基于網絡藥理學和動物實驗探究利咽方治療慢性咽炎的機制

曹雅嵐，李淑坤，黃一平，顧曉娜，張鵬?

（1. 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210023； 2. 江蘇省中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028）

慢性咽炎（chronic pharyngitis，CP）是咽部黏膜、黏膜下組織和淋巴樣組織的慢性炎癥［1-2］，臨床表現為咽喉癢、干、痛，咳嗽，有異物感以及喉部梗阻［3-4］。中國CP患者占耳鼻喉科門診就診患者總數的1/3。CP的發生與環境污染、微生物污染和吸煙等因素相關［5］，研究表明，空氣污染物的增加與CP 的發生呈正相關，特別對于15 歲以下的患者［6］。CP 的病因可分為感染性因素和非感染性因素，病毒、細菌和真菌是常見的感染因素，其中化膿性鏈球菌A 群鏈球菌（GAS）是兒童和成人細菌性咽炎最常見的病因［7］；長期飲酒和吸煙是常見的非傳染性因素［8］。

目前，CP 病理機制尚不清楚，由于反復發病和病程長，CP 患者承受了相當大的身心負擔。中醫藥治療CP 的方法多種多樣，包括煎、茶、湯、針灸、放血和按摩等［9］?，F代醫學中常用抗生素、氣霧劑、扁桃體切除術等治療方法，但抗生素具有副作用且會增加耐藥性，從而加重感染性咽炎。此外，使用抗生素治療真菌和其他非感染性因素引起的CP是無效的。扁桃體切除術常用于治療兒童咽炎，但缺乏足夠的循證研究證實這種治療的有效性［5，8，10］。因此，需要更安全、有效、可靠的治療方法。中醫藥對CP 具有獨特的治療優勢，利咽方（LYF）由半夏厚樸湯發展演變而來，主要由桔梗、厚樸、生姜、茯苓、甘草、青果和紫蘇葉等中藥組成，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，對慢性呼吸道疾病癥狀，如干咳、喘息、喉嚨發炎和聲音嘶啞等有較好治療效果。

網絡藥理學是一門以系統生物學為基礎的新興學科［11］，其利用網絡系統生物學，選擇特定的信號節點來定義藥物分子的多個靶點。中醫認為病人是一個整體，不治療疾病的癥狀，它采取分析方法，檢查病因機制以解釋與疾病相關的變化，并提供適當的治療［1］。正是由于中醫和中藥化合物的概念與網絡藥理學的相似性，網絡藥理學被認為是研究中藥有效成分和靶點的重要工具。因此，利用網絡藥理學探索LYF 治療CP的關鍵靶點、分子過程和信號通路，能為LYF 臨床治療CP提供參考。

1 材料及試劑

1.1 實驗動物

SD 大鼠由江蘇省中醫藥研究院動物中心提供，48 只，SPF 級，體質量180～220 g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021 - 0025，飼養于溫度18～25 ℃，濕度為40%～60%的潔凈環境，飲用無菌水，食用常規飼料，12 h 晝夜交替照明。實驗動物所有操作均符合江蘇省動物倫理委員會標準，倫理編號：AEWC -20220323 - 196。

