1株藍莓灰霉病病原菌的分離鑒定及殺菌劑室內毒力測定

顏倩 侯瑞 李思 羅其鑫 李金子月

摘要：灰霉病是藍莓生產中的重要病害，近年來嚴重影響貴州省藍莓產業發展。為明確藍莓灰霉病病原菌，采用組織分離法從貴州省麻江縣藍莓基地采集藍莓灰霉病病葉，分離鑒定藍莓灰霉病病原菌。通過形態學結構、ITS、HSP60、RPB2多基因序列，系統發育樹分析和致病力測定，將分離菌株HM4-1鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。同時，采用菌絲生長速率測定4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內毒力，結果表明，在相同濃度梯度下4種殺菌劑對病原菌菌株HM4-1菌絲生長的抑制率分別為：啶酰菌胺56.875%～76.563%、異菌脲30.208%～100.000%、百菌清14.667%～43.960%，腐霉利34.250%～100.000%。將4種殺菌劑對該菌株菌絲生長的抑制率進行顯著性及室內毒力分析發現，啶酰菌胺的抑制性最佳，EC50為0.622 mg/L，相比于百菌清的相對毒力指數為63.12，異菌脲和腐霉利次之，百菌清較弱，三者EC50分別為1.368、2.488、39.260 mg/L?；颐共〔≡姆蛛x鑒定和室內毒力測定為進一步研究藍莓灰霉病綜合防控提供了理論基礎。

關鍵詞：藍莓；灰霉??；分離鑒定；室內毒力；抑制率；相對毒力指數

中圖分類號：S436.639? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0153-06

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）別稱藍莓，多年生常綠或落葉灌木，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），是營養價值較高的小漿果果樹［1］。藍莓于20世紀開始在我國進行栽培引種，其果實富含花青甙，抗氧化能力強，且低糖、低脂肪對人類健康有益，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一［2-3］。我國引進的品種主要為高叢藍莓、矮叢藍莓以及兔眼藍莓等［4］。近年來隨著藍莓產業迅速的發展，病害也在逐年增加，且危害嚴重。貴州省常見的藍莓病害主要為藍莓灰霉病、藍莓根腐病、藍莓枝枯病和藍莓葉斑病等，對藍莓的健康生長和產業發展產生極大的危害［5-8］。

灰霉病為植物常見病害之一，其不僅是危害藍莓的嚴重病害，也是番茄、草莓和葡萄等植物的真菌性病害，嚴重影響植物的健康生長［9-11］。藍莓灰霉病常見病原菌主要為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），目前報道的灰葡萄孢菌主要分為無菌核產孢、產菌核產孢、菌核產孢3種類型，各菌群代表菌株均有致病性，但存在差異［12］。藍莓灰霉病在多個省份均有不同程度的暴發，嚴雪瑞等發現我國北方藍莓主要產區遼寧省、吉林省、山東省等地該病害普遍發生，成為限制藍莓產業發展的因素之一，我國南方貴州省、浙江省、安徽省的藍莓灰霉病病害也日益嚴重［12-13］。貴州作為藍莓主要產區省份之一，藍莓灰霉病病害卻少見報道，貴州省藍莓灰霉病高發期為每年3—5月，主要危害藍莓的花、果、葉和莖稈等部位［14］。其在田間發病癥狀主要表現為侵染初期葉片、花器等出現病斑，隨著侵染時間加長，病斑呈黃褐色水浸狀擴散開來，速度快、范圍廣，直至花器、莖稈發黑腐爛，葉片枯死，且感病植株地下部分會停止生長。

本研究通過對貴州省麻江縣藍莓灰霉病展開病原真菌的分離、鑒定工作，明確其病原真菌種類，同時對藍莓灰霉病殺菌藥劑進行篩選，以期為進一步研究藍莓灰霉病的防治措施提供相應的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藍莓灰霉病病樣采集自貴州省黔東南州麻江縣瑞藍果業藍莓種植基地（107°60′73″E，26°52′78″N，海拔為864 m）發病藍莓植株，供試藍莓品種為一年生萊格西藍莓。

培養基：PDA培養基（葡萄糖20 g、馬鈴薯汁 1 000 mL、瓊脂18～20 g）、PDB培養基（葡萄糖 20 g、馬鈴薯汁1 000 mL）。

供試殺菌劑：50%腐霉利可濕性粉劑（日本住友化學株式會社）、50%異菌脲懸浮劑（蘇州富美實植物保護劑有限公司）、75%百菌清可濕性粉劑［先正達（蘇州）作物保護有限公司］、50%啶酰菌胺水分散粒劑（山東惠民中聯生物科技有限公司）。

