基于轉錄組學探討益腎清利活血方對馬兜鈴酸Ⅰ誘導腎損傷的作用機制

趙思，何偉明，張傲雪，溫開智，顧麗娜，賀怡寧

（1. 南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）指不可逆的結構或功能性腎損傷，隨著高血壓、糖尿病及老齡化人口的增多，其全球發病率迅速上升，已成為最受關注的健康問題之一［1-2］。CKD 以進行性腎臟炎癥和纖維化為主要特征，炎癥參與發生及發展全過程，間質炎癥會導致細胞外基質（ECM）沉積和膠原蛋白生成，最終導致纖維化，而持續的纖維化會破壞組織結構和器官功能，最終導致腎衰竭［3-4］。目前CKD的治療方法主要是干預其發展和并發癥，發展至終末期需采取透析或移植措施［2］，考慮到經濟壓力、不良反應和激素依賴等問題，從疾病早期使用有效安全的方法來延緩CKD進展非常重要。

益腎清利活血方是在鄒燕勤國醫大師提出“腎虛濕瘀”為基本病機指導下，形成的臨床有效經驗方，由黃芪、丹參、黃蜀葵花和甘草組成。課題組前期研究表明，黃芪甲苷能顯著抑制Wnt/β-catenin 蛋白通路從而拮抗腹膜間皮細胞纖維化能［5］。黃蜀葵花提取物可以調節TGF-β1/Smad7 通路拮抗腎纖維化［6-7］。黃蜀葵花的主要成分金絲桃苷可以通過抑制AMPKULK1 介導的自噬來減輕腎臟損傷［8］。丹參酮ⅡA 具有明顯的抗氧化、抗腎纖維化作用。甘草次酸抑制間隙連接，通過調控TXNIP-AKT、JNK、Thioredoxin 等，發揮抗氧化作用［9］。

轉錄組學具有全面檢測、綜合分析的特點，與中藥復方的治療特點相符合，在復方藥效物質基礎上得到了廣泛的運用［10］。馬兜鈴酸腎病是一種快速進展的腎小管間質纖維化，誘發的腎臟疾病的機制包括氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應等［11］。課題組前期研究表明，馬兜鈴酸Ⅰ可誘導腎小管上皮細胞損傷［12］。因此，本研究采用馬兜鈴酸Ⅰ（AAⅠ）誘導的小鼠模型分析益腎清利活血小復方（YSQLHX）治療后腎臟的轉錄組譜，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

益腎清利活血方組方：黃芪30 g，黃蜀葵花15 g，丹參20 g 和甘草6 g。制備方法：組方分別加10、8 倍水，連續回流提純兩次，濃縮后冷凍干燥，最終得率為13.3%。馬兜鈴酸AAⅠ（純度98%，成都植標化純生物技術有限公司，批號：PCS-190415）。

1.2 動物

雄性7～8 周齡C57BL/6 小鼠，由南京青龍山動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗已獲得南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號：012071001432），飼養于SPF 級實驗室，室溫18～22 ℃，相對濕度45%～70%，自由攝食飲水，12 h晝夜節律。

1.3 試劑

血清肌酐（Scr）、尿酸（UA）、尿蛋白（Pro）定量測試盒（南京建成生物，批號：C011-2-1、C012-2-1、C035-2-1）；艾科瑞RNA 提取試劑盒（湖南艾科瑞生物有限公司，批號：A4A1520）；翌圣逆轉錄和Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）試劑盒（翌圣生物科技有限公司，批號：H8216980）。

1.4 儀器

多功能酶標儀（ 美國 Thermo，型號：MULTISKANFC）；光學顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：BX53P）；低溫高速離心機（美國Thermo 公司，型號：Fresc017）；安捷倫2100生物分析儀（安捷倫科技公司，型號：G2939B）。

