外源 GABA 聯合超聲處理發芽綠豆淀粉的結構特性及血糖指標變化

路樂樂，劉瑩，徐海軍，李曉強，隋春光，李曉紅，王立東,4*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

（2.內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010000）

（3.黑龍江農業經濟職業學院食品藥品工程系，黑龍江牡丹江 157041）

（4.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江省普通高等學校谷物副產物綜合利用重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

綠豆又名青小豆、植豆，是一類傳統粗糧作物，在我國已有兩千多年栽培歷史[1]。綠豆用途十分廣泛，具有清熱消暑[2]、降脂解毒[3]作用。綠豆中含有25%～28%蛋白質、50%～60%淀粉，以及多酚、黃酮、維生素等眾多營養成分，因此綠豆具有極高營養價值[4]。隨著人們飲食逐漸精細化，亞健康人群比例逐年上升，健康飲食成為人們新的訴求。傳統綠豆制品淀粉含量較高，易造成餐后血糖水平和胰島素濃度大幅波動。為尋求GI 值降低的綠豆淀粉制品，選擇合適的加工處理工藝就顯得尤為重要。

發芽處理是一種操作簡單，成本低廉的加工方式。有研究表明，適當發芽處理可提高玉米中抗性淀粉含量[5]，而抗性淀粉含量較高的食品可以顯著抑制餐后血糖升高，為低GI 食品的開發提供理論依據。GABA 是一種非蛋白質氨基酸，廣泛存在于植物和動物體中，它在植物生長中具有激活信號、調節蛋白質降解、促進植物激素合成等作用[6]。超聲處理可以提高種子發芽率，促進活性化合物的積累[7]。研究發現，低強度超聲的空化效應可以提高細胞壁和細胞膜的穿透性，增強種子水合作用和酶活性，加快細胞內外物質交換及代謝速率[8]。超聲預處理的空化作用在種子細胞壁上產生的微小孔隙可以促進GABA 從外部向種子內部的轉移，進而參與綠豆種子的代謝，提高淀粉酶和多酚合成酶的活性。

因為外源GABA 浸泡處理可以激活水解酶活性，超聲處理有利于提高細胞壁和細胞膜的通透性，所以本實驗旨在研究外源GABA 聯合超聲處理對發芽0～96 h 綠豆淀粉結構特性和血糖指標的影響，以期獲得GI 值低、感官性能良好的綠豆淀粉產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆種子購買于北大荒糧食集團有限公司（中國大慶）；次氯酸鈉、GABA、氫氧化鈉、乙酸鈉、無水乙醇、無水葡萄糖和3,5-二硝基水楊酸購買于上海麥克林生化科技股份有限公司（中國上海）；豬胰腺α-淀粉酶、糖化酶購買于上海源葉生物科技有限公司（中國上海）。

1.2 儀器與設備

KH-500GDV 超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-4 型電熱恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市宏華儀器廠；DHG-101-0A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海尚儀生物技術有限公司；CHA-2A 氣浴震蕩器，常州申光儀器有限公司；ZXMP-R1230 恒溫恒濕培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；S-3400N 掃描電子顯微鏡，日本HITACHI 公司；BrukerD8 X-射線衍射儀，德國ADVANCE 公司；Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 綠豆發芽處理

選取大小均勻、無損傷的完整綠豆。將綠豆種子在質量分數0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，用蒸餾水沖洗后瀝干水分。將處理過的綠豆種子放入250 mL 燒杯中，按豆液比1:3 加入10 mmol/L GABA溶液，樣品置于超聲清洗器中處理40 min 后再30 ℃恒溫處理8 h。將浸泡好的綠豆放入發芽盤中，發芽盤底部放置10 mmol/L 的GABA 溶液500 mL，然后將樣品置于30 ℃濕度75%的培養箱中，孵育12、24、48、72、96 h，每12 h 換一次GABA 培養液。取樣后用蒸餾水沖洗去除黏液，45 ℃熱風烘干保持恒重。將樣品壓碎并保存在4 ℃的冰箱中。未處理的樣品標記為M，而發芽0、12、24、48、72和96 h 的樣品分別標記為M0、M12、M24、M48、M72 和M96。

