3.2 ABTS+自由基清除率實驗 通過ABTS+法評價未發酵西洋參、西洋參發酵物及VC對照品的清除自由基的能力。按1.3.1 處理樣品，配制VC對照品溶液和樣品溶液，再參考ARTS 等[32]的方法略有修改，配制在734 nm 波長下的吸光度為0.70±0.02 的ABTS+稀釋液，分別取不同濃度的VC對照品溶液和樣品溶液各0.1 mL 與4.9 mL ABTS+稀釋液混合，常溫下避光反應6 min，在734 nm 波長下檢測吸光值。按公式計算ABTS+自由基清除率：

式中：A0為空白樣品的吸光值；Ai為ABTS+待測樣品的吸光值。

1.4 數據處理

上述實驗均重復 3 次，并取平均值為實驗結果。利用DPS 數據處理系統、Design-Expert 11 軟件、Origin 8.06 和IC50計算器分別對實驗結果進行統計學分析、作圖、響應面分析和抗氧化實驗的IC50值計算。

2 結果與分析

2.1 活性物質標準曲線的建立

人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd、Rg3、s-Rh2、r-Rh2、擬人參皂苷CK、粗多糖和總黃酮的線性回歸方程見表2。由表2 可知，各皂苷、粗多糖和總黃酮的相關系數R2均大于0.999，說各成分在表2 指定的濃度范圍內，線性關系良好。

表2 活性物質標準曲線Table 2 Standard curve of active substance

2.2 裂褶菌菌株篩選結果

檢測3 種裂褶菌西洋參發酵物和未發酵西洋參的活性成分，結果如表3 所示：總人參皂苷含量中裂褶菌2 號菌株＞裂褶菌1 號菌株＞裂褶菌3 號菌株＞未發酵西洋參；粗多糖含量中裂褶菌3 號菌株＞裂褶菌2 號菌株＞未發酵西洋參＞裂褶菌1 號菌株；總黃酮含量中裂褶菌2 號菌株＞裂褶菌1 號菌株＞裂褶菌3 號菌株＞未發酵西洋參。所以，裂褶菌2 號菌株更適合于生產人參皂苷，裂褶菌3 號菌株更適合于生產多糖。由于總皂苷價值高于粗多糖，因此選擇裂褶菌2 號菌株為后續實驗的菌株。

表3 西洋參發酵物與未發酵西洋參活性成分比較Table 3 Comparison of active components between fermented and unfermented Panax quinquefolius L.

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 發酵溫度對總人參皂苷含量的影響 由圖1可知，發酵溫度對總人參皂苷含量具有顯著性影響（P＜0.05），裂褶菌固態發酵西洋參溫度在20～30 ℃條件下，總人參皂苷含量緩慢增加，在30 ℃時達到最大值9.2%±0.1%。在30～40 ℃條件下，總人參皂苷含量快速下降。這是因為30 ℃以上裂褶菌生長緩慢，35 ℃以上裂褶菌停止生長，40 ℃裂褶菌出現死亡[33]，不能發揮轉化人參皂苷作用。故最適發酵溫度選擇為30 ℃。

圖1 發酵溫度對總人參皂苷含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on total ginsenoside content

2.3.2 裂褶菌接種量對總人參皂苷含量的影響 由圖2 可知，裂褶菌接種量對總人參皂苷含量具有顯著性影響（P＜0.05），當裂褶菌接菌量在4%～10%時，隨著接菌量的增大，總人參皂苷含量也逐漸增加，當裂褶菌接菌量達到10%時總人參皂苷含量最高，達9.3%±0.1%；當裂褶菌接菌量高于10%時，總人參皂苷含量逐漸下降。這是因為接種量的增加明顯提高了固態發酵體系中裂褶菌的含量，提高了發酵效率；當接種量高于10%時，發酵三角瓶中裂褶菌數量過多，產生競爭性抑制，影響菌體生長代謝，減弱了發酵效果；同時會消耗部分人參皂苷用于菌種繁殖，降低其含量[34]。故最適接種量選擇為10%。

圖2 裂褶菌接種量對總人參皂苷含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of Schizophyllum commune on total ginsenoside content

2.3.3 pH 對總人參皂苷含量的影響 由圖3 可知，pH 對總人參皂苷含量具有顯著性影響（P＜0.05），裂褶菌固態發酵西洋參pH 在4～6 條件下，總人參皂苷含量逐漸增加；在pH6 時達到最大值9.4%±0.2%。在pH6～8 條件下，總人參皂苷含量緩慢下降；pH9時，總人參皂苷含量大幅下降。這是由于裂褶菌生長喜酸性環境，菌絲生長的pH 適宜為5～6[33]；發酵體系中，裂褶菌分泌的β-葡萄糖苷酶在pH6～8 之間具有較好的活性[29]。故最適發酵pH 選擇為6。