1.5 方法

1.5.1 分組及給藥方法

小鼠適應性喂養7 d 后，隨機分為正常對照組（Control）、模型組（AAⅠ）、低劑量組（YSQLHX-L）和高劑量組（YSQLHX-H），每組各12 只。具體干預措施如下：①除正常對照組外，其余組小鼠均腹腔注射馬兜鈴酸Ⅰ 0.1 mL［5 mg/（kg·3d），AAⅠ溶解在0.5%羧甲基纖維素鈉中］誘導腎損傷，劑量參考課題組前期研究［12］，共干預30 d；②低劑量組給予益腎清利活血方凍干粉1.463 g/（kg·d），即11 g/（kg·d），高劑量組給予益腎清利活血方凍干粉2.926 g/（kg·d），即22 g/（kg·d），共灌胃30 d；③正常對照組和模型組每天灌胃0.3 mL 含0.5%羧甲基纖維素鈉的PBS溶液，共灌胃30 d。

連續給藥30 d后，將各組小鼠置于代謝籠內，禁食不禁水，留取各組小鼠尿液。并于6 h后從每組動物眶后竇采集血液，采血后處死各組小鼠，留取各組小鼠腎臟，-80 ℃或液氮保存。

1.5.2 生化指標測定

禁食6 h 后，通過眶后竇收集血液，4 ℃低溫離心機以3 000 r/min 離心15 min，分離血清，留取上清液后根據血清肌酐、尿酸、尿蛋白定量測試盒的說明書檢測相應指標。

1.5.3 腎臟組織病理學檢查

為了評估腎組織中的組織病理學變化，用冷磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液洗滌組織三次并固定在4%多聚甲醛中，嵌入石蠟中切成4 μm 切片，并用HE 和Masson 染色，用光學顯微鏡進行圖像采集，每組隨機挑選6個染色視野進行統計分析。

1.5.4 RNA制備與轉錄組

實驗結束時，正常對照組、模型組和低劑量組組各取4 個腎組織，根據產品手冊說明，使用Tizol（美國加利福尼亞州Invitrogen）從腎組織中提取總RNA，使用安捷倫2 100生物分析儀評估完整性和濃度，然后基于Illumina HiSeq 測序平臺進行二代測序獲得轉錄本表達量矩陣。以測序得到的mRNA的原始數據為研究對象，進行FastQC 質量控制，得到Clean Data，參考GRCm39（mm39）基因組序列，通過每千個堿基的轉錄每百萬（TPM）映射來量化每個基因的表達水平。

1.5.5 數據規范化與分析

通過R 軟件使用“DESeq2”包分析［12］，計算正常對照組（Control）與模型組（AAⅠ）、模型組（AAⅠ）與低劑量組（YSQLHX-L）之間基因的差異情況，以|log2FC| ＞0.5，Pvalue ＜ 0.05 為閾值篩選顯著性差異基因（DEGs），得到名為“diff”的文件為顯著的DEGs。使用Metascape 在線平臺對差異基因進行GO 功能和KEGG通路富集分析。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

1.5.6 篩選核心靶點

將兩組間的DEGs通過Venny在線平臺取交集，得到的交集基因導入STRING 數據庫中進行分析，再將結果文件導入Cytoscape 中用CytoNCA 插件篩選出DC、BC 和CC 均大于中位數的核心基因，并根據度值從大到小順序進行作圖。

1.5.7 實時熒光定量PCR檢測

根據制造商的說明書，使用一步法提取分離總RNA，將總RNA 反向轉錄為cDNA，用于2 μg 樣品，qPCR 以反應體系20 μL 體積進行。采用2-ΔΔCT方法計算，GAPDH 為內參，本實驗使用小鼠引物購自上海生工，引物序列見表1，實驗重復3次。

表1 引物序列表

1.6 統計學方法

使用Graphpad Prism 8.0.2軟件進行分析，采用均數 ± 標準差（±s）進行表示。每份數據進行正態分布檢驗（以Shaprio-wilk 為準），符合正態分布的數據使用單因素方差分析，樣本不符合正態分布時使用非參數檢驗。P＜ 0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腎功能比較

與正常對照組比較，模型組小鼠的尿酸、尿蛋白與血肌酐水平顯著升高，AAⅠ明顯損傷小鼠腎功能，與預期結果一致。與模型組比較，低劑量和高劑量組尿酸、血肌酐的水平均顯著降低，并以高劑量組效果最好（P＜ 0.001，P＜ 0.000 1）。結果見圖1和表2。