1.2 試驗時間及地點

于2022年5月在貴州省貴陽市花溪區貴州大學林學院森林病理學實驗室開展試驗。

1.3 病原菌分離純化

選取典型發病癥狀的藍莓植株利用組織分離法進行病原菌的分離和純化，得到代表性菌株HM4-1。選取有病斑藍莓葉片和果實，用水沖洗表面灰層后晾干，將藍莓病部組織放置超凈工作臺中，用75%乙醇將病部組織浸泡3 s左右后，放入3%～5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，最后用無菌水沖洗5～8次，將病組織部分剪切為5 mm×5 mm小塊，置于無菌濾紙上吸干表面水分，將消毒后的病組織塊在PDA平板上輕輕按壓后取下，并將該平板作為對照用以檢測消毒效果。切取同樣大小病組織塊接種于PDA培養基中央在25 ℃黑暗條件培養3 d后，用接種針挑取邊緣菌絲純化處理，直到PDA平板上長出形態單一菌落。

1.4 藍莓灰霉病病原菌的鑒定

1.4.1 形態學鑒定

超凈操作臺中，內徑為5 mm的打孔器先在病原菌菌落邊緣打出菌餅，將菌餅接種于PDA培養基中央并放置于25 ℃黑暗條件培養箱中培養3～7 d后，觀察菌落的形態、菌絲生長速度、菌絲密度與著生情況等。待菌株培養7～15 d后，采用壓片的方法，用光學顯微鏡對菌株的分生孢子及菌絲形態進行觀察［15］。

1.4.2 病原菌致病性測定

根據柯赫氏法則測定病原菌致病性，做有傷接種。純化好的菌株在PDA培養基中培養3 d后，在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌絲塊，將生長狀況相同的健康藍莓葉片用滅菌接種針在藍莓葉片主脈兩側扎上傷口，并將純化的菌餅接種到植株傷口上，以無菌PDA 培養基接種到植株作為對照［12］。處理和對照各做10次重復，接種后葉片用雙層濾紙和無菌脫脂棉進行保濕處理，置于25 ℃恒溫培養箱中，3～5 d后觀察葉片發病情況。最后取發病的部位進行病原菌再分離，并將分離后獲得的病原菌與接種病原菌進行對比，完成致病性檢測。

1.4.3 分子生物學鑒定

以病原菌HM4-1的DNA作為模板，用Fungal DNA Midi Kit真菌DNA提取試劑盒（OMEGA），采用真菌ITS通用引物及基于基因HSP60、RPB2設計的特異引物（表1）進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳純化后送往重慶擎科興業生物技術有限公司進行測序。將測得的菌株序列提交到GenBank獲得登錄號，同時與NCBI數據庫序列進行比對，于比對結果中挑取代表性序列在MEGA 7.0中構建菌株系統發育樹。

1.5 室內毒力測定

通過觀察菌株HM4-1菌絲生長速率檢測4種殺菌劑對該菌株的室內毒力。以無菌蒸餾水將殺菌劑原藥配制成有效藥劑濃度為1×104 mg/L的母液，在配制母液基礎上對其進行梯度稀釋，4種藥劑均按照500、1 000、2 000、5 000、10 000倍濃度稀釋［19-20］，稀釋液濃度為20、10、5、2、1 mg/L。

將在母液基礎上稀釋好的藥劑放置超浄工作臺中，移液槍吸取5 mL藥劑于20 mL滅菌處理完冷卻至50～60 ℃的PDA培養基中，充分使藥劑與PDA混合后倒皿，每種藥劑不同濃度制作3個直徑為90 mm的含藥PDA平板。利用無菌打孔器在活化好的藍莓灰霉菌株HM4-1邊緣打取直徑為 5 mm 的菌餅接種于含藥平板中央，以無菌水處理為對照，每個處理設置3次重復。置于25 ℃恒溫培養箱中暗培養，待對照組菌落基本長滿平板后，采用十字交叉法測量各菌落直徑，數據采用SPASS 26.0進行顯著性分析，并計算各含藥平板對藍莓灰霉菌株HM4-1菌絲生長的抑制率以及各藥劑的半最大效應濃度（EC50）、95%置信區間和相關系數（r2）。以藥劑抑菌性最弱的EC50為基準值，計算其他藥劑的相對毒力指數。

