響應面優化硒化白及多糖的制備工藝及其體外抗氧化活性研究

涂玲飛，李 焱,*，張 振

（1.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽 550014）

白及（Bletilla striata（Thunb.） Reichb.f.）是蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）多年生草本植物，植株高18～60 cm，披針形葉片，假鱗莖呈白色，具有很強的環境適性，主要分布在貴州、廣西、四川和云南等地[1]。白及多糖是白及塊莖中最主要的活性成分，隨著科學技術和研究方法的發展，許多研究者通過相關實驗表明白及多糖具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節、止血及胃腸黏膜保護等作用[2]?，F已廣泛應用于醫藥[3]、食品[4]及日化領域[5]。

硒是人和動物體所必需的一種微量元素，它在維持機體正常功能和健康方面起著重要作用，具有抗菌、抗氧化及調節免疫力等功能[6]。但硒不能由機體自主合成只能從體外吸收，因此對于人和動物而言，為避免缺硒導致各種疾病的產生，補充一定量的硒元素尤為重要。其中，硒多糖是一種將無機硒與多糖結合形成的新型功能性多糖，目前研究的硒多糖主要有天然硒多糖和人工合成硒多糖[7]。許多研究表明，與無機硒和多糖相比，硒多糖具有更好的生物活性[8]。如通過硒化修飾可以顯著增強五味子多糖的抗氧化活性，硒化五味子多糖可以顯著保護肝細胞免受H2O2的侵害[9]；羅敏等[10]通過使用酸作為催化劑制備的硒化米胚多糖，具有較好體內抗氧化活性以及較好的DPPH、羥自由基、以及超氧陰離子清除作用。此外，與傳統的硒補充劑相比，含硒成分的硒多糖具有毒性更低、生物利用度更高、控釋增加等特點[11]。因此，硒多糖成為近年來人們關注的研究課題。

白及多糖作為白及的主要活性成分之一，對其進行化學修飾也成為了研究熱點，但利用無機硒對其進行硒化修飾的文章未見報道。因此，本文通過單因素實驗，以白及多糖和亞硒酸鈉為原料，硒化多糖的硒含量為指標，考察亞硒酸鈉、冰乙酸的用量以及反應時間、反應溫度對硒含量的影響，并利用響應面優化法優化硒化多糖的制備工藝。再以最優工藝制備硒化白及多糖，對比硒化前后白及多糖體外抗氧化活性的差異性，為進一步研究白及多糖及硒多糖在醫藥、食品及日化領域的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫花白及鱗莖 產自貴州省遵義市湄潭縣白及基地；亞硒酸鈉 上海泰坦科技股份有限公司；冰乙酸、無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司；硝酸、鹽酸 成都市科隆化學品有限公司；硫酸亞鐵上海皓鴻生物醫藥科技有限公司；水楊酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二胺 上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司；ABTS 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 合肥巴斯夫生物科技有限公司；氨水 重慶江川化工集團有限公司；甲苯 成都金山化學試劑有限公司；以上所用試劑均為分析純；透析袋（MD44-5M，截留分子量：3500 Da） 北京蘭杰柯科技有限公司。

HH-4 恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；101-OAB 電熱鼓風干燥箱、DK-98-Ⅱ電子萬用爐天津市泰斯特儀器有限公司；UH5300 紫外可見分光光度計 天津冠澤科技有限公司；ReadMax 1500 光吸收全波長酶標儀 上海閃普生物科技有限公司；Nicolet iS5 傅里葉變換紅外光譜 美國賽默飛；TLE 204E/02 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硒化白及多糖的制備 按照課題組前期通過響應面優化提取工藝所得的最佳提取條件提取白及多糖，命名為BSP[12]，利用苯酚-硫酸法測得BSP 的總糖含量為59.78%±1.20%。參考李曉嬌等[13]的方法，稍作修改，準確稱取一定量的BSP 粉末于錐形瓶中溶解，再按比例加入一定量的冰乙酸和亞硒酸鈉，充分攪拌，置于恒溫水浴鍋中反應一段時間，將反應液轉移至3500 Da 透析袋中，使用蒸餾水透析，每隔2 h 更換一次蒸餾水，每次更換蒸餾水前取少量透析液加入抗壞血酸等待5 min，直到透析液不再變為紅色，達到去除鹽類等小分子雜質以及未與多糖結合的游離硒的目的，透析即可結束。將反應液轉移至燒杯并加入6 倍無水乙醇于4 ℃下醇析過夜，抽濾，干燥，即得硒化白及多糖，命名為BSP-Se。