圖1 各組小鼠腎功能情況比較

表2 各組小鼠腎功能情況比較（±s）

表2 各組小鼠腎功能情況比較（±s）

注：與模型組比較，****P ＜ 0.000 1，***P ＜ 0.001。

組別正常對照組模型組低劑量組高劑量組血肌酐/（μmol/L）18.5 ± 1.7****48.5 ± 5.9 24.6 ± 1.3****19.93 ± 1.9****n6 6 6 6尿酸/（mg/L）59.6 ± 4.5****143.9 ± 13.7 86.3 ± 3.2****71.17 ± 6.8****尿蛋白/（mg/L）257.0 ± 9.1****322.0 ± 13.8 278.2 ± 22.6***225.6 ± 11.5****

2.2 各組小鼠腎臟組織病理情況比較

HE染色顯示，正常對照組腎小球及腎小管結構完整、清晰、排列有序、細胞形態完整，未見異常；與正常對照組比較，模型組鏡下可見大量的炎癥細胞浸潤、腎小球萎縮、腎小管管腔擴大、腎小管上皮細胞變性、細胞核外露；而低劑量組和高劑量組腎小管結構較完整，上皮細胞死亡與空泡化減輕，炎癥細胞明顯減少。Masson 的三色染色可見，模型組腎間質大量膠原纖維沉積，而經益腎清利活血方處理后纖維化面積顯著降低。結果見圖2和圖3。

圖3 各組小鼠腎組織Masson染色圖（× 400）

2.3 腎臟轉錄組分析

為了闡明益腎清利活血方對腎臟保護的潛在機制，本實驗將正常對照組（Control）、模型組（AAⅠ）、低劑量組（YSQLHX-L）的小鼠腎組織進行轉錄組測序分析（n= 4）。

2.3.1 差異表達基因分析

通過火山圖直觀得到，紅點標注差異表達上調1 倍以上的mRNA，藍點標注下調1 倍以上的mRNA，縱坐標代表Pvalue 值，橫坐標代表logFC 值，因此離橫坐標和縱坐標越遠越高代表該基因表達越顯著。與正常對照組比較，模型組有2 615 個差異基因，其中有1 409 個上調，1 206 個下調；在低劑量組與模型組中共鑒定出368 個差異基因，其中有180 個上調，188 個下調。結果見圖4。

2.3.2 功能富集分析

通過對模型組與低劑量組分析得到的368 個差異基因進行功能富集分析發現，前5 個富集數的分子功能包括氧化還原酶活性、泛素樣蛋白連接酶結合、核受體結合、異構酶活性，生物過程有單羧酸代謝過程、激素反應、分泌調節、脂質定位、小分子生物合成，細胞成分有線粒體內膜、脂滴、過氧化物酶體、高密度脂蛋白顆粒、內質網伴侶復合體。KEGG 通路注釋顯示這些差異基因主要參與PPAR 信號通路，類固醇激素生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，脂肪酸降解，IL-17信號通路等。結果見圖5。

圖5 模型組與低劑量組差異基因

2.3.3 蛋白互作網絡與核心靶點篩選

使用Venny軟件分析顯示，低劑量組治療有反應的368個差異基因中有179個與馬兜鈴酸引起的差異基因重疊，將交集基因導入STRING 數據庫中分析，將結果文件導入Cytoscape 中用CytoNCA 插件進行分析，篩選出DC、BC 和CC 均大于中位數的核心基因37 個，并根據度值從大到小排名進行作圖。樞紐基因中Ppara、Fabp1、Apoa2、Acox1、Ugt2b34 和Hspa5 都與纖維化密切相關，表明其可能是益腎清利活血方的潛在治療靶點。結果見圖6，前8個核心靶點的拓撲參數見表3。

圖6 兩組間差異基因的韋恩圖及核心靶點PPI圖

表3 前8個核心靶點的拓撲參數

2.3.4 核心靶點基因的PCR驗證

對前8 個核心基因的小鼠腎臟組織進行qPCR 驗證。與正常對照組比較，模型組Ppara、Fabp1、Apoa2、Acox1、Nr1h4 mRNA 水平顯著降低，Ugt2b34、Hspa5、Ugt2b5 mRNA 明顯升高，而經益腎清利活血方處理后的低、高劑量組調節了AAⅠ誘導的轉錄本水平的變化。結果見表4和圖7。

