黃世鑫,鄭斯文,周穎鈿,王凱,趙雷,劉旭偉,胡卓炎
(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)
荔枝(Litchi chinesisSonn.)是無患子科的一種非過渡、亞熱帶和熱帶水果,我國南方及東南亞廣泛種植[1]。荔枝本身采后極其不易貯運,極易出現荔枝果皮褐變等現象,直接影響其商業價值,主要原因是采后的褐變及腐爛,這直接關系到荔枝產業的發展問題[2]。因此,采后對荔枝進行一定的處理措施以延緩褐變和保持品質是極其有必要的。
荔枝果皮褐變主要原因是酚類物質發生酶促氧化形成醌進而聚合成褐色物質,褐變與荔枝果皮中的酚類物質含量及相關代謝酶等密切相關[3]。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-lyase,PAL)為苯丙烷代謝的關鍵酶,是許多植物次生代謝產物合成途徑的第一限速酶,對合成酚類,黃酮類及花色苷類物質都起到重要作用,有研究報道PAL與荔枝果皮褐變具有顯著相關性[4]。喬沛等[5]報道,多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)和氧化物酶(Peroxidase,POD)能夠將酚類物質氧化為醌進而引起荔枝果皮褐變,是導致荔枝果皮褐變的主要相關酶。Zhang 等[6]研究報道,漆酶(Laccase,LAC)在荔枝果皮中的酶促褐變同樣扮演著重要角色,參與酚類物質的降解,調控褐變的過程。
γ- 氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)是一種非蛋白質氨基酸,植物在逆境條件下發生GABA 累積,是應對脅迫環境的代謝產物。在1998年GABA 已被美國環境保護署(EPA)登記,確認在水果上的應用對人體健康或環境無任何毒副作用,并且在2009 年GABA 被中國衛生部正式批準為新資源食品,GABA 的外源應用研究逐漸備受關注。前期研究發現,荔枝在低溫貯藏下GABA含量顯著增加并有利于果實品質的保持[7]。近年又有研究報道,外源GABA 處理可促進桃果實中內源GABA 積累,增強果實的抗逆境能力,減少病害發生[8]。此外,有研究報道GABA 和酚類物質代謝之間可能存在一定關系,GABA 處理可調控雙孢菇酚類物質代謝,維持較高水平總酚含量,延緩菇帽褐變[9]。南果梨在冷藏下會發生果皮褐變,而外源5 mmol/L GABA 處理梨果實15 min 可促進內源GABA 積累,顯著改善果皮抗氧化能力和褐變情況[10]。目前有關外源GABA 處理對荔枝果皮褐變和酚類物質變化的影響未見報道。本研究擬采用5 mmol/L 的GABA 溶液處理荔枝,對荔枝果皮的外觀顏色指標以及酚類物質相關指標進行評價,試圖探討荔枝采后逆境下對褐變相關的物質及其影響規律,揭示GABA 處理對荔枝果皮褐變及酚類物質變化的影響規律,為豐富荔枝保鮮領域的數據和研發綠色保鮮劑的提供參考依據。
荔枝鮮果,品種為‘桂味’,產地為廣東省廣州市,于2021 年6 月16 日采收,2 h 內運回實驗室進行試驗處理;GABA,上海麥克林生化技術有限公司;沒食子酸(標準品)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl,DPPH)分析純,Sigma-Aldrich 中國;蘆?。≧utin,標準品)、福林酚(分析純),上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、亞硝酸鋁、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、愈創木酚等其他試劑均為國產分析純。
Uvmini-1240 紫外可見掃描分光光度計,日本SHIMADZU 公司;NR60CP 色差儀,深圳市三恩時科技有限公司;SpectraMaxi3x 連續波長多功能微孔板檢測平臺,美國Molecular Devices 公司。
1.2.1 實驗設計