1.2.2 硒含量的測定 采用鄰苯二胺法測定硒含量[14]，參考李麗彩等[15]、李世杰[16]的方法，稍作修改。配制硒含量為200 μg/mL 的標準溶液精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 標準溶液置于20 mL 棕色容量瓶中，先加水補至10 mL 左右，再加入2 mL 質量濃度5%的EDTA-2Na 溶液和2 mL質量濃度2%的鄰苯二胺溶液，調pH 至2 左右，定容，保持pH 在2 左右。將其置于暗處反應1 h，加入5 mL 甲苯振蕩萃取，收集上層有機溶液，測定各標準反應溶液在334 nm 處的吸光度值[17]。以硒質量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，所得方程為y=0.099x+0.0615，R2=0.9908。

精密稱取20 mg 多糖，加入2 mL 濃硝酸加熱消解，冷卻，加入6 mol/L 的鹽酸5 mL，繼續加熱蒸發使液體減少至1 mL 左右，停止加熱，冷卻反應液，將反應液倒入20 mL 棕色容量瓶中，再用水沖洗并轉移至容量瓶，后續步驟同標準曲線繪制方法，空白樣品以同樣方法操作。根據吸光值在硒標準曲線得相應濃度，按下式計算樣品中硒含量（mg/g）。同時結合制備過程中亞硒酸鈉的加入量和制得樣品中硒含量可得硒回收率。

式中：C 為所測得硒質量濃度，μg/mL；V 為待測樣溶液體積，mL；M 為待測多糖質量，g；m1為所得BSP-Se 含硒量，g；m0為BSP 含硒量，g；m 為加入的亞硒酸鈉含硒量，g。

1.2.3 單因素實驗條件的確定 以硒含量和硒回收率為指標，按照1.2.1 硒化白及多糖的制備方法，分別考察亞硒酸鈉、冰乙酸與BSP 的用量比以及反應時間、反應溫度對制備的BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響。固定BSP 質量為0.2 g、反應溫度80 ℃、反應時間為8 h、冰乙酸:BSP=3，分別考察Na2SeO3與BSP 的用量比為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 時對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響；固定BSP 質量為0.2 g、反應溫度80 ℃、反應時間為8 h、Na2SeO3與BSP 的質量比為1.5，分別考察冰乙酸與BSP 的用量比為1、2、3、4、5、6 時對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響；固定BSP 質量為0.2 g、反應溫度80 ℃、Na2SeO3與BSP 的質量比為1.5、冰乙酸:BSP=3，分別考察反應時間2、4、6、8、10、12 h 對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響；固定BSP 質量為0.2 g、反應時間6 h、Na2SeO3與BSP 的質量比為1.5，冰乙酸:BSP=3，分別考察反應溫度50、60、70、80、90 ℃對硒化多糖硒含量和硒回收率的影響。

1.2.4 響應面優化設計 本實驗利用Design-Expert 8.0.6 軟件根據Box-Behnken 響應曲面設計原理[18]，在單因素實驗的基礎上固定反應時間為6 h，以BSP-Se 的硒含量為響應值，Na2SeO3與BSP 的質量比、冰乙酸與BSP 的用量比、反應溫度為響應因子，對白及多糖的硒化工藝進行三因素三水平的響應優化設計。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素和水平Table 1 Factors and levels in the response surface experimental design