圖7 qPCR檢測各組小鼠腎臟組織中的mRNA表達水平

表4 各組小鼠腎臟組織中的mRNA表達水平（±s）

表4 各組小鼠腎臟組織中的mRNA表達水平（±s）

注：模型組比較，****P ＜ 0.000 1，***P ＜ 0.001，**P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05，nsP ＞ 0.05。

組別正常對照組模型組低劑量組高劑量組Ppara 1.000 0±0.001 3****0.544 4±0.022 4 1.000 0±0.053 2****1.033 0±0.088 6****Fabp1 1.000 0±0.001 3****0.184 0±0.060 8 0.293 5±0.041 0*0.515 6±0.032 9****Apoa2 1.000 0±0.019 6****0.536 1±0.017 1 1.120 0±0.039 5****0.937 1±0.093 9****Acox1 1.000 0±0.001 3****0.357 4±0.015 4 0.470 0±0.029 7**0.720 6±0.051 0****Nr1h4 1.000 0±0.001 3***0.696 1±0.063 3 0.836 9±0.008 3*1.034 0±0.075 3****組別正常對照組模型組低劑量組高劑量組Ugt2b34 1.000 0±0.001 3****2.453 0±0.142 3 2.082 0±0.131 7**1.926 0±0.110 1**Hspa5 1.000 0±0.012 4****2.290 0±0.354 6 1.330 0±0.074 2***1.196 0±0.027 7***Ugt2b5 1.001 0±0.062 1****2.124 0±0.289 4 2.414 0±0.041 7ns 1.520 0±0.020 0**

3 討論

中藥配方的多組分、多靶點提供了多樣化的治療，通過許多藥理活性化合物的協同作用發揮治療作用。轉錄組陣列可靠且新穎，可用于搜索具有多種活性成分的中藥影響的多個靶點和途徑。

本實驗研究結果表明，益腎清利活血方可以降低AAⅠ小鼠的尿酸、尿蛋白、血肌酐水平，保護腎功能，顯著降低小鼠腎臟的炎癥細胞和膠原沉積。通過對小鼠腎臟的mRNA 轉錄譜分析，可見益腎清利活血方能顯著改變生物過程、細胞組分和分子功能的許多基因的轉錄，特別是炎癥反應。KEGG 分析顯示益腎清利活血方治療改變了各種途徑，主要參與PPAR 信號通路，類固醇激素生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，脂肪酸降解，IL-17信號通路等。核心基因中PPARα［13-14］是PPAR 信號通路中的轉錄因子，Fabp1、Acox1 是該通路中的下游重要靶基因，可調節脂肪酸細胞攝取、運輸和代謝，與凋亡、纖維化相關。脂質代謝［15］的改變與各種代謝疾病有關，雖然腎臟沒有被歸類為代謝器官，但腎小管細胞具有較高的基線能量消耗水平，主要的能量來源是脂肪酸氧化。在腎損傷后，TECs 的脂肪酸氧化能力受損，糖酵解增加，導致活性氧（ROS）以及促炎和促纖維化因子產生增加，并增加TECs凋亡，還可以導致溶酶體功能障礙和自噬增加，加重CKD 進程［15］。HSPA5 可結合并穩定谷胱甘肽過氧化物酶4，鐵死亡的發生與GPX4 消耗以及ROS和其他氧化物的產量增加有關［16］。Ugt2b34、Ugt2b5主要在胃腸道、肝臟、腎臟中表達，其中親脂性底物與葡萄糖醛酸偶聯，在體內將親水性葡糖苷酸轉運出細胞，主要參與機體代謝反應［17］。Nr1h4 是在肝臟、腸道和腎臟中高度表達是一種主要的核膽汁酸受體，可通過抗炎、抗氧化應激、抗纖維化等發揮保護腎臟疾病的作用，它還在腎臟的葡萄糖和脂質代謝中發揮作用［18-19］。核心靶點還顯示出現了多種載脂蛋白的失調，如APOA2 等，還有趨化因子、生長因子等，這些蛋白大多數與巨噬細胞功能相關，并在CKD 患者中表達下調。

4 結論

益腎清利活血方可以保護腎功能，降低腎臟組織中炎癥和膠原沉積，轉錄組分析發現其與脂肪酸代謝、鐵死亡、IL-17信號通路等密切相關。