圖3 pH 對總人參皂苷含量的影響Fig.3 Effect of pH value on total ginsenoside content

2.3.4 發酵時間對總人參皂苷含量的影響 由圖4可知，發酵時間對總人參皂苷含量具有顯著性影響（P＜0.05），裂褶菌固態發酵西洋參時間2～10 d，總人參皂苷含量快速增加，在10 d 時達到最大值10.3%±0.3%。發酵10～12 d，總人參皂苷含量逐漸下降。這是因為在裂褶菌發酵初期，發酵三角瓶中營養物質充足，裂褶菌代謝旺盛，有利于向人參皂苷的轉化；時間過長，營養物質消耗完，裂褶菌消耗部分人參皂苷用于菌種繁殖，在皂苷水解酶作用下生成皂苷元或次皂苷[34]。故最適發酵時間選擇為10 d。

圖4 發酵時間對總人參皂苷含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total ginsenoside content

2.4 響應面優化發酵工藝

2.4.1 Box-Behnken 試驗設計 根據單因素實驗結果，利用響應面Box-Behnken 法以裂褶菌接種量（X1）、發酵溫度（X2）、發酵時間（X3）以及發酵pH（X4），4 個因素為自變量，以總人參皂苷含量（Y1）為響應值，設計4 因素3 水平試驗模型。設計方案及試驗結果見表4。

表4 Box-Behnken 設計方案及結果Table 4 Design and result of Box-Behnken

通過Design-Expert 8.06 軟件對表4 中的試驗數據進行多元二次多項式回歸擬合，得到總人參皂苷含量（Y1）回歸方程：

Y1=10.22+0.51X1+0.62X2-0.43X3-0.37X4+0.51 X1X2-0.54X1X3+0.41X1X4+0.34X2X3+0.029X2X4+0.39X3X4-0.89X12-1.29X22-1.01X32-1.03X42

由表5 可知，總人參皂苷含量（Y1）回歸模型的P值＜0.01，極顯著，說明這個二次回歸方程模型可靠。并且，Y1模型的失擬項不顯著（P＞0.05），說明Y1模型未失擬，擬合可信。模型決定系數R2=96.50%，調整決定系數R2adj=91.20%，說明91.20%的響應值可變性可以被該模型解釋，該模型擬合良好。下述方差結果表明，Y1模型可以準確描述各因素與總人參皂苷含量的關系。模型中因素X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X12、X22、X32和X42對總人參皂苷含量影響極顯著（P＜0.01），因素X1X4和X3X4對總人參皂苷含量的影響顯著（P＜0.05），其余因素不顯著。通過F值大小可知，各因素對總人參皂苷含量影響強弱的順序為X2（發酵溫度）＞X1（裂褶菌接種量）＞X3（發酵時間）＞X4（發酵pH）。

表5 方差分析結果Table 5 ANOVA of test results

2.4.2 各因素交互作用分析 如圖5 所示，裂褶菌接種量（X1）和發酵溫度（X2）、裂褶菌接種量（X1）和發酵時間（X3）、裂褶菌接種量（X1）和發酵pH（X4）、發酵時間（X3）和發酵pH（X4）的各組2D 等高線圖均呈現橢圓狀，表明各組因素間的交互作用顯著[35]；從3D 響應面圖中可見，各變量對總人參皂苷含量影響均呈現先增后減的趨勢，響應面趨于拋物線，且曲面斜率陡峭，表明各組因素間的交互作用顯著[36]，與Y1模型方差結果一致；而且深色部分主要集中在10.0%范圍內，說明模型擬合出的最高總人參皂苷含量大于10.0%。

圖5 各因素交互作用對總人參皂苷含量影響的等高線與相應曲面圖Fig.5 Contours and response surface plots of the effect of various factors interactions on the influence of total ginsenoside content

2.4.3 模型驗證結果 根據二次回歸方程，擬合裂褶菌固態發酵西洋參工藝條件及結果。預測優化工藝條件為，裂褶菌接種量10.86%，發酵溫度31.40 ℃、發酵時間9.69 d，發酵pH5.85，總人參皂苷含量10.51%±0.3%。根據實際操作需要，現實優化工藝條件為，裂褶菌接種量10.9%，發酵溫度31 ℃、發酵時間10 d，發酵pH5.9，總人參皂苷含量10.28%±0.2%。誤差在2.0%之內，說明響應面擬合的工藝模型準確可靠。

2.4.4 裂褶菌固態發酵西洋參對活性成分的影響結果 在裂褶菌固態發酵西洋參的優化工藝條件下發酵西洋參，結果如表6 所示，人參皂苷Rb1和Rg2含量大幅下降，人參皂苷Re 含量小幅下降；人參皂苷Rg1、Rc、Rb2、Rd 含量均上升，其中人參皂苷Rd 含量大幅上升；Rg3、s-Rh2、r-Rh2和擬人參皂苷CK為新出現皂苷。這說明西洋參原有人參皂苷Rb1、Rg2和Re 經裂褶菌微生物轉化，分解為Rg1、Rc、Rb2、Rd、Rg3、s-Rh2、r-Rh2、擬人參皂苷CK，其中人參皂苷Rd 為主要分解產物。同時，西洋參中粗多糖含量從11.83%±0.06%上升為12.85%±0.05%，說明裂褶菌發酵西洋參過程中產生多糖；西洋參中黃酮含量從0.17%±0.01%上升為0.67%±0.01%，說明裂褶菌發酵西洋參過程中產生黃酮類物質。