1.2.5 紅外光譜分析 將BSP 和BSP-Se 進行干燥處理，利用KBr 壓片法對其進行壓片制樣，樣品在紅外光譜上在500～4000 cm-1范圍掃描。

1.2.6 清除DPPH 自由基能力的測定 參考王自凡等[19]、高潔等[20]的方法，稍作修改。以80%的乙醇為溶劑配制吸光度約為0.7 左右的DPPH-乙醇溶液并用去離子水配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 各樣品溶液。取不同濃度的樣品液各1.0 mL，加入0.5 mL 的DPPH-乙醇溶液，混合均勻，避光反應30 min 后，精確吸取200 μL 于96 孔板，使用酶標儀在517 nm 波長下測定吸光度，記為A1；用相應量的80%的乙醇溶液代替多糖樣品溶液測定吸光度，記為A0；0.5 mL80%的乙醇代替DPPH-乙醇溶液的吸光度，記為A2；以相同濃度梯度的VC為陽性對照品。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

1.2.7 清除ABTS+自由基能力的測定 參考Chen等[21]的方法配制吸光度約為0.7 的ABTS 溶液，各樣品溶液濃度與上述1.2.6 一致。取不同濃度的樣品溶液各1.0 mL，加入2.0 mL ABTS 溶液混合均勻后，避光反應6 min，精確吸取200 μL 于96 孔板，使用酶標儀在734 nm 波長下測定吸光值，記為A1；以1.0 mL 蒸餾水代替1.0 mL 多糖樣品溶液測定空白對照吸光度，記為A0；2 mL 蒸餾水代替2 mL ABTS溶液的吸光度，記為A2；以相同濃度梯度的VC為陽性對照品。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

1.2.8 清除羥自由基（·OH）能力的測定 參考王自凡等[19]的方法配制1.5 mmol/L 的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液、20 mmol/L 的水楊酸溶液，各樣品溶液濃度與上述1.2.6 一致。取不同濃度的樣品溶液各1 mL，分別加入1.5 mLFeSO4溶液、0.5 mL H2O2溶液、0.5 mL 水楊酸溶液，37 ℃水浴培養1 h，精確吸取200 μL 于96 孔板，使用酶標儀在529 nm 測混合物的吸光度，記為A1；用1 mL 蒸餾水代替多糖樣品溶液測定吸光度，記為A0；0.5 mL 80%的乙醇溶液代替水楊酸鈉的吸光度記為A2；以相同濃度梯度的VC為陽性對照品。羥自由基清除率計算公式如下：

1.3 數據處理

使用Excel 2010 對實驗數據進行錄用和計算，實驗數據均為3 次獨立重復實驗結果的平均值±標準差表示，SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，并用Originpro 2019b 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 Na2SeO3與BSP 的質量比對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響 按照單因素條件中的方法考察Na2SeO3與BSP 的質量比對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響，結果如圖1 所示，當Na2SeO3與BSP的質量比在0.5～1.5 時，隨著質量比的增加，BSPSe 的硒含量也隨之增加，質量比為1.5 時，硒含量達到最高值，繼續增大Na2SeO3的用量，硒含量隨著質量比的增加而呈現下降趨勢，這可能是因為當硒含量達到最高值時，結合位點達到飽和，隨著Na2SeO3的增加，過量的硒競爭多糖中的結合位點，導致與多糖結合不足，進而降低了多糖中的硒含量[22]。硒回收率隨著Na2SeO3的增大而減小，是因為加入的Na2SeO3越來越多但能與多糖結合的硒卻只是小部分，其余未能結合的硒均被過濾掉，導致硒回收率顯著性減小，考慮到可以充分提高硒化白及多糖中硒元素的含量，故選擇Na2SeO3與BSP 的質量比為1.5 時為最佳用量比。

圖1 Na2SeO3 與BSP 的質量比對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響Fig.1 Effect of the mass ratio of Na2SeO3 to BSP on selenium content and selenium recovery of BSP-Se