1.2 實驗藥品、材料及試劑

利咽方處方藥液采用相應中藥提取物按處方比例混勻后水溶的方法配制，中藥提取物為：桔梗提取物C100402 - 01、紫蘇葉提取物C121101 - 01、青果提取物C082202 - 02、甘草提取物C050501 - 05、茯苓提取物C090401 - 05、厚樸提取物C092101 - 02、生姜提取物C050603 - 10（廣東青云山藥業有限公司，批號：20210301、20210901、20211201Z、20211102、20210901、20220301Z、20220301Z）；無蔗糖型慢嚴舒檸清喉利咽顆粒（桂龍藥業安徽有限公司，批號：2110051）；氨水（南京化學試劑股份有限公司，批號：20200108）；TNF - α、IL - 1β 和IL - 6ELISA 試劑盒（中國武漢Elabscience 公司，批號：EL - R2856c、EL - R0015c、EL - R0012c）；抗體GAPDH（Proteintech 公司，貨號：10494 - 1 - AP）；TLR4（Proteintech 公司，貨號：66350 - 1 - Ig）；IκBα（CST公司，貨號：4812）；p - IκBα（CST 公司，貨號：2859）；NF - κB（CST 公司，貨號：8242）；p - NF - κB（CST 公司，貨號：3033）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（CST 公司，貨號：7074）；ECL 發光液（上海碧云天生物科技有限公司，貨號：P0018AS）。

1.3 實驗儀器

倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號：Ⅸ - 73）；電子天平（蘇測電子科技有限公司，型號：BY - 101）；微型垂直電泳槽（上海天能生命科學有限公司，型號：Tanon VE - 180）；全自動化學發光圖像分析系統（上海天能生命科學有限公司，型號：Tanon 5200）。

2 方法

2.1 篩選利咽方中的有效成分及作用靶點

在TCMSP 數據庫中收集LYF 中厚樸、紫蘇、茯苓、生姜、桔梗、青果和甘草等藥的所有化學成分，以口服利用度（OB） ≥ 30%和類藥性（DL） ≥ 0.18 作為條件篩選主要有效成分并收集其靶點，并在Uniprot 數據庫中將收集的靶點名稱校正為其官方名稱。

2.2 篩選慢性咽炎的靶點

通過GeneCards 人類基因數據庫獲得慢性咽炎相關靶點，篩選相關性得分（Relevance score） ≥ 0.8 的相關靶點，作為疾病靶點。

2.3 構建和分析利咽方治療慢性咽炎的網絡關系

將“2.1”項下獲得的藥物靶點與“2.2”項下獲得的疾病靶點輸入Venny網站獲得交集靶點，將交集靶點導入STRING數據庫，設置種類為“homo sapiens”，置信度蛋白參數評分 ≥ 0.9，隱藏孤立靶點后，下載TSV格式的蛋白互作關系文件并導入Cytoscape軟件，以構建蛋白靶點互作（PPI）關系網，然后利用軟件中的Cytohabba插件對PPI網絡拓撲學分析得到MCC值排名前10的靶點。

冠心病的發生還可能與患者的體內雌激素水平[7]、體內的瘦素水平[8]、胰島素抵抗[9]、精神心理狀態[10-11]等多種因素有關。

2.4 對交集靶點進行GO分析和KEGG富集分析

將上述得到的交集靶點導入Metascepa數據庫，設置閾值P＜ 0.01、minimum count = 3、enrichment factor ＞ 1.5等參數，經GO注釋分析分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組分（cellular component，CC）和KEGG通路分析后再將結果在Cytoscape中進行可視化。

2.5 慢性咽炎動物模型實驗

2.5.1 分組、造模及給藥

48 只SPF 級SD 大鼠經適應性飼養1 周后依據隨機數字表隨機分為空白組（Control 組）、模型組（Model組）、利咽方低劑量組（LYF - L 組）、利咽方中劑量組（LYF - M 組）、利咽方高劑量組（LYF - H 組）、陽性藥組（MYSN組），每組8只（雌雄各半）。在旋轉象鼻噴霧瓶中裝入新配制的濃度為2.5%的氨水［12］，除空白組外，其余各組大鼠用氨水噴咽，連續噴20 d，每天噴一次，每次噴2撳；空白組大鼠用無菌水噴咽部。