選取果實大小及顏色一致,無機械損傷,表面無病菌蟲害的果實作為試驗原料。試驗設置兩個處理組,清水對照組(CK)和GABA 處理組,每個處理組別荔枝果實5.0 kg。根據Shekari 等[9]的研究工作,經預備試驗,選擇5 mmol/L 的GABA 溶液,浸泡處理時間15 min,自然晾干后,按實驗設計隨機取樣品按20 顆/袋分裝于0.025 mm PE 保鮮袋,封口。另外,兩個處理組分別隨機取10 顆荔枝果實裝于保鮮袋中,用于拍照,以觀察貯藏過程中荔枝果皮褐變的進程。各樣品在恒溫箱內避光貯藏[ (20±1) ℃,相對濕度為85%~90% ]。在0、1、2、4、 6 d 中抽取樣品,每次取樣隨機取荔枝(20 顆)用于測定相關指標,取樣后先測定色差,褐變率和好果率,隨后將果皮用液氮研磨成粉,用于測定總酚、MDA 含量和不同酶活力等指標,實驗重復三次,取平均值。
1.2.2 測定指標
1.2.2.1 褐變指數(Browning Index,BI)和好果率(Good Fruit Rate,GFR)測定
參考Zhang 等[3]的方法,按照果皮外表面褐變面積占整個果實外表的面積的大小,把果皮褐變程度分為4 級:
無褐變或褐變面積與果實外表面積之比小于1/4 為1 級果;
褐變面積占果實外表面積的1/4~1/2 為2 級果;褐變面積占果實外表面積的1/2~3/4 為3 級果;褐變面積占果實外表面積大于3/4 或果實已經腐爛為4 級果;
式中:
B——褐變指數(BI);
F——好果率(GFR),%;
L——褐變等級;
L1——一級果數目;
n——該級果數;
N——總果數。
1.2.2.2 失重率(Weight Loss,WL)測定
采用天平分別稱量貯藏前荔枝果實的初始質量和貯藏后荔枝的質量,通過貯藏前后荔枝果實的重量變化率來計算荔枝果實失重率。
式中:
L——果實失重率(WL),%;
W0——果實初始質量,g;
W1——測定果實質量,g。
1.2.2.3 果皮色差測定
使用色差儀對每個果的赤道面取3 個三角對稱的點測定L*(明度/暗度)、a*(紅色/綠色)、b*(黃色/藍色)值。
1.2.2.4 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測定
取0.25 g 荔枝果皮粉,加入10%(m/V)三氯乙酸5 mL 均質后離心。將1 mL 上清液加入4 mL 10%(m/V)三氯乙酸 [含0.5%(m/V)硫代巴比妥酸]中?;旌先芤涸?5 ℃下加熱15 min,然后在冰浴中冷卻,離心得澄清溶液分別在450、532 和600 nm 處測量吸光度。計算如下:
式中:
D——丙二醛(MDA)含量,nmol/g。
1.2.2.5 總酚(Total Phenols)含量、DPPH 自由基清除率測定
總酚含量測定:采用福林酚法。取0.5 g 果皮加入預冷的1%(V/V)鹽酸甲醇2.5 mL,冰磨,4 ℃暗提取30 min,離心收集上清液。取0.05 mL 提取液加入0.5 mL 福林酚溶液,混勻,在室溫下靜置3~4 min,加入1.5 mL、20%(m/V)的碳酸鈉溶液,以蒸餾水定容至10 mL 后混勻,在室溫下避光靜置2 h,在765 nm 下測定其吸光值。以0.05 mL 水按同樣操作為空白,以沒食子酸標準品繪制標準曲線:
DPPH 自由基清除率測定:參考Ali 等[11]的方法,將50 μL 的果皮甲醇提取物與3 mL DPPH 溶液混合,25 ℃避光保存30 min,在517 nm 測定吸光度。
1.2.2.6 總類黃酮(Total Flavonoids)和花色苷(Total Anthocyanin)含量測定
總類黃酮含量測定:參考韓冬梅等[12]的方法稍作修改。取荔枝果皮粉0.5 g,加入5 mL 80%(V/V)冷乙醇,離心后用冷乙醇稀釋,稀釋液0.5 mL 加入0.3 mL 的5%(m/V)NaNO2,靜置5 min 后再加0.3 mL 的10%(m/V)硝酸鋁,靜置6 min,最后加2 mL 1 mol/L NaOH,定容至10 mL 測510 nm 的吸光值,以蘆丁標準品繪制標準曲線:Y=0.043 3x+0.000 8,R2=0.996 6。
花色苷含量測定:參考Zheng 等[13]的方法稍作修改。取1 g 荔枝果皮粉,加入1%(V/V)鹽酸甲醇溶液提取4 h,收集提取液,在530、620、650 nm 測定吸光值。最終換算以ΔA/g 表示花色苷含量。
1.2.2.7 PPO 和POD 活力測定
參照Tang 等[14]的方法并做修改進行酶提取液制備。取1 g 荔枝果皮粉,加入0.5 g PVP 和10 mL 0.1 mol/L pH 值為7.0 的磷酸緩沖液,4 ℃,10 000 r/min離心20 min,收集上清液,即為粗制酶液。