2.1.2 冰乙酸的用量對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響 冰乙酸的用量對BSP-Se 硒含量的影響如圖2 所示，從圖中可以看出，隨著冰乙酸用量的增加，硒含量和硒回收率呈現先增加后減小的趨勢，在冰乙酸與BSP 的用量比為3 時，硒含量和硒回收率均達到最大值，說明此時為最佳酸性條件，酸水解使多糖中相應的活性基團暴露出來并與硒結合，起到了很好的催化作用。而冰乙酸與BSP 用量比低于3 時，酸性過低起不到最佳的催化作用，硒與多糖未能充分結合。但當用量比高于3 時，硒含量、硒回收率開始降低，可能是因為反應體系的酸度過高，使BSP 降解，破壞了多糖結構，不利于硒化反應的進行[23]。所以選擇硒含量和硒回收率最大值時（冰乙酸:BSP=3）為最佳硒化條件。

圖2 冰乙酸的用量對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響Fig.2 Effect of amount of glacial acetic acid on selenium content and selenium recovery of BSP-Se

2.1.3 反應時間對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響 反應時間對BSP-Se 硒含量及硒回收率的影響如圖3 所示，從圖中可以看出，在開始的2～6 h 時，隨著時間的延長，硒含量和硒回收率的增加較為明顯，當反應時間為6 h 時，硒含量達到最大值。硒含量在2 h 時為2.38±0.24 mg/g，較6 h 時的7.89±0.27 mg/g低很多，可能是因為時間太短，反應不充分，未達到硒與多糖結合飽和點，導致硒與多糖不能充分的結合在一起。當反應時間超過6 h 之后，硒含量和硒回收率逐漸降低，可能是因為樣品在80 ℃以及酸性條件下長時間反應，使多糖過度降解，導致與硒的結合位點遭到破壞，進而影響硒的結合，硒含量降低[24]。所以最佳反應時間為6 h，因6 h 與8 h 時的硒含量并沒有較顯著的變化（P＞0.05），所以固定反應時間為6 h，不作為響應面優化參數。

圖3 反應時間對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響Fig.3 Effect of response time on selenium content andselenium recovery of BSP-Se

2.1.4 反應溫度對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響 反應溫度對BSP-Se 硒含量的影響如圖4 所示，從圖中可以看出當反應溫度為50～80 ℃時隨著反應溫度的增大，BSP-Se 的硒含量和硒回收率也隨之增大，可能是因為在高溫的酸性條件下激活了反應的結合位點，使硒與多糖很好的結合，使硒含量和硒回收率增加。但繼續增大反應溫度，兩者均開始出現減小的趨勢，可能是因為過高的溫度導致一部分多糖鏈開始斷裂以及有機硒穩定性結構被破壞[17]，使多糖與硒的結合減少，進而硒含量出現減小的趨勢，所以選擇80℃為最佳反應溫度。

圖4 反應溫度對BSP-Se 硒含量和硒回收率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on selenium content and selenium recovery of BSP-Se

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 回歸模型建立及分析 根據響應面試驗設計原理，按照表1 的設計進行三因素三水平的響應面試驗，實驗結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6 軟件，將表2 實驗數據進行回歸擬合，由回歸分析結果可得，三因素對硒化白及多糖硒含量的影響擬合回歸方程為：Y=7.86+0.05A-0.014B-0.027C+0.051AB-0.012AC+0.036BC-0.38A2-0.22B2-0.17C2。并對此設計的模型進行方差分析，結果見表3。試驗所建立的模型復相關系數R2=0.9899，模型P＜0.0001 為極顯著，說明此模型有意義；失擬項P=0.4993＞0.05，失擬項檢驗不顯著，模型的擬合度良好；信噪比23.604＞4，說明該模型可預測試驗結果，而修正判定系數R2adj=0.9768，表示可以用此模型來預測97.68%的響應值，可信度高[17]。R2pred=0.9236 與R2adj=0.9768的值相差小于0.2，說明該響應面設計合理。模型中二次項A2、B2、C2和A 為極顯著（P＜0.01），AB 為顯著（P＜0.05），根據F值可知，各因素對硒化白及多糖的硒含量影響程度為：A（Na2SeO3:BSP）＞C（反應溫度）＞B（冰乙酸:BSP）。綜上所述，所建立的響應面模型用來優化BSP-Se 的最佳制備工藝條件是可行的。