表6 裂褶菌固態發酵西洋參對活性成分的影響Table 6 Effect of solid state fermentation of Panax quinquefolius L.by Schizophyllum commune on active components

2.5 體外抗氧化能力實驗結果

2.5.1 DPPH 體外抗氧化實驗結果 如圖6 所示，對照VC、西洋參發酵物和未發酵西洋參對DPPH 自由基均有清除作用，隨著溶液濃度增加清除能力增強，其中VC溶液濃度從62.5 μg/mL 增加到1000 μg/mL時，對DPPH 自由基的清除率從37.23%增加到89.95%，后續濃度VC溶液對DPPH 自由基的清除率達到100%；西洋參發酵物待測溶液濃度從62.5 μg/mL 增加到80000 μg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率從1.52%增加到86.65%，在相同濃度下未發酵西洋參待測溶液對DPPH 自由基的清除率從1.24%增加到80.55%。將各R 值與對應的溶液濃度，分別帶入IC50計算器軟件中進行計算。結果，VC的IC50值為134 μg/mL，西洋參發酵物的IC50值為31365 μg/mL，未發酵西洋參的IC50值為44169 μg/mL。因此，清除DPPH 自由基能力的強弱為：VC＞西洋參發酵物＞未發酵西洋參。這是因為裂褶菌西洋參發酵物中抗氧化能力強的西洋參多糖、總黃酮和稀有皂苷含量均高于未發酵西洋參[37-38]，所以裂褶菌西洋參發酵物清除DPPH 自由基能力好于未發酵西洋參。

圖6 DPPH 自由基清除曲線Fig.6 DPPH free radical removal curve

2.5.2 ABTS+體外抗氧化實驗結果 如圖7 所示，對照VC、西洋參發酵物和未發酵西洋參對ABTS+自由基均有清除作用，隨著溶液濃度增加清除能力增強，其中VC溶液濃度從62.5 μg/mL 增加到1000 μg/mL時，對ABTS+自由基的清除率從29.83%增加到97.86%，后續濃度VC溶液對ABTS+自由基的清除率達到100%；西洋參發酵物待測溶液濃度從62.5 μg/mL 增加到80000 μg/mL 時，對ABTS+自由基的清除率從3.22%增加到89.71%，在相同濃度下未發酵西洋參待測溶液對ABTS+自由基的清除率從2.42%增加到82.57%。將各R 值與對應的溶液濃度，分別帶入IC50計算器軟件中進行計算。結果，VC的IC50值為87 μg/mL，西洋參發酵物的IC50值為10910 μg/mL，未發酵西洋參的IC50值為18713 μg/mL。因此，清除ABTS+自由基能力的強弱為：VC＞西洋參發酵物＞未發酵西洋參。雖然西洋參發酵物和未發酵西洋參較VC的清除ABTS+自由基的能力存在差距，但西洋參發酵物和未發酵西洋參具有抗氧化能力。由于，清除ABTS+自由基能力與清除DPPH 自由基能力呈極顯著正相關[39]，所以裂褶菌西洋參發酵物清除ABTS+自由基的能力好于未發酵西洋參。

圖7 ABTS+自由基清除曲線Fig.7 ABTS+ free radical removal curve

3 結論

本研究以西洋參為原料，篩選適合裂褶菌菌種，通過單因素和響應面試驗優化裂褶菌發酵西洋參工藝，得到優化條件：裂褶菌接種量10.9%，發酵溫度31 ℃，發酵時間10 d，發酵pH5.9。結果顯示：裂褶菌西洋參發酵物的總人參皂苷含量為10.28%，粗多糖含量為12.85%，總黃酮含量為0.67%，較未發酵西洋參的三者含量均有提高。并且大分子人參皂苷Rb1、Rg2和Re 含量降低，小分子人參皂苷Rg1、Rc、Rb2、Rd、Rg3、s-Rh2、r-Rh2和擬人參皂苷CK 含量升高。其中，稀有人參皂苷Rg3、s-Rh2、r-Rh2和擬人參皂苷CK 為新出現皂苷?？寡趸瘜嶒炞C明：裂褶菌西洋參發酵物的DPPH 和ABTS+自由基清除能力的IC50值分別為31365 和10910 μg/mL，均好于未發酵西洋參，但低于VC。本研究表明裂褶菌固態發酵西洋參能提高總人參皂苷、粗多糖、總黃酮和稀有人參皂苷的含量，增強其抗氧化能力，為西洋參的開發利用提供數據支持。

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