外源酶在紅茶加工中的應用研究進展

楊麗娟，王偉偉，許勇泉，江和源,*

（1.中國農業科學院茶葉研究所，農業農村部特種經濟動植物生物學與遺傳育種重點實驗室，浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

茶葉是我國非常重要的農產品。近年來，我國的茶葉產量、茶園面積等產業規模穩居世界前列[1]。茶是世界上消費量僅次于水的第二大飲料[2]。根據加工工藝不同，可以將茶葉分為綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶和黑茶六大類。紅茶是世界上消費量最大的茶類，具有紅湯紅葉、香味甜醇等品質特征，受到眾人喜愛，其中夏秋紅茶產量已被認為茶生產高峰[3]，根據茶樹一年可以萌發多輪新梢的生長規律，夏秋茶產量占全年總產量的60%以上[4]。根據加工工藝的不同，可將紅茶分為條形茶和紅碎茶，其中條形紅茶又可分為工夫紅茶和小種紅茶。紅茶加工工序主要為萎凋、揉捻、發酵和干燥，如圖1 所示。

酶具有專一性、催化高效性、作用條件溫和、活性可調節等良好的功能特性，作為生態友好的生物催化劑受到了全世界的關注，利用外源酶來提升紅茶品質已經成為紅茶研究的熱點。有研究人員發現，在萎凋、揉捻、發酵三個步驟中分別添加相應的外源酶，對紅茶加工工藝及品質都有明顯影響，甚至可以節省時間成本，趨勢向好。中國是世界茶葉的主要生產國，春季綠茶和夏秋紅茶成為了采茶葉生產的高峰。夏秋兩季的茶，由于環境因素、茶樹體內代謝水平的變化等，造成了夏秋茶多酚類物質含量較高，氨基酸、芳香物質等含量偏低，從而導致夏茶品質遠不及春茶[5-6]?，F有部分研究報道表明，添加外源酶能夠改善夏秋季紅茶或深加工產品的品質[7]。在制備紅茶濃縮液時，加入單寧酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶制得的成品滋味豐富，增加甜感，并且能夠提升回甘[8]。利用木瓜蛋白酶、單寧酶和谷氨酰胺酶改良過的抹茶，其風味物質得到很大的改善，抹茶茶湯清澈均勻穩定，色澤翠綠，醇厚甘爽，茶氨酸質量濃度達到2.135 g/L[9]。多酚氧化酶催化兒茶素合成四種茶黃素的合成率可以達到30.66%[10]。纖維素酶、果膠酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶復合處理陳年武夷巖茶增香效果最好，其香氣總量為6455.96 μg/L，是對照組的2.14 倍[11]?；诖?，文章綜述了紅茶加工中常應用的外源酶種類及其作用原理，紅茶加工中主要外源酶的作用機制以及外源酶在紅茶加工及其深加工中的應用效果，為今后如何高效、快捷地應用外源酶來改善夏秋紅茶品質提供理論借鑒，促進夏秋茶資源得到充分利用，提高其附加值，進一步提高茶葉生產效益。

1 紅茶加工中常用外源酶類介紹

在當前生物技術時代，酶作為一種天然、綠色、高效的生物催化劑在食品工業領域具有廣闊的應用前景。不同的外源酶在紅茶加工中的作用效果不同，本文主要介紹紅茶加工中常用的外源酶：水解酶類和氧化酶類。水解酶類主要有單寧酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶；氧化酶類主要有多酚氧化酶、漆酶、過氧化物酶。纖維素酶和果膠酶具有消化細胞壁、提高茶葉可溶性糖和水浸出物含量等作用，木瓜蛋白酶可以提高茶葉中游離氨基酸含量，單寧酶對降低茶湯的苦澀味具有很好的效果，多酚氧化酶促進紅茶色素的形成，這些外源酶應用于紅茶加工中發揮各自的功能特性，使紅茶品質得到進一步提升。

