探針熔解曲線在耐藥結核病快速篩查中的臨床應用研究

宋戎，繆家文，孫春紅，朱亮，王捷婷

鎮江市第三人民醫院檢驗科，江蘇鎮江 212000

結核病屬于傳染性疾病，也是危害人類生命健康的嚴重致死性疾病，尤其是耐藥結核病[1]。2019 年世界衛生組織報告顯示，全球新發結核病1 060 萬，中國排第三，新發結核病78.0 萬[2]。新發結核病患者中，有一半以上屬于新發耐多藥結核病[3-4]。早期確診結核病，及時發現耐藥結核病，制訂并實施科學有效治療，是控制病情，改變生存結局的唯一方案[5-7]。為提高結核病治療效果，需在確診后盡早通過相關方法進行檢測，明確結核病患者的各種藥物耐藥情況，為臨床科學、合理用藥提供詳細、全面信息，指導臨床用藥，提高結核病治療效果。本研究選取2020 年1月—2021 年3 月鎮江市第三人民醫院檢驗科收治的378 例肺結核患者為研究對象，分析探針熔解曲線在耐藥結核病快速篩查中的臨床應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院檢驗科收治的378 例肺結核患者為研究對象。男223 例，女155 例；年齡20～76 歲，平均（48.35±4.72）歲；病程1～15 年，平均（8.34±1.28）年。本研究經醫學倫理委員會審核批準（2023-37-01），患者及家屬知情同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：資料完整詳細；配合完成檢查；精神狀態正常。

排除標準：檢查不配合的患者；提供樣本污染的患者；不配合本研究的患者。

1.3 方法

1.3.1 儀器及試劑 廣東體必康 BACspreader 1100C細菌超聲分散計數儀、結核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis, MTB）核酸提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）熔解曲線法耐藥突變檢測試劑盒、廈門致善Lab-Aid 824s 磁珠法核酸自動提取儀與配套熒光定量PCR 檢測系統、珠海貝索羅氏培養基、二級生物安全柜等。

1.3.2 檢測方法 比例法：嚴格遵循《結核病實驗室檢驗規程》中的要求完成羅氏固體藥物敏感性檢測。探針熔解曲線檢測技術：嚴格遵循廈門致善熒光PCR 熔解曲線法檢測結核分枝桿菌對藥物檢測試劑說明書操作及結果進行判斷，若是痰標本則通過Lab-Aid 824s 磁珠法核酸自動提取儀完成純化MTB DNA 提取工作，在PCR 反應管添加標記有熒光基團及淬滅基團的特異性寡核苷酸探針，于PCR擴增期間進行熒光值實時監測，結合靶序列熔點變化判斷是否為野生株或耐藥突變。

1.4 觀察指標

以比例法為金標準，計算熔解曲線技術檢測的敏感度[真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%]、特異度[真陰性例數/（假陽性例數+真陰性例數）×100%]、陽性預測值[真陽性例數/（真陽性例數+假陽性例數）×100%]、陰性預測值[真陰性例數/（假陰性例數+真陰性例數）×100%]、符合率[（真陽性例數+假陰性例數）/（真陽性例數+假陰性例數+假陽性例數+真陰性例數）×100%]、約登指數（靈敏度+特異度-1），涉及藥物6 種，是利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星、阿米卡星。

1.5 統計方法

應用SPSS 18.0 統計學軟件進行分析，以傳統的比例法（羅氏固體藥物敏感性檢測）作為金標準對照，計算熒光PCR 熔解曲線法技術檢測6 種藥物耐藥的敏感性、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、約登指數。

2 結果

與比例法比較，熔解曲線技術檢測利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素、氧氟沙星、阿米卡星耐藥性的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、約登指數見表1。

表1 溶解曲線技術檢測6 種藥物耐藥結果

3 討論

受人口流動性持續增大、人們生活觀念及性觀念改變等影響，結核病與艾滋病的流行趨勢日益上升，防治形式更為嚴峻[8]。鑒于結核病危害性較大，需早期采用有效技術篩查疾病，及時發現結核病的存在，早期進行有效治療[9]。世界衛生組織報道顯示，中國屬于耐藥結核病高負擔國家[10]。但傳統結核病診斷、檢測方法已經無法滿足現今嚴峻的結核病防治形勢，尤其是耐藥結核病[11]。世界衛生組織的相關報告顯示，異煙肼耐藥結核患者的增長速度更明顯[12]。針對這一情況臨床推廣應用GeneXpert MTB/RIF 檢測，但該檢測技術有限檢測利福平耐藥結核，用于異煙肼耐藥結核篩查，存在一定的漏診率，部分患者的病情容易耽誤[13]?，F今國內基層醫院常用的耐藥結核病篩查方法較多，包含表型檢測方法、基因型檢測方法。表型檢測方法以傳統比例法（羅氏固體藥物敏感性檢測方法）、液體法（全自動培養儀BACTEC MGIT 960 檢測方法）為主，基因型檢測方法以GeneXpert MTB/RIF 技術與基因芯片法等為主。若應用傳統表型檢測方法展開篩查工作，需進行結核分枝桿菌培養、藥物敏感試驗，具有較好的準確性、重復性，是現今診斷結核病的金標準方法，但對實驗室生物安全級別有較高要求，且結核分枝桿菌的生長速度較慢，獲取檢測報告的時間較長，多在2～6 周出具報告，嚴重影響患者早期治療。為達到快速檢測耐藥結核病的目的，臨床醫師將目光投入分子檢測技術。

現今分子診斷方法較多，包含線性探針反向雜交法、實時熒光PCR 法以及探針熔解曲線法等[14]。探針熔解曲線法是現今比較推崇的方法，具有操作簡單、便捷、快速、準確與經濟等多項優點，可快速檢測結核分枝桿菌的利福平及異煙肼等耐藥突變基因，適合大批量樣本篩查工作。但從臨床應用可發現，現今探針熔解曲線技術主要用于利福平、異煙肼兩種耐藥結核病篩查種，但在乙胺丁醇以及鏈霉素耐藥結核病篩查種的應用較少。朱玉梅等[15]的研究對耐藥肺結核的多色探針熔解曲線分析技術價值展開分析，其中氧氟沙星的敏感度是87.0%、特異度是94.0%，認為該技術具有顯著應用價值。本研究贊成上述觀點，研究結果顯示，應用探針熔解曲線技術檢測后，利福平敏感度為91.70%、特異度為98.10%、符合率為97.90%，異煙肼敏感度為87.90%、特異度為94.20%、符合率為93.65%，乙胺丁醇敏感度為87.50%、特異度為97.03%、符合率為96.83%，鏈霉素敏感度為91.30%、特異度為98.19%、符合率為97.35%，氧氟沙星敏感度為94.74%、特異度為98.89%、符合率為98.68%，阿米卡星敏感度為80.00%、特異度為99.46%、符合率為99.21%，6 種藥物耐藥結核病的篩查敏感度、特異度與符合率均較高，可見該技術的應用價值顯著。但在應用該檢測法的時候，必須重視相關問題，部分痰標本中的MTB 含量比檢測下限更低的時候，會導致標本表型藥敏試驗為耐藥，但分子耐藥顯示敏感，導致測序結果不一致。

綜上所述，探針熔解曲線在耐藥結核病快速篩查中的臨床應用效果顯著。