PPO:1 mL 0.1mol/L 鄰苯二酚、1.9 mL 緩沖液、0.1 mL 酶液,410 nm 下檢測,3 min 內的OD 值,每30 s 測一次,以吸光值增加0.001 為1 個活力單位(U)。
POD:2.4 mL 緩沖液、0.1 mL 1%(V/V)過氧化氫、0.4 mL 1%(V/V)愈創木酚、0.1 mL 酶液,470 nm 下檢測,3 min 內OD 值,每30 s 測一次,以吸光值增加0.01 為1 個活力單位(U)。
1.2.2.8 PAL 活力測定
參考Yun 等[15]的方法并稍作修改。取0.5 g荔枝果皮粉末,加入3 mL 預冷的硼酸緩沖液,10 000 r/min 冷凍離心30 min,收集上清液為酶提取液,分別取1 mL 緩沖溶液和2 mL 20 mmol/L苯丙氨酸溶液于40 ℃預熱10 min,然后樣品管加入0.5 mL 粗提物,搖勻后于40 ℃反應1 h, 加入0.1 mL 6 mol/L 鹽酸終止反應,290 nm 處檢測。以吸光值增加0.01 為1 個活力單位(U)。
1.2.2.9 LAC 活力測定
參考Fang 等[16]的方法并稍作修改。取1 g 荔枝果皮粉末,加入5 mL 預冷的磷酸緩沖溶液,搖勻,4 ℃,10 000 r/min 離心20 min,取0.1 mL 酶提取液,加入到3 mL 表兒茶素溶液中(2 mmol/L)于45 ℃下反應30 min,在380 nm 處檢測。以吸光值增加0.001 為1 個活力單位(U)。
使用Excel 2016 軟件整理試驗數據;使用IBM SPSS Statistics 26軟件檢驗試驗數據之間的顯著性和相關性分析(*為P<0.05,**為P<0.01);使用Origin 2019 處理數據并作圖;使用TBtoolsv1.09867進行相關性熱圖制作。
GABA 處理對荔枝果皮外觀及色澤的影響結果見圖1 和表1。采后果實的外觀色澤變化是直接反映果實商品價值及貯藏品質的一個重要參數,色澤、褐變指數和好果率是可以簡單且直觀地評價果實價值的指標。從圖1 可觀察到,0 d 荔枝整體外觀色澤均一,紅色飽滿鮮艷,無褐變現象。在貯藏6 d 時,與對照CK 組比較,GABA 處理的荔枝果皮維持紅色色澤,無大面積褐變。如表1 所示,隨著貯藏時間的延長L*、a*和b*值都呈下降的趨勢,在貯藏2 d 后,與CK 組相比,GABA 處理組的下降幅度更小,GABA 處理組的L*、a*、b*值均顯著高于CK 組,說明GABA 處理保持更好的色澤,這一結果與圖1 結果基本一致。
表1 GABA處理對荔枝果皮的L*、a*、b*值的影響Table 1 Effects of GABA treatment on L*, a* and b* values of litchi pericarp
圖1 GABA 處理對荔枝果皮外觀色澤的影響Fig.1 Effects of GABA treatment on appearance and color of litchi pericarp
GABA 處理對荔枝果皮的褐變指數及好果率的影響結果見圖2。隨著貯藏時間延長荔枝果皮褐變指數上升(圖2a),好果率下降(圖2b),6 d 時GABA 組褐變指數(2.80)顯著低于CK 組(3.60),GABA 組保持36.67%好果率,而CK 組好果率為0。在外源GABA 處理梨和鮮切蘋果中也觀察到類似的結果[10,17],GABA 處理的梨果皮褐變度低于對照組24%,GABA 處理的鮮切蘋果具有最高的L*值。由此可見,GABA 在延緩荔枝果皮褐變和保持貯藏品質上同樣具有積極的作用。
圖2 GABA 處理對荔枝果皮的褐變指數(a)及好果率(b)的影響Fig.2 Effect of GABA treatment on Browning index (a) and good fruit rate (b) of litchi pericarp
果實失重率與果實水分含量、營養成分等降解流失相關,失重率的變化可以反映出果實的生理代謝損耗情況,降低失重率是保持荔枝含水量及果實品質的關鍵,同時也是延緩荔枝果皮褐變的關鍵[2]。因此對荔枝失重率的監控有助于了解GABA 延緩果皮褐變的進程。如圖3 所示,隨著貯藏時間的延長,果實失重率上升,6 d 時GABA 組失重率(3.82%)顯著低于CK 組(5.76%)。這可能是外源GABA 處理能夠增強果實的抗逆境能力,保持果實中的水分含量,從而有效降低果實失重率[8,18]。在對西葫蘆研究中發現外源GABA 處理可有效減緩西葫蘆貯藏后期質量損失,幫助其長期應對冷藏環境[19]。以上結果說明,GABA 處理能夠有效維持荔枝果實質量,有利于延緩荔枝果皮褐變。