按照陽性藥說明書，MYSN組給藥0.97 g/kg。根據LYF 的日劑量，LYF - L 組給藥劑量為2.484 g/kg，LYF - M組給藥劑量為12.42 g/kg，LYL - H組給藥劑量為24.84 g/kg。LYF - L組劑量組藥液制備：精密稱取提取物粉末（厚樸0.15 g、生姜0.625 g、茯苓0.25 g、桔梗0.75 g、甘草0.35 g、青果0.625 g、紫蘇葉0.85 g）共3.6 g，混勻后溶解于25.6 mL純化水中，制得0.14 g提取物/mL的利咽方藥液，用于實驗動物給藥。LYF - H和LYF - M組藥液制備：精密稱取提取物粉末（厚樸0.6 g、生姜2.5 g、茯苓1.0 g、桔梗3.0 g、甘草1.4 g、青果2.5 g、紫蘇葉3.4 g）共14.4 g，混勻后溶解于17.4 mL純化水中，制得0.83 g提取物/mL的利咽方藥液，用于實驗動物給藥。

各給藥組每天灌胃1 次，連續給藥14 d，模型組每天給予等量無菌水。給藥結束后，取眼眶靜脈叢血，切除咽黏膜組織。咽部黏膜組織一部分用4%多聚甲醛固定，另外一部分 - 80 ℃冷凍待測。

2.5.2 檢測指標

2.5.2.1 ELISA檢測

血液樣品在室溫（25 ℃）靜止2 h 后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，然后嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF - α、IL - 6和IL - 1β水平。

2.5.2.2 HE染色

大鼠的咽部組織浸泡在固定液（4%甲醛水溶液）中24 h，經常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫水，包蠟，切片，染色，得到大鼠咽部的切片，然后在光學顯微鏡下進行觀察。

2.5.2.3 Western blot檢測

提取咽部組織的蛋白，然后制備10%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳，轉膜，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（GAPDH、TLR4、IκBα、p - IκBα、NF - κB、p - NF - κB），抗體與封閉液配制比例分別為1∶1 000，4 ℃過夜，TBST 洗膜 3 次，每次10 min；次日洗膜后加入二抗（辣根酶標記山羊抗兔，與封閉液配制比例1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3 次，每次15 min，使用增強化學發光免疫印跡對目的條帶進行圖像采集，采用ImageJ 1.53 軟件對條帶進行分析。

2.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.2. 軟件對所有實驗數據進行統計分析，實驗結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 LYF中的有效成分與作用靶點收集

在TCMSP 數據庫中得到有效成分141 個，收集并篩選有效靶點205 個。圖中藍色圓圈代表藥物成分，橙色方塊代表藥物靶點，藥味 - 成分 - 靶點網絡圖中330節點和1 426條邊。見圖1。

圖1 利咽方藥物 - 靶點

3.2 交集靶點的蛋白相互作用（PPI）及分析

通過GeneCards 數據庫一共收集到符合篩選條件的疾病靶點1 950個，將LYF的潛在靶點和CP相關靶點基因取交集，共獲得112個重疊靶點，在Venny網站對數據進行形象化處理，結果見圖2。將上述112個交集靶點導入String 網站獲得交集靶點的PPI 文件并在Cytoscape中將其可視化，以度值大小調節節點大小和顏色深淺，獲得交集靶點的PPI圖，見圖3。根據MCC值大小篩選出排名前10的蛋白，顏色越深表明蛋白越重要，其中以IL - 6、TNF和IL - 1β蛋白的顏色較深，見圖4。

圖2 交集靶點Venny圖

圖3 交集靶點PPI圖

圖4 MCC值排名前10的蛋白圖

3.3 KEGG通路分析和GO富集分析

對交集靶點進行GO功能富集分析，選取P值排名靠前的10個結果進行展示，見圖5。結果表明，利咽方的治療途徑的生物過程主要涉及無機物反應、對異種刺激的反應及對脂多糖的反應等方面；細胞組分主要涉及膜筏、細胞器外膜、囊腔等位置；分子功能主要涉及細胞因子受體結合、DNA 轉錄因子結合及泛素樣蛋白連接酶結合等功能。而KEGG 結果表示LYF可能通過癌癥、脂質和動脈粥樣硬化及乙型肝炎等相關通路發揮作用，見圖6。

