實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應用價值分析

梁潔瓊，黃雪萍，胡斌，寧梅芳

1.來賓市人民醫院醫學檢驗科，廣西來賓 546100；2.來賓市人民醫院兒科，廣西來賓 546100

支原體肺炎是由支原體感染引起的疾病，作為兒童最常見的呼吸系統疾病之一[1]。支原體肺炎感染人體后經過2～3 周潛伏期，此時在臨床表現為干咳、發熱、咽痛、頭痛等，甚至部分患兒無明顯癥狀，且該病可通過飛沫和直接接觸傳播，因此易在人群密集環境中發生[2]。統計顯示，近年隨著空氣環境、飲食習慣等的變化，該病發生率持續升高，若未及時治療可引起腦膜炎等并發癥，嚴重威脅患兒身心健康狀態[3]。既往針對支原體肺炎以血清中檢測出的支原體抗體為主要依據，但經血清免疫學研究發現，支原體等微生物進入人體后需要一定時間引起免疫應答繼而產生抗體，因此血清支原體抗體在支原體感染診斷中存在一定漏診[4]。近年隨著醫療技術的發展及臨床對分子生物學研究的不斷深入，實時實時熒光聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術被廣泛應用于臨床，為深入分析該方案在支原體肺炎診斷中的價值，本文選取2022 年8 月—2023 年10 月來賓市人民醫院收治的1 200 例疑似支原體肺炎患兒為研究對象，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的1 200 例疑似支原體肺炎患兒為研究對象，分別采集其血清和呼吸道分泌物，用化學發光法測定血清中肺炎支原體抗體，用實時熒光PCR 法檢測呼吸道分泌物中的肺炎支原體核酸（Mycoplasma Pneumoniae Nucleic Acid，MP-DNA）。統計發現1 200例患兒中男684例，女516例；年齡1～12歲，平均（5.14±0.82）歲；入院原因：發熱841例，干咳197 例，頭痛162 例；癥狀出現時間1～22 d，平均（10.41±1.42）d。本研究上報醫院醫學倫理委員會并獲得審批。同時經患兒家屬知情同意（LW2023-02）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①存在干咳、發熱、咽痛、頭痛等癥狀，且符合《兒童社區獲得性肺炎管理指南》中相關診斷標準[5]；②年齡1～12 歲；③臨床各項資料齊全；④本研究患兒家屬知情，并簽署知情同意書；⑤未采取免疫抑制劑或免疫增強藥物治療；⑥無臟器組織損傷；⑦急性期及恢復期雙份血清抗體滴度呈4倍及以上升高；⑧入院24 h 內支原體抗體（Mycoplasma Antibody）MP-Ab≥1∶160。

排除標準：①自愿退出本次研究者；②入院前2周使用阿奇霉素等大環內酯類抗生素治療者；③入院后治療中出現嚴重不良反應者；④病歷資料不完善者；⑤混合病原菌感染者；⑥未按要求完成隨訪者；⑦先天性免疫缺陷者；⑧營養不良者。

1.3 方法

1 200 例患兒均采集其血清和呼吸道分泌物，用化學發光法測定血清中肺炎支原體抗體，用實時熒光PCR 法檢測呼吸道分泌物中的MP-DNA，在實施檢查前為患兒及其家屬講解具體檢查流程、注意事項等，同時告知其標本采集過程中注意事項，確保其積極配合。

MP 血清學方法檢測：血清標本采集患兒的靜脈全血2～3 mL 于無菌生化管中，并分離出血清待檢，化學發光法肺炎支原體抗體檢測試劑盒由亞輝龍生物科技股份有限公司提供，儀器使用亞輝龍ICERSiFlash 3000-C 化學發光測定儀，檢測結果判定：抗肺炎支原體IGM 抗體（Anti Mycoplasma Pneumoniae IGM, MP-IGM）結果在0.9～1.1 coI 時，為可疑感染；MP-IGM 結果＞1.1 coI 時，為陽性，提示患兒處于肺炎支原體急性感染期。