菌絲生長抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

2 結果與分析

2.1 藍莓灰霉病病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌形態學鑒定

從藍莓葉片中分離出35株形態相似的致病菌，選取代表性病原菌HM4-1進行菌株鑒定、致病性等研究。將菌株HM4-1接種于PDA培養基，于25 ℃恒溫培養箱中培養4 d后，菌絲基本長滿直徑為90 mm的培養皿，發現其生長速度較快，氣生菌絲發達，菌絲前期呈白色、地毯式生長（圖1-A），后期菌落逐漸從中心由白色轉變為灰綠色且開始產生黑色菌核（圖1-B）。病原菌在培養10 d時間內開始產孢，以壓片的方法于光學顯微鏡下觀察到病原菌HM4-1的產孢結構，孢子整體生長較為密集，聚集于孢子梗周圍，孢子梗呈葡萄束狀生長，分生孢子無色透明、表面光滑、橢圓至圓形、未見隔膜、單孢生長（圖1-C、圖1-D），根據其形態特征初步判斷病原菌HM4-1為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

2.1.2 藍莓灰霉病田間癥狀

田間發病癥狀為：葉片初期從葉緣呈水浸倒三角狀開始侵染形成病斑，花器和果實等感病后也出現病斑、發黑、隨發病時間加長，后期出現葉片枯死、花果腐爛，直至整株干枯死亡（圖1-E、圖1-F）。

2.1.3 病原菌致病性鑒定

藍莓病組織分離所得到的病原菌HM4-1接種到有傷的藍莓葉片上，3 d 后葉片可見病斑，3～5 d葉片表面開始出現水浸狀病斑，并且擴散快速，且隨接種時間延長，葉片表面病斑逐漸蔓延直至枯死（圖1-G）。接種HM4-1的藍莓葉片刺傷處有稀疏的菌絲生長，對比接種無菌PDA瓊脂塊葉片無發病癥狀（圖1-H）。

2.1.4 病原菌分子學鑒定

將菌株HM4-1的 ITS、HSP60、RPB2序列分別在 NCBI 序列庫中進行搜索匹配。比對結果表明，上述序列分別與登錄號MT832025.1、MN159921.1、MH732872.1最接近。將基于3個不同引物測序所得病原菌HM4-1序列提交到GenBank，分別獲得登錄號OP782300、OP830830、OP830831。根據病原菌HM4-1序列相似性分析，采用Phylosuite軟件將ITS、HSP60、RPB2序列進行多基因數據串聯，在MEGA 7.0中構建菌株HM4-1的系統發育樹（圖2）。

2.2 4種殺菌藥劑對菌株HM4-1菌絲生長的抑制率

通過菌絲生長速率法測定4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內毒力 啶酰菌胺在各濃度下對藍莓灰葡萄孢菌菌絲生長抑制效果差異不大，與對照菌絲相比抑菌能力較強，處理組各濃度下菌絲生長緩慢，菌絲稀薄，出現明顯菌絲營養不足、伸長不夠等現象（圖3-A）。異菌脲對菌株HM4-1菌絲生長抑制效果尚佳，5～20 mg/L濃度區間對其抑制率大于99%，隨著殺菌劑有效含量濃度下降，當濃度為 2 mg/L 時菌株開始生長，有少量稀薄菌絲從平板中央開始向四周生長，當藥劑濃度最低（1 mg/L）時，菌絲開始大量正常生長，表明異菌胺對菌株HM4-1的抑制性開始下降，對比對照組菌絲生長情況可知該藥劑對菌株還存在一定的抑制效果，但較其他處理濃度來說較弱（圖3-B）。百菌清對藍莓灰葡萄孢菌菌絲的抑制效果在4種殺菌藥劑中最差，該處理條件下菌株HM4-1菌絲生長情況尚佳，由對照組情況可知，仍存在一定抑制效果，但隨殺菌劑有效濃度降低，對該菌絲生長的抑制性也隨之削弱，當濃度為1 mg/L時，抑制率幾乎為零（圖3-C）。腐霉利對藍莓灰葡萄孢菌菌絲生長抑制率在濃度為20 mg/L時最佳，菌絲無生長趨勢，10 mg/L時次之，菌絲有緩慢生長跡象，其菌絲開始向四周伸長。隨濃度降低，其對菌絲生長抑制效果下降，當濃度下降到2、1 mg/L時，腐霉利對菌株HM4-1菌絲生長的抑制差異開始縮?。▓D3-D）。