表2 BSP-Se 制備工藝響應面分析方案及結果Table 2 Response surface experimental design and results of BSP-Se

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.2.2 響應面數學模型分析 用Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行分析并繪制響應面圖，得到圖5～圖7。各個因素之間的交互作用都對BSPSe 的硒含量存在相互影響，其影響程度可以通過響應面中的陡峭角度和等高線呈現的形狀以及等高線的疏密、顏色變化反映出來[25]。

圖5 Na2SeO3:BSP 和冰乙酸:BSP 對硒含量影響的響應面圖Fig.5 Response surface of the effects of Na2SeO3:BSP and glacial acetic acid:BSP on selenium content

圖5 中Na2SeO3:BSP 的陡峭度大于冰乙酸:BSP 的陡峭度，可以說明Na2SeO3:BSP 對硒含量的影響大于冰乙酸:BSP 對硒含量的影響，整體三維圖傾斜面大，對應的等高線呈橢圓形，說明Na2SeO3:BSP 與冰乙酸:BSP 兩者的交互作用對硒含量影響較大；圖6 中Na2SeO3:BSP 的陡峭度大于反應溫度的陡峭度，可以說明Na2SeO3:BSP 對硒含量的影響大于反應溫度對硒含量的影響，對應等高線形狀呈圓形，說明Na2SeO3:BSP 與反應溫度的交互作用對硒含量影響不顯著；圖7 中兩者的陡峭度大致一樣，反應溫度的陡峭度稍大于冰乙酸:BSP 的陡峭度，對應等高線形狀呈橢圓形，說明冰乙酸:BSP 和反應時間的交互作用對硒含量的影響作用顯著。相對于圖7，圖5 中等高線上數據及顏色變化較大，可判定AB的交互作用大于BC 的交互作用。綜上所述，各因素對于BSP-Se 硒含量的影響順序依次為：A（Na2SeO3:BSP）＞C（反應溫度）＞B（冰乙酸:BSP），各因素交互作用對于BSP-Se 的硒含量影響順序依次為：AB＞BC＞AC，與F值判斷結果一致。

圖6 Na2SeO3:BSP 和反應溫度對硒含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface of the effects of Na2SeO3:BSP and reaction temperature on selenium content

圖7 冰乙酸:BSP 和反應溫度對硒含量影響的響應面圖Fig.7 Response surface of the effects of glacial acetic acid:BSP and reaction temperature on selenium content

2.2.3 模型驗證 響應面數學模型得到硒化白及多糖的最佳制備工藝為：Na2SeO3:BSP=1.53、冰乙酸:BSP=2.97、反應溫度為79.14 ℃。該條件下硒化白及多糖的硒含量為7.862 mg/g，考慮實驗操作的可進行性，將工藝條件稍作調整，Na2SeO3:BSP=1.5、冰乙酸:BSP=3、反應溫度為80 ℃，在此條件下進行實驗，通過3 次工藝驗證試驗，最終得到硒化白及多糖的平均硒含量為7.831±0.11 mg/g，該結果與預測值相差0.031 mg/g，可以看出實際值和預測值相差較小，說明本次實驗所做模型可以較好地反映硒化白及多糖的制備工藝，可以認為本次實驗通過響應曲面法得到的各項硒化工藝的優化參數具有可靠性和準確性。