1.1 水解酶類及其作用原理

水解酶是催化水解反應的一類酶，它們是一類特殊的轉移酶，以水作為被轉移基團的受體。單寧酶又稱鞣酸酶，是一種單寧?；饷?，在食品單寧轉化過程中起著至關重要的作用，目前已經成為最常用的生物催化劑之一[12]。它已經在許多真菌菌株中鑒定出來，并且表現出較高的單寧耐受性[13]。單寧酶常應用在食品加工中，如去除速溶茶中的單寧[14]和澄清蘋果汁[15]，以減少其苦澀味和飲料渾濁現象。蛋白酶是一種蛋白水解酶，可分解蛋白質，釋放出較多的小肽分子或游離氨基酸。在食品工業中，蛋白酶通常用于肉類嫩化、蛋白質水解物的生產，以及果汁和啤酒的澄清[16]。果膠酶是指催化植物細胞中果膠聚合物降解的酶，在全球食品和飲料酶市場中占有25%的份額，也是最早被開發且應用廣泛的商品酶[17-18]。目前，果膠酶常應用于食品工業和化學工業中，在不同種類的發酵工藝技術上，主要用來提取、澄清和浸漬。例如植物纖維的漚解和脫膠、茶和咖啡的發酵、榨油、果汁和葡萄酒的澄清等[19]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是一種復合酶。據報道，纖維素酶在高溫下比其他植物細胞壁降解酶更穩定[20]。除了上述水解酶之外，越來越多的天然水解酶資源，也作為新起之秀應用于紅茶的生產加工中，如糖苷酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶，它們發揮其自有的特性，從滋味、顏色、香氣、時間等各個維度進一步改善紅茶品質。

1.2 氧化酶類及其作用原理

氧化酶是作用于不同底物的一類酶，可以將氧還原成過氧化氫。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是紅茶生產中的關鍵酶，催化多酚氧化形成茶色素，即茶黃素、茶紅素和茶褐素[21]。根據其底物特異性和結構的不同，多酚氧化酶分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶[22]。在一些果蔬中，該酶可能會引起一些不良變化，如顏色褐變，然而在紅茶發酵中添加外源多酚氧化酶則是有益于茶葉色澤的生成。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能催化多種芳香族和非芳香族化合物的轉化，同時將分子氧還原為水，這一特性使漆酶成為綠色催化劑[23]。近年來，漆酶常用于果汁澄清、啤酒加工穩定性和食品感官品質的改善，它可以使油脫氧，去除可可和橄欖的苦味以及其他令人不快的味道，改善食品色澤[24]。研究發現，漆酶能有效地將茶葉中的茶多酚轉化為茶色素，使茶黃素、茶紅素和茶褐素含量均有明顯提高，并且在適宜條件下，利用漆酶的氧化作用可有效提高紅茶茶湯的品質[25]。過氧化物酶是在過氧化氫存在下催化基質氧化的一種酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，它與多酚氧化酶一樣，參與紅茶發酵過程中色素的形成[26]。紅茶發酵過程中，因有機酸的增加，導致多酚氧化酶逐漸失去活性，而后過氧化物酶逐漸位于主導地位。向綠茶茶湯中加入含有多酚氧化酶和過氧化物酶的果蔬果漿，再進行有氧攪拌發酵，經過一系列加工可得高茶黃素紅茶飲料[27]?？梢?，氧化酶類是紅茶加工中重要的一員，它與紅茶加工過程中茶色素的形成緊密相關，不僅能催化發酵液色澤的形成，增加紅茶中茶黃素的含量，還能有效改善茶湯品質。