圖5 GO分析結果圖

圖6 KEGG氣泡圖

3.4 血清TNF - α、IL - 1β、IL - 6水平

與Control 組比較，Model 組血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明顯升高差異有統計學意義（P＜ 0.05）。與Model 組比較，各治療組（MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H組）血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05），且與LYF的劑量呈負相關。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比較（±s，pg/mL）

表1 各組大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比較（±s，pg/mL）

注：與Control組比較，#P ＜ 0.05；與Model組比較，*P ＜ 0.05。

IL - 1β 101.54 ± 8.18 186.51 ± 5.37#117.63 ± 5.63*162.99 ± 4.24*144.10 ± 6.49*113.75 ± 7.89*組別Control組Model組MYSN組LYF - L組LYF - M組LYF - H組n6 6 6 6 6 6 TNF - α 61.09 ± 4.33 145.18 ± 5.63#72.09 ± 6.39*129.33 ± 7.06*99.02 ± 6.33*73.20 ± 4.88*IL - 6 73.86 ± 4.26 145.44 ± 6.33#93.29 ± 6.79*131.56 ± 3.02*101.36 ± 6.24*86.11 ± 5.00*

3.5 組織病理學結果

Control 組上皮未見壞死和脫落，固有層含有大量緊密結締組織，炎癥細胞浸潤極少；Model 組黏膜下層結締組織疏松，含有各種結構異常、增生的混合腺體，這些腺體突破固有層，破壞喉咽黏膜，炎癥細胞的根尖浸潤明顯，符合CP 的病理特征。各治療組切片顯示黏膜上皮角質化、部分壞死和脫落，發生層增生細胞數量較多，炎性細胞持續浸潤，與Model 組比較，咽黏膜恢復增強，炎癥減輕。見圖7。

圖7 大鼠咽部組織HE切片圖（ × 200）

3.6 Western blot 檢測組織蛋白TLR4、pI - κBα、I -κBα、NF - κB的表達

與Model 組比較，MYSN 組和LYF - H 組TLR4 蛋白表達降低，MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 組I -κBα 蛋白表達下降，pI - κBα 蛋白MYSN、LYF - H 和LYF - M 組表達下降，且MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 組中磷酸化NF - κBp65 蛋白與p65 蛋白的比值與模型組相比也下降。具體結果見表2和圖8。

表2 各組大鼠咽部組織中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表達（±s）

表2 各組大鼠咽部組織中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表達（±s）

注：與Control組比較，#P ＜ 0.05；與Model組比較，*P ＜ 0.05。

NF - κB 0.62 ± 0.02 1.31 ± 0.09#0.77 ± 0.07*1.13 ± 0.04*0.93 ± 0.06*0.90 ± 0.01*組別Control組Model組MYSN組LYF - L組LYF - M組LYF - H組TLR4 0.22 ± 0.04 0.69 ± 0.03#0.34 ± 0.07*0.62 ± 0.09 0.52 ± 0.08 0.44 ± 0.06*I - κBα 0.88 ± 0.02 0.26 ± 0.08#0.70 ± 0.05*0.46 ± 0.03*0.53 ± 0.02*0.67 ± 0.02*pI - κBα 0.13 ± 0.01 0.72 ± 0.18#0.27 ± 0.06*0.56 ± 0.10 0.45 ± 0.09*0.29 ± 0.08*