2.3 紅外光譜結果與分析

傅里葉變換紅外光譜可以用來判斷多糖結構中糖環類型和官能團類型，因此也可用來判斷硒化多糖結構的變化。BSP 和BSP-Se 的FT-IR 圖譜如圖8 所示，BSP 和BSP-Se 在3431、2927、1736、1375、1246、1061、875、809 cm-1等處均出現多糖典型的特征吸收峰，這些吸收峰與王自凡[26]的研究結果一致，表明硒化修飾并沒有改變多糖的主體結構，而BSP-Se 分別在764 cm-1和601 cm-1處產生了新的特征吸收峰，相關研究表明在765 cm-1附近出現的峰為OSe-O 伸縮振動引起的特征峰[27]，且Wang 等[28]研究發現硒化多糖與原多糖相比在609 cm-1處出現Se-O-C 鍵的新吸收峰，而這些特征吸收峰的出現表明多糖在硒化反應中成功修飾。綜上所述，BSP-Se 紅外光譜中601 cm-1處特征峰歸因于Se-O-C 的不對稱伸縮振動，764 cm-1處歸因于O-Se-O 的不對稱伸縮振動，表明BSP 在硒化反應中已成功修飾為BSP-Se。

圖8 BSP 和BSP-Se 的FT-IR 圖Fig.8 FT-IR spectrogram of BSP and BSP-Se

2.4 體外抗氧化結果與分析

2.4.1 DPPH 自由基清除能力測定 Na2SeO3、BSP和BSP-Se 對DPPH 自由基清除能力如圖9 所示。由結果可知，Na2SeO3、BSP 和BSP-Se 三者均對DPPH 自由基有一定的清除能力，且三者對自由基的清除能力均與其濃度大小呈正相關。隨著濃度的增加，Na2SeO3的清除能力變化較小，而BSP 和BSPSe 隨著濃度的增大，DPPH 自由基的清除率的增大比Na2SeO3明顯。與Na2SeO3和BSP 相比，BSP-Se清除DPPH 自由基的能力最強，顯著高于單獨使用BSP 和Na2SeO3（P＜0.05）。經計算，BSP 的IC50值為5.828 mg/mL，BSP-Se 的IC50值為2.875 mg/mL，BSP-Se 的IC50值幾乎是BSP 的一半，說明通過硒化修飾在一定程度上增加了白及多糖清除DPPH 自由基的能力。多糖的抗氧化效果與其自身供氫能力有關，在本研究中，BSP-Se 中硒元素的存在可以激發陽極區的氫供體，使BSP-Se 表現出更強的供氫能力，因此，BSP-Se 的抗氧化作用比BSP 更強[29]。

圖9 硒化前、后DPPH 自由基清除能力對比Fig.9 Scavenging effect on DPPH free radicals before and after selenization

2.4.2 ABTS+自由基清除能力測定 Na2SeO3、BSP和BSP-Se 對ABTS+自由基的清除能力測定結果如圖10 所示。由結果可知，Na2SeO3、BSP 和BSP-Se三者對ABTS+均具有一定的清除能力，且表現出劑量依賴關系。在小濃度范圍為內（0.2～0.6 mg/mL），與Na2SeO3和BSP 相比，BSP-Se 清除ABTS+自由基的能力最強，但當濃度大于0.6 mg/mL 時，Na2SeO3對ABTS+自由基的清除能力明顯增加，當濃度達到1.0 mg/mL 時，Na2SeO3對ABTS+自由基的清除能力接近于陽性對照VC，說明Na2SeO3本身就具有較強的ABTS+自由基清除能力；此濃度下，BSP 和BSP-Se 對ABTS+自由基的清除率分別為23.45%和36.41%，IC50值分別為8.475、4.431 mg/mL，由此可見，白及多糖與Na2SeO3結合后使其清除ABTS+自由基的能力明顯增加。推測原因是多糖與硒元素結合產生的硒基團可以激活多糖鏈上的氫原子，增加多糖提供氫原子的能力，而這些氫原子能將更多的自由基轉化為穩定的產物[30]。

圖10 硒化前、后ABTS+自由基清除能力對比Fig.10 Scavenging effect on ABTS+ free radicals before and after selenization