2 紅茶加工中主要外源酶的作用機制

2.1 單寧酶

酯型兒茶素是茶葉苦澀味特性的主要原因，單寧酶在茶葉中主要用于水解沒食子單寧中的酯鍵、縮酚鍵，使具有苦澀味的酯型兒茶素被水解成非酯型兒茶素，促進沒食子酸以及葡萄糖釋放，使茶湯、茶飲料的營養物質在不被破壞的前提下，減輕其苦澀味，提高澄清度，并且在一定程度上增加營養物質的溶出，降低酯型兒茶素與非酯型兒茶素的比值，提升產品品質[28-31]，如圖2 所示。單寧酶可以增加茶湯的抗氧化能力[32]，其應用于茶飲料中還具有提高茶葉提取率和水溶性，防止茶湯冷后渾等作用[33-34]。

圖2 單寧酶在茶飲料中的主要作用Fig.2 Main functions of tannase in tea drinks

2.2 多酚氧化酶

紅茶湯色紅亮、香氣甜香、滋味甜醇是其特有的品質[35-37]。多酚氧化酶能使茶葉多酚類中的沒食子兒茶素及沒食子酸酯先氧化為鄰醌，再逐步氧化縮合經過一系列反應生成茶黃素和茶紅素[38-39]，如圖3 所示。添加外源多酚氧化酶所制的紅茶湯色紅艷明亮，葉底紅亮，滋味醇厚爽口，香氣甜香持久[41-42]。據報道，水果中的多酚氧化酶對改善夏秋紅茶感官品質具有不錯的效果[43]，常用于紅茶的加工和深加工中。如蘋果、梨、香蕉中所含有的多酚氧化酶不僅可以降低夏秋紅茶的苦澀味，還能賦予茶葉果香[44-45]。

圖3 茶黃素類的形成途徑[40]Fig.3 Formation pathway of theaflavins[40]

2.3 纖維素酶

纖維素是一種相當穩定的大分子多糖，難以降解[46]。纖維素酶可以轉化不溶性纖維素成葡萄糖，以及在果蔬汁中破壞細胞壁從而提高果汁得率。纖維素酶應用于紅茶發酵過程中，可以提高茶黃素和茶紅素含量[47]。研究發現，在紅茶萎凋、揉捻和發酵過程中添加一定量的果膠酶和纖維素酶，前者有助于破壞茶葉細胞壁中存在的果膠，后者能水解細胞壁中的纖維素，更利于其浸提茶葉中有效成分和水浸出物的含量及芳香性物質的釋放，還可以縮短發酵時間[48]。如圖4 所示，果膠酶、纖維素酶等酶促降解植物細胞壁，促使生物活性物質釋放。

圖4 植物細胞壁的酶降解和生物活性物質的釋放[49]Fig.4 Enzymatic degradation of plant cell wall and release of bioactive substances[49]

2.4 其他酶

β-葡萄糖苷酶是糖苷酶之一，通過水解糖苷化合物來增強紅茶的香氣，如芳樟醇、香葉醇和水楊酸甲酯等揮發性化合物，這些化合物具有果味花香，對紅茶具有一定的增香能力[50-51]。在紅茶加工揉捻過程中添加堿性蛋白酶，一定條件下，可以促進茶葉中的蛋白質水解，從而使茶湯中的游離氨基酸含量有所增加，提高茶湯營養價值[52]，同時釋放了多酚-蛋白復合物中的多酚類物質，增加紅茶中多酚類物質的含量[1]。α-淀粉酶能將茶湯中淀粉物質切斷成長短不一的短鏈糊精和少量的低分子糖類，從而使淀粉糊的黏度迅速下降，紅茶湯中添加木瓜蛋白酶和α-淀粉酶均能起到提高茶湯透光率和澄清茶湯的作用，且兩種酶效果相當[53]。在紅茶生產過程中，脂肪酶可以催化許多酯類化合物的水解，同時產生揮發性物質，使紅茶具有特定的風味特性，從而突出了脂肪酶在風味改善中的重要性[54]。