1.3.2 淀粉提取

精確稱取100.0 g 綠豆芽粉，過用80 目篩，將樣品置于2 000 mL 燒杯中，加入1 500 mL 質量分數0.4% NaOH 溶液并充分混合。然后將樣品置于35℃氣浴振蕩器中，170 r/min 搖2 h，后靜置1 h，調節pH 值為7.0，去除上清液，沉淀物用蒸餾水反復洗滌、離心，并用80 目尼龍紗布過濾，得到純凈淀粉。淀粉在40 ℃下干燥24 h，研磨后過90 目篩得到發芽綠豆淀粉[9]。

1.3.3 淀粉含量

淀粉含量采用GB 5009.9-2016[10]酸水解法測定。

1.3.4 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量采用高菲等[11]的雙波長法測定淀粉樣品中的直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。

1.3.5 掃描電鏡分析

將少量綠豆淀粉樣品用導電雙面膠固定到金屬樣品臺上，在真空條件下進行噴金處理，置于掃描電子顯微鏡下觀察，加速電壓為5 kV，放大3 000倍觀察樣品形狀和表面特征[12]。

1.3.6 X-射線衍射分析

采用X 射線衍射儀（XRD），通過步進掃描法檢測淀粉，檢測條件：特征射線Cu 靶，管壓為40 kV，電流為40 mA，測量角度2θ區間為4～60°，步長為0.02°，掃描速度為2°/min。使用MDI Jade 軟件分析計算淀粉結晶度，結果取3 次擬合平均值[13]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

稱取被測樣品3.0 mg，與300.0 mg KBr 粉末研磨至混勻，經壓片處理后通過紅外光譜分析儀進行全波段掃描測試，波長范圍為400～4 000 cm-1，分辨頻率為4 cm-1，掃描次數為64 次[14]。

1.3.8 凝沉性測定

制備不同發芽時間質量分數1%的淀粉糊50 mL，取7 支10 mL 塑料離心管，向每支離心管中分別移取10 mL 糊液，在25 ℃下靜置24 h 后，再以轉速4 000 r/min 離心5 min，記錄離心管中沉降物占比[15]。

1.3.9 估計血糖生成指數的測定

淀粉用豬胰腺α-淀粉酶和糖化酶進行模擬消化。將600 mg（精確到0.001 g）淀粉準確稱量到30 mL 醋酸鈉緩沖液（pH 值 5.2）中。將樣品混合并在95 ℃下糊化15 min，糊化后樣品在37 ℃恒溫平衡1 h。加入5 mL 豬胰腺α-淀粉酶（100 U/mL）和糖化酶（40 U/mL）混合物。在37 ℃氣浴中搖動樣品（170 r/min），并在10、20、40、60、90、120 和180 min 時取樣。加入無水乙醇終止消化，以4 000 r/min 離心5 min[16]。

準確稱取100.0 mg 葡萄糖，溶于少量蒸餾水中，并定容于100 mL 容量瓶中，分別移取0.0、 0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 mL 葡萄糖標準溶液于25 mL 容量瓶中，加入蒸餾水定容至2 mL，然后加入1.5 mL DNS 試劑并搖勻，在沸水中加熱5 min，迅速冷卻定容至25 mL，混勻后于540 nm 波長處測定吸光度[16]。標準曲線為：y=12.036x+0.022 4（R2=0.994 8）。

以淀粉水解率（HRS）為縱坐標，以時間為橫坐標繪制水解曲線。通過計算0～180 min 淀粉（AUCsample）水解曲線下面積和參考食物（白面包，AUCreference）來確定樣品淀粉水解指數（HI）。樣品估計血糖指數（eGI）按照以下公式計算[16]。