實時熒光PCR 檢測：標本采集要求為鼻咽拭子（雙拭子）：用一次性鼻拭子經由患兒鼻腔輕輕旋轉一周，將采集好的拭子頭垂直插入標本采集管中，同時用一次性咽拭子經由患兒的咽喉后壁、扁桃體側壁等處反復擦拭2～3 次，將采集好的拭子頭垂直插入同一標本采集管中密封待檢。熒光PCR 法肺炎支原體核酸檢測試劑盒由圣湘生物科技股份有限公司提供，本試劑盒的最低檢測下限為500.0 copies/mL；儀器為上海宏石SLAN-96P 實時熒光定量PCR 儀，擴增條件設置為50℃，30 min，1 個循環，95℃，1 min，1 個循環，95 ℃，15 s、60 ℃，30 s、45 個循環，25℃，10 s，1 個循環，熒光通道選擇FAM 、VIC 通道。陽性結果：動力學曲線呈“S”型，FAM 通道Ct 值≤40，且VIC（內標通道）≤40；陰性結果：FAM通道Ct 值＞40， VIC（內標通道）動力學曲線呈“S”型，且VIC（內標通道）Ct 值≤40；對于陽性標本，內標檢測結果不作要求；對于陰性樣本，其內標檢測應為陽性（Ct 值≤40），若其內標Ct 值＞40 或無顯示，則該樣本的檢測結果無效，應查找并排除原因，并對此樣本重新采樣，進行重復試驗。

1.4 觀察指標

1.4.1 診斷結果 以病原學檢查結果為金標準，分析各個方案結果。

1.4.2 診斷效能 分析各個方案診斷效能，靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（假陽性例數+真陰性例數）×100%，陰性預測值=真陰性例數/（真陰性例數+假陰性例數）×100%，陽性預測值=真陽性例數/（真陽性例數+假陽性例數）×100%。準確度=（真陽性例數+真陰性例數）/總例數×100%。

1.5 統計方法

以SPSS 23.0 統計學軟件分析數據，計數資料（診斷效能值）采用例數（n）和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法診斷結果對比

以病原學檢查結果為金標準，支原體肺炎陽性939 例，陰性261 例。見表1。

表1 兩種方法診斷結果對比（n）

2.2 兩種方法診斷效能對比

實時熒光PCR 檢測靈敏度（99.36%）、特異度（98.08%）、準確率（99.08%）、陽性預測值（99.36%）、陰性預測值（98.08%）高于MP 血清學方法檢測，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩種方法診斷效能對比（%）

3 討論

支原體肺炎是除病毒、細菌外極易引起兒童肺炎的常見病原體，在全球范圍內每年均有支原體肺炎感染病例報告，且呈現持續、散發或不定期的特征。支原體肺炎的傳染率較高，多在中小學、幼兒園等相對封閉的場所暴發，加之該病無特異性癥狀，多表現為發熱、咳嗽、咳痰等，因此，漏誤診率較高，若未及時控制隨著病情加重可誘發肺外感染、心力衰竭、全身炎癥反應等，威脅患兒生命[6-9]。

肺炎支原體缺乏細胞壁，用針對抑制細胞壁合成發揮抗菌作用的頭孢菌素類、β 內酰胺類抗生素治療支原體肺炎是無效的，而大環內酯類抗生素的抗菌機制是控制細胞內蛋白質的合成，因此大環內酯類抗生素治療支原體肺炎效果理想，故及早實施診斷對制訂治療方案有重要作用[10-11]。

本研究顯示，實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中效果理想[11]。MP 血清學方法具有操作簡單、速度快等特點，但其靈敏度、特異度較低，極易出現假陽性的情況。實時熒光PCR 檢測技術是一種新興的體外核酸擴增技術，可同時擴增多個標本，直接反映患兒的感染情況，該方法可通過探針實時監測擴增時的熒光信號，不必進行電泳等操作，可縮短檢測所需時間，同時可提高診斷準確率，但需要注意該方案對樣本采集和操作環境要求較高，若樣本處理出現差錯可直接影響診斷結果，增加診斷難度，因此臨床需要對操作人員綜合能力進行培養[12-15]。

本研究顯示，實時熒光PCR 檢測靈敏度（99.36%）、特異度（98.08%）、準確度（99.08%）、陽性預測值（99.36%）、陰性預測值（98.08%）高于MP 血清學方法檢測，差異有統計學意義（P＜0.05），該結果與王晶等[16]研究中RTFQ-PCR 診斷靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為90.48%、93.02%、95.00%、89.96%，這一結果接近，可見支原體肺炎診斷中應用實時熒光PCR 檢測可行性較高，究其原因在于實時熒光PCR 檢測是唯一一個將基因拷貝數進行定量的方法，且檢驗操作較為智能，可減少人工誤差；其次該方案特異度、靈敏度較高，將DNA 雜交的高特異性和光譜技術的高精準性融合，應用熒光探針和光電傳導，直接探測基因擴增過程中熒光信號的變化，以獲得定量結果，相當于在PCR 反應過程中自動完成了Northern 雜交，杜絕了傳統PCR 開放檢測對環境的污染和由此導致的假陽性，提高診斷準確率[17]。

綜上所述，實時熒光PCR 檢測在支原體肺炎診斷中的應用價值較高，臨床醫師可結合診斷結果制定合理的干預方案，達到控制病情改善預后的目的。