3 外源酶在紅茶加工過程中的應用研究

3.1 萎凋

萎凋是紅茶加工的第一道工序，該階段會發生一系列的物理變化過程，如葉片水分蒸發和萎縮、細胞汁濃度提高、葉綠素部分被破壞、一些水解酶、氧化酶活性增強等?，F有學者嘗試新的萎凋工藝去提高紅茶品質，例如采用紅光萎凋、添加外源酶等[55]。羅晶晶等[56]研究在萎凋過程中添加不同濃度的木聚糖酶、纖維素酶及木瓜蛋白酶，結果表明，添加350 U/mL 的木聚糖酶能明顯提高萎凋后茶葉的氨基酸含量，而同樣濃度的木瓜蛋白酶反而降低了氨基酸的含量。馮花等[7]研究了添加外源酶對夏季紅茶品質的影響，萎凋中添加木瓜蛋白酶、纖維素酶和單寧酶，均顯著降低了氨基酸含量、提高了水浸出物總量與酚氨比?？梢?，木瓜蛋白酶對紅茶氨基酸含量的作用不明顯，反而使其含量有所降低。紅茶萎凋工序中外源酶對茶葉氨基酸總量的影響上存在一定差異，分析認為可能與研究本身采取的紅茶新工藝有關，因萎凋前期采取了搖青處理適度破壞了葉細胞結構，導致外源酶的作用效果發生變化。因此，在傳統的紅茶萎凋過程中可以嘗試選擇噴灑一定量的木聚糖酶來提高茶氨酸的含量，或者纖維素酶去水解茶葉細胞壁中的纖維素并提高茶葉中可溶性成分的含量。

3.2 揉捻

揉捻是借助外力使萎凋后的茶葉迅速卷曲成條，是塑造紅茶外形的重要工序，在揉捻過程中，茶葉細胞組織破損，茶汁適度流出，使葉片中的多酚類化合物、蛋白質、氨基酸等物質附著于茶葉表面，這些物質與多酚氧化酶、氧氣等充分接觸，進行酶促氧化。林劍峰等[1]在揉捻工序中加入木瓜蛋白酶、纖維素酶和單寧酶，研究三種外源酶單獨或混合使用對紅茶主要成分的影響，認為木瓜蛋白酶能提高紅茶內含成分含量，是較優的外源酶選擇。Chiang 等[57]研究發現紅茶在揉捻1 min 后噴灑纖維素酶溶液（30 U/mL）和發酵開始0 min 噴灑多酚氧化酶溶液（5.0 U/mL）和過氧化物酶溶液（5.45 U/mL）制得的紅茶品質較好?？梢?，在紅茶揉捻過程中，纖維素酶的添加有利于促進茶葉內含物質的溶出，多酚氧化酶和過氧化物酶添加到發酵過程較為合適，所以在選擇外源酶應用于紅茶揉捻工序時，需要考慮酶的濃度和添加的種類。

3.3 發酵

發酵是紅茶加工的關鍵工序，在茶葉發酵過程中添加外源酶能夠提升茶葉品質，改善茶葉的發酵效果[58]。葉飛等[59]利用豐水梨多酚氧化酶改善夏秋紅茶品質的試驗中發現，茶湯的苦澀味減少，甜醇類物質增加，同時香氣、湯色和滋味等感官品質得分都有明顯的提高，并且茶葉的原有風味也得到了保留。紅茶經過金水1 號砂梨品種的多酚氧化酶處理后也有類似的效果[60]。林世鋒等[61]在葛葉紅茶發酵工序中采用了葡萄糖苷酶酶促發酵，不但去除了葛葉的澀味，增添了獨特的香甜味，而且轉化形成新產物，使其具有良好的營養保健功能。仝佳音等[62]通過在發酵過程中添加不同濃度的多酚氧化酶和纖維素酶，結果發現，添加多酚氧化酶和纖維素酶的茶樣氨基酸、茶多酚、茶黃素等的含量都有不同程度的提高?？梢?，在發酵過程添加葡萄糖苷酶會增強茶葉香氣，而添加豐水梨多酚氧化酶不僅可以改善成品茶的滋味品質，增強香氣，還不會破壞茶葉原有風味，且使其綜合感官品質得以提高。