在相同濃度梯度下（1、2、5、10 mg/L），4種殺菌藥劑對菌株HM4-1菌絲生長均有較好的抑制效果，其中啶酰菌胺和異菌脲效果最佳，對菌株HM4-1菌絲生長抑制率分別為55.529%～76.563%、30.208%～100.000%，腐霉利的抑制效果次之，百菌清對菌株HM4-1的抑制性最弱，僅為14.667%～43.960%（表2）。

2.3 4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內毒力

在相同濃度梯度下4種殺菌藥劑對藍莓灰霉病病原真菌的室內毒力皆處于較高水平，啶酰菌胺、異菌脲、百菌清、腐霉利的EC50分別為0.622、1.368、39.260、2.488 mg/L。其中，啶酰菌胺對菌株HM4-1的室內毒力最高，相對毒力指數為63.12，百菌清和腐霉利對其室內毒力較低，相對毒力指數分別為1.00、15.78（表3）。

3 討論

本研究通過對貴州省麻江縣分離所得到的1株代表性菌株HM4-1結合形態學、多基因序列測序（rDNA-ITS、HSP60和RPB2）分析鑒定，確定藍莓灰霉病致病菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），這與王丹等研究發現的山東省藍莓灰霉病病原菌rDNA-ITS的鑒定結果［21］一致。 郜海燕等早在2017年利用rDNA-ITS基因序列測序，將浙江杭州藍莓灰霉病病原菌鑒定為灰葡萄孢菌［22］。本研究同時采用真菌通用測序引物rDNA-ITS 及2種特異引物HSP60和RPB2對藍莓灰霉病病原菌進行分析鑒定，在貴州省屬首次報道。該病原真菌適應性強，寄主范圍廣，致病率高［23］。

灰葡萄孢菌（B. cinerea）可侵染多種植物進而引發灰霉病，如龍牙百合灰霉病、煙草灰霉病，同時也是草莓和番茄等植物灰霉病的病原菌［9-10，17，24］?；移咸焰呔秩痉秶^為廣泛，可引起世界范圍內 1 000 種以上植物發生灰霉?。?5］。鑒于其適應性較強的特點，近年來在貴州省各地均有發生，其中麻江、黔東南、遵義地區藍莓灰霉病發生嚴重［5］。本研究采用菌絲生長速率法測定4種殺菌藥劑（啶酰菌胺、異菌脲、百菌清、腐霉利）對菌株HM4-1的室內毒力［26-27］，結果表明，相同濃度梯度下，4種藥劑對菌株HM4-1菌絲生長均有不同程度的抑制作用，其中啶酰菌胺和異菌脲表現出較強的抑制性，室內毒力較高，EC50分別為0.622 mg/L和 1.368 mg/L。李鴻浩等在研究中發現，異菌脲對灰霉病病原菌菌絲生長的抑制作用較強，腐霉利較前兩者次之，EC50為2.488 mg/L［28］；張從宇等研究發現，分離所得灰霉菌株中，有56%的菌株對腐霉利產生較強抗藥性［29］。百菌清對菌株HM4-1菌絲生長抑制作用較弱，EC50為39.260 mg/L，說明菌株HM4-1對其產生較高抗性，抑制效果較差。設置相同濃度梯度下，啶酰菌胺和百菌清對菌株HM4-1的毒力回歸方程相關系數趨近于1，而異菌脲、腐霉利的相關系數則較前兩者略低，表明在該濃度梯度下，菌株HM4-1的菌絲在殺菌劑啶酰菌胺和百菌清中生長狀態變化較為平緩，而異菌脲及腐霉利對HM4-1菌絲生長變化影響隨著濃度不同波動較大，從而導致其相關系數較低。啶酰菌胺在各濃度下對灰霉菌菌株的抑制率差異較小，效果較佳，異菌脲5、10、20 mg/L濃度下對灰霉菌菌株的抑制性最高，腐霉利僅在20 mg/L濃度下對菌株HM4-1菌絲生長

有較強抑制性，菌株HM4-1對百菌清產生抗藥性，各濃度下抑制效果差于其他3種殺菌劑。

藍莓灰霉病對藍莓產量和品質影響嚴重，本試驗通過對貴州省麻江縣藍莓灰霉病病原真菌的分離鑒定以及不同殺菌藥劑對其的室內毒力測定，可為下一步展開深入研究和防治工作奠定基礎。

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