式中：

A——抗性淀粉含量（RS），%；

G120——消化120 min 時釋放的葡萄糖含量，mg；

B——消化20 min 時釋放的葡萄糖含量，mg；

C——淀粉的質量，mg；

D——淀粉的水解速率（HRS），%；

m1——在采樣點消化的葡萄糖當量，mg；

E——樣品淀粉水解指數（HI）；

Ssample——0～180 min 淀粉（AUCsample）水解曲線下面積；

Sreference——參考食物（白面包，AUCreference）水解曲線下面積；

I——血糖指數（eGI）。

1.3.10 數據分析

每組實驗均做三次平行試驗，采用SPSS 26 進行統計分析，Origin 2021 繪圖，數據結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 淀粉含量及組成

GABA 聯合超聲處理12～96 h 綠豆的淀粉含量、直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉含量如圖1 所示。淀粉在綠豆種子中的占比較高，采用發芽處理降低淀粉含量，改善淀粉消化吸收速率，這對研究低GI綠豆食品有著重要的意義。Oliveira 等[17]研究表明，發芽可改善稻米消化率，提高生物活性。Chinma等[18]研究表明，種子萌發在分子水平上顯著改變了淀粉的結構，影響了淀粉的功能。根據圖1 可知，發芽綠豆中淀粉含量顯著降低，綠豆中淀粉含量最初為52.13%，隨著發芽時間的延長，在發芽24 h降低至43.54%，在96 h 時降至最低為21.18%。這種減少是由于超聲處理后種皮的滲透性增強所致，因為超聲處理可以改變細胞壁結構，提高內源酶活性，內源酶通過細胞壁釋放，從而提高淀粉酶水解效率[19]。

圖1 發芽綠豆中淀粉的含量和組成Fig.1 The content and composition of starch in mung bean sprouts

研究表明，直鏈淀粉與支鏈淀粉比值的變化是延緩淀粉消化的有效方法[17]。綠豆發芽過程顯著提高了直鏈淀粉的占比，在發芽12 h 達到峰值。這可能是水解酶優先裂解支鏈淀粉形成直鏈淀粉的結果[20]，而超聲處理又增強了淀粉酶活性，加速了支鏈淀粉的水解，導致直鏈淀粉和抗性淀粉的比例增加。發芽后，抗性淀粉含量在萌發過程中呈上升趨勢，這可能是由于淀粉水解酶將淀粉分解成糊精和葡萄糖[18]的原因。而抗性淀粉不易被淀粉酶水解，導致了12 h 時抗性淀粉含量最高。隨著發芽時間的增加，芽的生長需要淀粉水解提供能量，部分抗性淀粉開始水解，導致種子萌發后期抗性淀粉含量降低。

2.2 掃描電鏡分析

天然綠豆淀粉和不同萌發時間綠豆淀粉的掃描電鏡如圖2 所示。在3 000 倍顯微鏡下觀察淀粉顆粒主要呈橢圓形，形貌無顯著性差異，部分顆粒不規則，呈腎形或心形。淀粉顆粒沒有出現裂縫或孔洞，因此，延長發芽時間并沒有導致綠豆淀粉顆粒的大量斷裂。發芽后，部分淀粉顆粒變粗，有微蝕坑，但大部分完好無損，這可能是由于超聲空化效應和淀粉酶、脫支酶活化水解淀粉造成的表面損傷[21]。淀粉顆粒表面的破壞歸因于發芽過程中淀粉的使用量增加[18]，水解酶在萌發過程中被激活，部分淀粉水解，使淀粉顆粒表面產生凹陷，這與王倩[5]的研究結果一致。籽粒中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例可能是種子萌發過程中淀粉顆粒形態變化的主要原因，而直鏈淀粉水平較低的淀粉更容易受到酶的攻擊，并產生更多的凹坑[22]。

圖2 不同發芽時間綠豆淀粉的掃描電鏡照片(×3 000)Fig.2 SEM pictures of mung bean starch at different germination times (×3 000)

2.3 X-射線衍射分析

天然綠豆淀粉和不同萌發時間綠豆淀粉的XRD譜圖如圖3 所示。不同發芽時間的樣品分別在15°、17°、18°、20°和23°處出現明顯較強衍射峰，為典型的A 型結構。不同發芽時間的綠豆淀粉其特征衍射峰無明顯變化，這表明發芽時間的長短對淀粉的結晶區沒有造成明顯的影響，即發芽處理并未改變綠豆淀粉的結晶類型，這與Liu 等[23]的研究結果一致。雖然發芽綠豆淀粉的特征衍射峰無明顯變化，但其特征衍射峰的強度卻有所減弱，這意味著發芽后淀粉結晶性下降。