4 外源酶在紅茶深加工中的應用

4.1 茶黃素提取制備

茶黃素組分（Theaflavins，TFs）是紅茶中的主要功能成分和品質組分，在紅茶中的含量僅在1%左右，但卻是衡量紅茶品質重要的化學成分，且具有很強的天然抗氧化作用和多種藥理功能[63]。紅茶中茶黃素含量低，直接提取較為困難，通過添加外源酶酶促合成茶黃素成為了工業化生產的關鍵途徑。據報道，多酚氧化酶可以將黃烷醇氧化成茶黃素和茶紅素[64]。前人研究發現，多酚氧化酶同工酶譜帶多，酶活性就大，合成茶黃素的能力強，而豐水梨果實中的多酚氧化酶同工酶譜帶比貢梨、雪梨、香梨、水晶梨多，因此，紅茶加工中也常常選擇水果中合成能力相對較強的豐水梨多酚氧化酶來提高茶黃素含量[65]。徐洪梅[66]利用豐水梨多酚氧化酶與紅茶原液進行反應，結果發現茶黃素含量提高了17%左右。Xia 等[67]利用單寧酶進行酶水解市售茶黃素提取物后，TF 的含量增加了約3 倍?？梢?，與豐水梨多酚氧化酶相比，單寧酶主要提高TF 含量來提升茶黃素的總量，且效果更佳。其他果蔬中的多酚氧化酶應用于茶黃素的提取也有不錯的效果，如馬鈴薯[68]、山藥[10]等多酚氧化酶。研究發現，蘑菇中的酪氨酸酶比漆酶、膽紅素氧化酶和粗茶多酚氧化酶能更有效地產生茶黃素[69]。Li 等[70]以茶多酚為反應底物，利用馬鈴薯多酚氧化酶合成茶黃素類產量為651.75 μg/mL。酶對茶黃素的形成至關重要，茶黃素含量的提高與底物兒茶素有著密切的關系，多酚氧化酶促進兒茶素的消耗，同時合成茶黃素。不同酶源、外源添加兒茶素和不同比例的關鍵兒茶素對茶黃素的形成都有影響[1]。酶促氧化成為現研究階段常使用制備茶黃素的方法之一，可通過調控底物兒茶素及其比例使外源酶發揮合成茶黃素的最佳效果，并為茶黃素合成技術的改進提供新的見解。

4.2 紅茶飲料加工

4.2.1 速溶茶系列固體飲料 速溶茶是一種以傳統茶葉為原料，經提取、澄清、濃縮、轉溶、干燥等工藝加工而成的茶制品，具有快捷、方便等優點。速溶茶粉是重要的茶葉深加工產品，但是速溶茶的澄清度、

滋味品質等是速溶茶發展的一項阻礙因素，因此出現很多速溶茶提取技術，其中酶技術可以改善速溶茶的感官品質和穩定性[38]，是改良速溶茶粉及其加工產品風味的重要途徑。有研究表明，一種生產冷水可溶性茶濃縮物或茶粉末的工藝，通過單寧酶處理紅茶提取物，使茶的澀味和顏色得到改善，而且沒有渾濁[71]。在速溶茶生產中添加單寧酶或木瓜蛋白酶，從而減少紅茶提取物或速溶茶生產中茶乳酪的形成，并降低速溶茶中的苦澀口感，使得速溶茶品質更加趨于穩定[72]。綠茶提取液經過多酚氧化酶處理也可以加工成速溶紅茶，能夠有效地提高茶黃素的含量和改善速溶紅茶的感官品質[73]，而過氧化物酶與多酚氧化酶協同作用比單一酶的效果好，且使茶湯色澤更加紅亮[74]。最新研究發現，液態發酵中酶和底物之間的反應更能有效地增加速溶紅茶的抗氧化作用，酶法發酵與酶輔助萃取相結合的方法，可以制備感官品質優良、茶黃素含量高的速溶紅茶，內源性和外源性酶共處理對速溶紅茶的香氣和化學物質轉化起到協同作用[75]。添加外源酶可有效減輕紅茶提取物的苦澀味，提高茶湯中茶黃素的含量，改善茶湯色澤、香氣，提升速溶紅茶的感官品質，而外源酶之間協同作用，內源酶與外源酶相互調控以及液態發酵與酶法結合等方式可以制備高質量速溶紅茶，這為未來選擇合適的技術措施生產速溶紅茶提供了新的線索。