圖3 GABA 處理對荔枝果實失重率的影響Fig.3 Effect of GABA treatment on weight loss rate of litchi
MDA 是膜脂過氧化的主要產物之一,有研究報道稱荔枝果皮MDA 含量與衰老及褐變有關,抑制MDA 的積累有助于保持荔枝果實品質,減少MDA對荔枝的傷害[20]。已有研究證明,GABA 能夠抑制脂質過氧化過程中MDA 形成[21]。在外源GABA 處理黃瓜及小麥的研究中發現[22,23],經GABA 處理的黃瓜和小麥中MDA 含量比對照組低約35%。本研究測定荔枝果皮MDA 含量如圖4 所示,隨著貯藏時間的增加,荔枝果皮中MDA 不斷積累,GABA 處理顯著(P<0.01)抑制果皮MDA 的積累,在貯藏6 d后GABA 組果皮MDA 含量比CK 組低44.13%,這一結果與前人的研究結果較為一致[22,23],說明GABA在延緩荔枝果皮MDA 積累中起到重要作用。
圖4 GABA 處理對荔枝果皮中MDA 含量的影響Fig.4 Effect of GABA treatment on the content of malondialdehyde in litchi pericarp
荔枝果皮富含酚類、黃酮類及花色苷等非酶抗氧化類物質,其含量直接與荔枝果皮的抗氧化活性相關,可直接反映果皮抗逆境能力,同時作為植物次生代謝產物,這些物質又直接與果蔬的色澤、品質、抗逆性及組織褐變等密切相關[24,25]。隨著貯藏時間的延長,荔枝果皮中總酚、類黃酮含量和DPPH 自由基清除率都呈現先上升后下降的趨勢,如圖5a~d 所示。
圖5 GABA 處理對荔枝果皮中總酚(a)、黃酮(b)、花色苷(c)及DPPH(d)的影響Fig.5 Effect of GABA treatment on total phenols (a), flavonoids (b), anthocyanins (c) and DPPH (d) in litchi pericarp
在藍莓 的研究中發現GABA 處理后的果實在貯藏8 d 后,總酚含量和黃酮類物質含量分別是對照組的1.31 倍和1.18 倍[26],這一結果與本研究在荔枝中觀察到的結果相似。荔枝在貯藏前期存在一個酚類物質積累的過程(圖5a、b),CK組在2 d 時達到峰值(534.01 mg GA/g),GABA組則在4 d 時達到峰值(776.38 mg GA/g),GABA 組中類黃酮在貯藏1 d 后顯著積累至最高值(17.37 mg rutin/g)之后一直下降,在GABA 處理6 d 后,荔枝果皮總酚(525.93 mg GA/g)和類黃酮(14.06 mg rutin/g)含量分別是CK 組的4.2 倍和1.99 倍。在GABA 處理櫻桃中也觀察到相似總酚和黃酮積累的規律[27]。此外,在貯藏6 d 后觀察到總酚含量的下降,可能是貯藏后期因為細胞膜完整性破壞,酚類和黃酮類物質大量流出細胞發生酶促褐變反應,導致酚類物質大量降解[27]。如圖5c、d所示,對比CK 組,GABA 組花色苷含量在整個貯藏期一直上升,并在6 d 達到最高值(0.54 Δ A/g),GABA 處理的荔枝果皮DPPH 自由基清除率在整個貯藏期間均保持在80%以上,在2~4 d 顯著高于CK 組(P<0.01)。Aghdam 等[27]認為,GABA 處理可能通過引發苯丙氨酸途徑,增加酚類,黃酮類和花青素的積累并維持較高的DPPH 自由基清除率,從而延緩了櫻桃果實的褐變和保持了果實品質。綜上結果說明,GABA 處理促進荔枝果皮酚類、黃酮類、花色苷物質的積累,保持荔枝果皮具有較高的DPPH 自由基清除率。
如圖6a、b 所示,GABA 處理顯著延緩了荔枝PPO 和POD 酶活力的增加,在6 d 時,CK 組的PPO 和POD 酶活分別為GABA 組的1.27 倍和1.48倍。這表明,GABA 處理能有效降低荔枝PPO 和POD 酶活。類似地,有研究證實外源褪黑素通過降低荔枝果皮中PPO 和POD 酶活力,維持高水平的總酚,黃酮和花色苷含量來延緩褐變[3]。在GABA的應用中同樣也有報道,GABA 通過抑制芒果中PPO 酶活力,提高采后芒果品質[28]。