圖3 不同發芽時間綠豆淀粉的XRD 譜圖Fig.3 XRD spectrum of mung bean starch with different germination time

天然綠豆淀粉和不同萌發時間綠豆淀粉的相對結晶度如表1 所示。未處理綠豆淀粉的相對結晶度為39.64%，經過發芽處理后，綠豆淀粉的相對結晶度明顯降低。綠豆淀粉經過GABA 浸泡聯合超聲處理后相較于未處理綠豆淀粉結晶度下降，這是由于超聲處理的空化作用可以使種皮的滲透性增強，同時GABA 浸泡處理激活內源酶的活性，導致結晶度下降[19]。在萌發過程中，淀粉被水解提供能量，而淀粉的非結晶區先被水解，然后結晶區域再被水解[24]。綠豆淀粉萌發48 h 內，綠豆淀粉的非結晶區首先被水解，使相對結晶度有所增加，而萌發時間超過48 h 之后，綠豆淀粉的結晶區也被逐漸水解，使結晶結構被破壞，分子鏈間的相互作用減弱，導致淀粉顆粒的結晶度降低，這與Frost 等[25]的研究結果一致。

表1 不同發芽時間綠豆淀粉的相對結晶度Table 1 Relative crystallinity of mung bean starch with different germination time

2.4 傅里葉紅外光譜分析

天然綠豆淀粉和不同萌發時間綠豆淀粉的FT-IR 曲線如圖4 所示。綠豆淀粉在1 423、1 157、1 039 和931 cm-1處吸收帶的吸收強度沒有變化，不同發芽時間綠豆淀粉未出現紅移。1 423、1 039和931 cm-1的吸收峰表明存在C-O-H 拉伸振動，1 157 cm-1處CH2相關峰表明C-O 拉伸振動[26]。峰強度變化可能歸因于發芽期間結構部分損壞，由于淀粉結構不穩定，使鍵振動所需能量低。不同發芽時間綠豆淀粉的特征吸收峰無明顯變化，所以發芽處理并沒有使綠豆淀粉產生新的基團，這與劉裕[27]的研究結果一致。

圖4 不同發芽時間綠豆淀粉的FT-IR 曲線Fig.4 FT-IR curve of mung bean starch with different germination time

1 045 和1 022 cm-1處吸收峰表明淀粉顆粒結晶區和非結晶區的數量，1 045 cm-1/1 022 cm-1處峰強度比如表2。隨著發芽時間的延長，綠豆淀粉在1 045 cm-1/ 1 022 cm-1處峰強度比呈先上升再下降的趨勢。1 045 cm-1/1 022 cm-1峰強度比的下降可能是由于發芽的綠豆淀粉結晶區的雙螺旋結構被破壞[28]。隨著發芽時間的增加，淀粉的有序度變化不大，但在發芽12 h 時和48 h 之后，有序度有下降的趨勢，這表明發芽處理會使淀粉的有序結晶結構遭到破壞，淀粉晶體結構由有序向無序轉變[9]。此外，1 045 cm-1/1 022 cm-1峰強度比與XRD 測量的結晶度變化略有差異，這可能是由于FT-IR 透過力低，只能穿透淀粉顆粒表面，而不是整個淀粉顆粒，而X 射線衍射可以穿透整個淀粉顆粒。

表2 不同發芽時間綠豆淀粉1 045 cm-1/1 022 cm-1有序度Table 2 1 045 cm-1/1 022 cm-1 orderliness of mung bean starch at different germination times