2.4.3 ·OH 清除能力測定 Na2SeO3、BSP 和BSPSe 對·OH 的清除能力測定如圖11 所示，由圖可知，Na2SeO3、BSP 和BSP-Se 三者對·OH 均具有較好的清除能力，且清除能力與其濃度大小呈正相關，即隨著樣品濃度的增加，清除率也隨之增加。在同一濃度下，與BSP 和Na2SeO3相比，BSP-Se 對·OH 的清除能力顯著增加（P＜0.05）。當濃度達到1 mg/mL 時，對羥自由基的清除能力為Na2SeO3（47.55%）＜BSP（52.51%）＜BSP-Se（65.27%），BSP 和BSP-Se 的IC50值分別為0.833、0.314 mg/mL?？赡苁且驗锽SPSe 中的硒基團如亞硒酸酯能與自由基離子（如Fe2+）共軛，致使羥自由基的生成被抑制，同時多糖的羥基可以提供氫與羥基自由基結合，達到清除效果[31]。前者可有效抑制自由基生成，后者能清除自由基，產生協同作用，使得硒化白及多糖對·OH 的清除率增大[32]。由此可見，通過硒化修飾亦可增加白及多糖對·OH 的清除效果。

圖11 硒化前、后·OH 清除能力對比Fig.11 Scavenging effect on ·OH before and after selenization

綜上所述，以亞硒酸鈉為原料，冰乙酸為催化劑對白及多糖進行硒化改性，硒化后的白及多糖相對于原白及多糖具有較高的清除DPPH、·OH 和ABTS+自由基的能力，且所有樣品對自由基的清除能力都具有濃度依賴性，但所有樣品對自由基的清除效果均顯著低于VC。在相同濃度下，硒化后的白及多糖相對于原白及多糖表現出優異的抗氧化能力。相關研究表明多糖的抗氧化作用的強弱是由其供氫能力決定的，由紅外光譜分析顯示，硒化后的多糖中含有Se-O-C 和O-Se-O 等硒基團，而這些基團的存在可以激活異構碳中的氫原子，該基團的活化能力越高，氫原子供體能力越強，其清除自由基的能力就越強[33]。因此，硒化修飾使白及多糖與硒元素結合形成硒基團硒，進而激活多糖鏈上的氫原子，增加多糖提供氫原子的能力，使多糖清除自由基的能力增加。這與Yuan[34]、Huang 等[35]通過硒化修飾顯著增加原多糖的抗氧化活性的研究結果一致。

3 結論

以白及多糖和亞硒酸鈉為原料，利用冰乙酸為催化劑對白及多糖進行硒化修飾，通過單因素實驗和響應面優化法獲得了硒化白及多糖的最佳制備工藝為Na2SeO3與BSP 的用量比1.5，冰乙酸與BSP 的用量比為3.0，反應溫度80 ℃，反應時間6 h，此條件下制備的MLP-Se 中硒含量高達7.831 mg/g，模型驗證實驗顯示實際值與預測值誤差僅為0.19，說明建立的響應面模型可靠。結合BSP 和BSP-Se 的紅外光譜分析發現BSP-Se 在764、601 cm-1處產生新的特征峰，證明硒化產物結構中含有Se-O-C 和OSe-O 基團，說明白及多糖硒化成功。清除自由基能力試驗結果表明，BSP 和BSP-Se 均具有一定的抗氧化能力，且BSP-Se 的抗氧化能力顯著高于BSP，表明硒化修飾使白及多糖與硒元素結合形成硒基團，而這些基團的存在可以激活異構碳中的氫原子，增強多糖提供氫原子的能力，使多糖清除自由基的能力增加。因此，含硒多糖可作為潛在的硒膳食補充劑、抗氧化劑或營養保健品配方的成分。

本研究初步對比了硒化前后白及多糖體外抗氧化活性的差異性，顯示硒化修飾顯著增強了白及多糖的抗氧化能力，后續研究中可對硒化前后的白及多糖進行理化性質、結構表征等研究，探索硒化后是否改變其理化性質和結構，探究其抗氧化能力的增加是否與分子量、結構以及理化性質的改變有關。為進一步研究硒多糖作為新型抗氧化劑在食藥領域、保健品領域、日化領域的應用提供一定的理論基礎。

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