4 討論

通過網絡藥理學研究，從LYF中鑒定出205個活性化合物，這些成分已被證明在免疫和炎癥中具有調節作用。例如，厚樸中的酚類化合物可以抑制NF - κB通路中I - κBα 和p65的磷酸化，從而抑制炎癥反應［13-15］。青果可抑制炎癥細胞因子IL - 1β 和TNF - α 的表達［16-17］。此外，LYF 中其他化學成分，如紫蘇中的揮發油成分［18-20］，姜中的姜辣素［21-23］和桔梗中的桔梗皂苷D［24-25］可以調節細胞和體液免疫以及腸道免疫反應，具有增強免疫力的作用；茯苓中的三萜和多糖［26-28］以及甘草中的甘草酸［29-32］不僅可以增強免疫力，還可以通過抑制炎癥細胞因子的表達和產生起到抗炎作用。通過對交集靶點PPI 網絡進行拓撲分析得到了較為重要的靶點為IL - 6、TNF、IL - β，而動物實驗證明了LYF能夠降低大鼠血清中TNF - α、IL - 6、IL - 1β 水平，且與LYF劑量呈正相關。綜上所述，LYF治療慢性咽炎可能通過調節TNF、IL - 6、IL - 1β等因子發揮抗炎作用。

KEGG 通路分析結果顯示，LYF 治療CP 的作用機制可能與抑制NF - κB 通路有關。核因子 - κB（NF -κB）轉錄因子家族在調節免疫發育、免疫反應、炎癥和癌癥中發揮著重要作用［33］。NF - κB 家族［34］包括NF -κB1 p50、NF - κB2 p52、RELA（也稱為p65）、RELB 和c - REL，它們通過典型和非典型NF - κB 信號通路發生。前者主要由NF - κB1 p50、RELA和c - REL介導，后者主要激活p100 隔離的NF - κB 成員，主要是NF -κB2 p52 和RELB（也稱為非典型NF - κB 家族成員）。在靜息狀態下［35］，NF - κB 與κB 抑制劑（I - κB）結合，如主要受I - κBα 調控的典型p50/p65 異源二聚體，一旦受到刺激，I - κB 被磷酸化降解，釋放的NF - κB 進入細胞核誘導基因表達，最終導致炎癥。動物實驗用Western blot 測定大鼠咽部組織中蛋白TLR4、I - κBα、NF - κBp65的表達，結果顯示，LYF治療后的大鼠咽部組織中磷酸化I - κBα蛋白水平低于模型組，且呈劑量依賴性，p65/p65 蛋白比例低于模型組，說明LYF 能夠抑制p65蛋白的磷酸化，從而抑制炎癥的發生。

此外，筆者發現高劑量LYF 組可以抑制Toll 樣受體4（TLR4）蛋白的表達。TLR4 屬于模式識別受體（PRR）家族，是先天免疫系統的關鍵組成部分［36］。當受到細菌脂多糖以及病理條件下產生的其他病原體衍生成分或內源性分子的刺激時，TLR4可觸發兩種主要的信號級聯反應；其中包括髓樣分化因子88（MyD88）依賴級聯，以及Toll/白細胞介素1 受體域誘導的干擾素β（TRIF）依賴級聯［37］。MyD88依賴通路始于細胞質TIR結構域，MyD88激活觸發IL - 1受體相關激酶（IRAK），即IRAK1 和IRAK4 的自磷酸化，并進一步與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）相互作用［38］。IRAK 和TRAF6 的激活最終導致I - κBα 的磷酸化和降解［39-40］。在本研究中LYF - H 組大鼠咽部組織中TLR4 的表達下降，說明此劑量下的LYF 能夠抑制TLR4 蛋白的表達。因此，LYF 治療CP 的效果還可能與抑制TLR4啟動的免疫反應有關。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法，揭示了LYF 通過的多組分、多靶點、多途徑治療CP 的潛在機制。動物實驗結果表明，LYF 可以降低血清中TNF -α、IL - 6、IL - 1β 水平，抑制咽部組織中TLR4 表達和NF - κB活化。LYF對CP的治療作用可能是通過抑制TLR4/NF - κB 通路和下調炎性細胞因子水平，從而抑制炎癥反應發生，本研究成果可為今后LYF 的臨床應用提供實驗依據。