2.5 凝沉性分析

淀粉的凝沉性和老化特性有著密不可分的關系，直接反映了淀粉的老化程度。不同發芽時間綠豆淀粉的沉降物占比如圖5 所示。隨著沉降時間的加長，沉降物的占比在逐漸下降，同時隨著發芽時間的延長，淀粉沉降物占比有所增加，這與熊柳等[29]的研究結果一致。支鏈淀粉分子具有支叉結構，凝沉性較差，而直鏈淀粉分子因具有線性結構，其凝沉性較強。隨著發芽時間的延長，支鏈淀粉分子被不斷水解，造成支鏈淀粉分子所占比例下降，因此具有更強的凝沉性。朱彩玲等[15]研究表明，凝沉性增強意味著發芽綠豆淀粉抗老化能力減弱，所以發芽后的綠豆淀粉會更容易老化回生。老化回生的淀粉抗消化能力較強，這為低GI 的綠豆淀粉制品生產提供依據。

圖5 不同發芽時間綠豆淀粉的沉降物占比Fig.5 Proportion of sedimentation of mung bean starch at different germination time

2.6 估計血糖生成指數

綠豆淀粉在不同萌發時間的估計血糖生成指數如表3 所示。發芽綠豆淀粉的估計血糖生成指數呈先下降后上升的趨勢，這可能是由于抗性淀粉在12 h 含量達到最高，隨著發芽時間的延長，抗性淀粉水解使估計血糖生成指數回升，這與何李曄紫[30]的研究結果一致。淀粉消化率受淀粉顆粒大小、淀粉與脂質或淀粉與蛋白質相互作用、淀粉鏈長度、直鏈與支鏈淀粉比、淀粉與多酚相互作用等因素的影響，同時它還受到許多外界因素的影響，如儲存時間、淀粉糊化、淀粉再生和消化酶活性[31]。發芽刺激了內源性α-淀粉酶活性，隨著發芽時間的增加，非結晶區淀粉分子發生分解，抗性淀粉含量逐漸增加。發芽處理后消化率降低，這可能是由于發芽過程中淀粉分子結構的變化和冷卻過程中淀粉老化所致[32]。綠豆在萌發過程中富集了多種多酚類化合物，這些多酚類化合物可能與直鏈淀粉和支鏈淀粉相互作用形成短程有序結構[33,34]。淀粉的化學結構、酚類化合物的濃度和類型以及食物的加工方式都會影響這些相互作用。酚類化合物在糊化過程中與淀粉形成V 型淀粉包體化合物，導致淀粉消化率降低[35]。

表3 不同發芽時間綠豆淀粉的估計血糖生成指數Table 3 Estimated glycemic index of mung bean starch at different germination time

3 結論

本實驗通過外源GABA 聯合超聲處理綠豆種子萌發。通過對綠豆發芽過程的觀察與檢測，分析發芽對淀粉結構特性和血糖指標變化的影響。GABA聯合超聲處理能增強淀粉水解酶活性，由于水解酶的作用使淀粉降解，因此綠豆發芽后總淀粉含量穩步降至21.18%；發芽增加了綠豆直鏈淀粉和抗性淀粉的含量，抗性淀粉在12 h 達到了70.65%，隨著萌發時間的延長，抗性淀粉不斷被降解，綠豆淀粉的估計血糖生成指數也在緩慢的回升。根據掃描電鏡分析可知，發芽后綠豆淀粉顆粒無顯著變化。根據X-射線衍射分析和傅里葉紅外光譜分析可知，發芽綠豆淀粉為典型的A 型結構，發芽后綠豆淀粉顆粒的結晶類型并沒有改變，相對結晶度由39.64%下降到96 h 的12.72%，但隨著發芽時間的延長，在淀粉水解酶的作用下，綠豆淀粉的晶體結構受到了一定的破壞。發芽處理綠豆淀粉沒有新的特征吸收峰出現，因此沒有產生新的基團，但淀粉晶體結構的有序性降低，這使淀粉晶體結構由有序向無序轉變。隨著發芽綠豆淀粉的凝沉性增強，其抗消化能力也有所增加，在發芽12 h 時綠豆淀粉的估計血糖生成指數也降到了22.52，起到了減緩血糖升高的作用。發芽綠豆淀粉在生產需要低粘度材料的食品（蛋糕、餅干）方面具有潛在的應用價值，本研究有助于從發芽綠豆中分離出合適的淀粉應用于食品工業，為其在功能食品中的應用提供了理論依據。