圖6 GABA 處理對荔枝果皮中PPO (a)、POD(b)、PAL(c)、LAC(d)酶活的影響Fig.6 Effect of GABA treatment on PPO (a), POD (b), PAL (c), LAC (d) enzyme activity in litchi pericarp
Aghdam 等[29]報道GABA 誘導激活PAL 酶活力,促進苯丙烷途徑合成次生代謝物質抵抗衰老及褐變。圖6c 所示,荔枝果皮中PAL 酶活力隨著貯藏時間而上升,GABA 處理組的PAL 活性在貯藏前中期(1~4 d)顯著高于CK 組,在6 d 低于CK 組。推測可能是在貯藏后期酚類等次生代謝物質含量較高反饋抑制了PAL 酶活力。結果表明GABA 處理在貯藏前期通過激活PAL 酶活力,從而增加酚類等物質的積累和DPPH 清除能力[27](見圖5)。
研究報道LAC 參與荔枝果皮花色苷降解,促進褐變物質積累,加速荔枝褐變,抑制LAC 酶活性可以有效防止荔枝果皮失紅[14]。如圖6d 所示,CK組的LAC 酶活力在整個貯藏期間一直上升并在6 d達到GABA 組的2.54 倍,而經GABA 處理后的荔枝果皮中觀察到LAC 酶活力在貯藏期間被顯著抑制,LAC 酶活力較為穩定,未發生明顯的上升或下降。這一結果與Fang 等[16]的研究結果相似,LAC酶的激活是引起荔枝果皮褐變的主要原因,通過抑制LAC 酶活力可有效防止褐變發生。因此可以推測,GABA 在荔枝果皮的花色苷代謝上可能起到重要作用,通過抑制LAC 酶活進而影響花色苷代謝可能是延緩荔枝果皮褐變的途徑。
為了建立GABA 處理后荔枝果皮酚類物質變化與褐變性狀之間的關系,進行了相關性分析。如圖7a 所示,果皮褐變指數(BI)與失重率(WL)呈現正相關,而好果率(GFR)和顏色值L*、a*、b*呈現負相關,以此將荔枝的正相關生理指標分為褐變(Browning),負相關生理指標分為抗褐變(Anti-browning)指標。比較CK 組中的實驗數據,對酚類物質相關指標(PAL、LAC、POD、MDA、PPO、Total Phenols、Total Flavonoids、Total Anthocyanin、DPPH)與Browning 及Anti-browning進行相關性分析,可將酚類物質代謝相關指標分為三個聚類(圖7b 中的1、2、3)。
圖7 GABA 處理后荔枝果皮褐變和酚類物質相關性質的相關性分析Fig.7 Correlation analysis betweenlitchi peel browning and traits related to phenolic after GABA treatment
CK 組中,圖7b 聚類1 與Browning 呈正相關,與Anti-browning 呈負相關,這一結果與Sun 等[4]對荔枝果實發育過程中果皮褐變的研究結果一致。隨著貯藏時間延長,MDA 積累,激活PPO、POD、PAL 及LAC 酶活,促進酶促褐變的發生。GABA處理后減弱了聚類1 與Browning 及Anti-browning的相關性,說明GABA 處理通過聚類1 指標延緩褐變可能是起到一個作用。圖7b 聚類2 和3 所示,CK 組與Browning 呈現顯著負相關,與Antibrowning 顯著正相關,GABA 處理后,聚類2 無顯著相關性,聚類3 結果則與CK 組相反,說明GABA 處理顯著影響了聚類2 和3,總酚,黃酮,花色苷含量及DPPH 清除率在延緩褐變的過程中可能是起到關鍵作用。
綜上,GABA 處理通過顯著誘導總酚、黃酮、花色苷合成,抑制酶促褐變反應,減少MDA 物質積累,保留較高的酚類物質水平和DPPH 自由基清除率,從而實現延緩果皮褐變。
研究結果發現外源GABA 處理可以維持荔枝貯藏質量和果實色澤,抑制荔枝果皮中MDA 含量的積累,并且通過激活PAL 酶活力,抑制PPO,POD和LAC 酶活力,減少過氧化反應的發生,貯藏6 d時GABA 處理的荔枝果皮具有較高的總酚、黃酮和花色苷物質積累,DPPH 自由基清除能力提高。LAC 酶及花色苷的代謝可能起到關鍵作用。對于GABA 延緩荔枝果皮褐變的生理生化機制、GABA對漆酶和花色苷代謝的具體作用機制以及不同GABA 濃度和處理時間等因素對荔枝果皮褐變的影響,還有待進一步探討。