4.2.2 灌裝液態茶飲料 茶飲料是以茶葉的水提取液或者濃縮液、速溶茶等為主要原料，通過加入水、食用香精、果汁、乳制品等經加工制成的液體飲料，是一種開瓶即飲的方便型茶葉深加工制品。目前茶濃縮液的得率、風味及穩定性一直是茶飲料向高品質純茶飲料升級的難題。研究表明，單寧酶常用來澄清紅茶飲料的初始茶湯，可以降低綠茶和紅茶茶湯的濁度，同時還可提高茶湯亮度保持茶湯色澤穩定性，增加茶湯抗氧化能力，改善傳統的加工工藝，為其在茶飲料行業中的應用提供基礎[76-77]。楊軍[78]篩選出復合破壁酶、蛋白酶、單寧酶等三種酶，可以提高茶葉浸提得率，減緩茶乳酪沉淀的問題，在一定程度上還起到增香的作用。即飲紅茶是新型的飲茶方式，需要經過一個長時間的制作過程，Faustina 等[79]利用外源酪氨酸酶和β-葡萄糖苷酶直接在工廠生產即飲紅茶，縮短生產時間的同時也改善了紅茶的沖泡色澤、增加令人愉悅的香氣。廖凱[80]結合單寧酶、β-葡萄糖苷酶和超聲的技術處理紅茶飲料，所獲的紅茶飲料香氣純正，風味適中，穩定性較好，且滋味醇和。由此可見，酶技術可有效解決速溶茶得率低、冷溶性差、渾濁等問題，但外源酶之間的復合處理與物理化學技術相結合成為攻克紅茶飲料一系列難題的新方法。

5 總結與展望

目前茶葉加工中常用的外源酶主要有單寧酶、果膠酶、纖維素酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等，研究者利用它們各自的功能特性改善茶葉品質是一種綠色科學的技術手段。酶在適宜條件下才會發揮理想作用，所以在茶葉加工過程中不僅需要考慮添加酶的種類，還需考慮溫度、濕度、添加時間以及添加量等條件。外源酶在紅茶深加工中的應用，主要用于茶黃素的提取制備、茶飲料的品質提升。盡管紅茶的制作工藝已經研究得較為系統和全面，但仍有需要解決和突破的瓶頸問題。首先，外源酶在紅茶加工中的作用機制比較復雜，如TFs 和聚酯型兒茶素類（Theasinesins，TSs）的形成途徑、茶葉內源酶與外源酶相互之間的作用機制，仍然是困擾研究人員的難題，阻礙了外源酶改善紅茶滋味品質、理化性質等方面的深入研究。其次，在紅茶制作工藝的同一工序中添加不同外源酶，可能帶來不同的作用效果，外源酶相互作用之間的機理研究是相對薄弱的。添加外源酶酶促合成茶黃素成為工業化生產的關鍵途徑，但找到優質酶源仍然是提高茶黃素含量需要深入探索的重要技術瓶頸。相信利用外源酶促進茶葉中品質與活性成分的有益轉化，改善夏秋紅茶及其深加工產品的品質，相關技術成果的應用前景將會日益廣闊。

綜上所述，外源酶在茶葉中的應用研究還存在很多的未知，隨著現代酶工程技術的不斷發展和制茶工藝技術水平的提升，未來在夏秋紅茶加工過程中添加新型果蔬多酚氧化酶提升品質、增加天然果香，以及利用酶與物理技術協同作用、酶法包埋提高茶飲料品質等都非常值得關注。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).