牛膝鹽炙工藝研究

張世豪，那葉馨，東嬌嬌，胡建華，薛金浩，高詩雯，楊柳

（黑龍江中醫藥大學，北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）為莧科植物牛膝（AchyranthesbidentataBl.）的干燥根，味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經，具有填精補髓、益陰活血的功效，是傳統滋補肝腎、強健筋骨的中藥。臨床主要用于治療腰膝骨痛、四肢拘攣、筋骨無力以及痿痹等癥［1-2］。研究表明，牛膝具有多種藥理作用，包括免疫系統調節、抗生育、抗腫瘤、鎮痛、抗炎、抗衰老、抗骨質疏松和對心血管和神經系統作用等［3-7］。

炮制可以改變藥性，提升療效，降低毒性。根據古籍記載，牛膝生用可散瘀血、消腫痛、引血下行，鹽炙后能引藥入腎，增強其補肝腎、強筋骨的作用。牛膝經不同炮制工藝炮制后，化學成分發生較大的變化，導致藥理作用改變?，F代牛膝常用的炮制方法為鹽炙、酒炙、炒炭等，如炮制后酒牛膝可增強活血通絡作用；鹽牛膝能引藥下行入腎，發揮補腎養精作用；牛膝炭主要發揮止血之功。2020 版《中華人民共和國藥典》中對于鹽炙藥材的描述均是加入定量食鹽（藥材100 g，鹽2 g），文火加熱，炒干。但牛膝鹽炙工藝的參數還不完善，加鹽量沒有針對性，炒制溫度和時間也不統一，使鹽炙品的內在質量難以得到有效控制，影響其臨床用藥的準確性，很難將藥理實驗結果和其物質含量差異進行聯系，也不能為解讀藥效學差異提供幫助。

道地藥材質量與炮制方法密切相關，牛膝作為我國臨床常用的大宗藥材之一，建立統一的、質量可控的、數字化炮制標準勢在必行。因此，以課題組前期確定的牛膝補腎壯骨的有效成分——β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節參皂苷Ⅳa為評價指標［8-9］，選取加鹽量、炒制溫度和炒制時間為考察因素，用單因素和Box-Behnken 設計方法優化牛膝的鹽炙工藝。以期能夠得到最佳的炮制工藝，保證牛膝的臨床療效，并為牛膝的規范化鹽炙提供參考依據。

1 材料與儀器

標準品：β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa（批號：5289-74-7、34367-04-9、51415-02-2，天津西瑪科技有限公司）；甘草素（IS）（批號：578-86-9，中國成都亞德生物科技有限公司）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮（由本實驗室從牛膝中分離純化，并經NMR 和MS 譜等數據鑒定化學結構，標準品純度均 ≥ 98%）；牛膝藥材（河南省，經檢驗符合《中華人民共和國藥典》相關規定）。

超高效液相串聯質譜分析儀（美國Thermo 公司）；超聲波清洗器（KQ-5000DB，昆山市超聲儀器有限公司）；送風定溫干燥箱（WFO-410W，上海愛朗儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（EYEL4 OSB-2100，東京愛朗儀器有限公司）；高速粉碎機（800AD，永康市艾澤拉電器有限公司）；分析天平（NewClassicMF，Mettler Toledo Switzertand 公司）；電熱恒溫水浴鍋（HSS，上海博訊事業有限公司醫療設備廠）。乙腈（Thermo Fisher Scientific）、乙酸（Dikma）均為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：乙腈（A%）和0.3%乙酸水（V/V，B%）。梯度洗脫條件見表1，總離子流圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 總離子流圖

2.1.2 質譜條件的選擇

配備有電噴霧離子源的三重四級桿質譜儀，在SRM 模式下進行負離子掃描。噴射電壓：-3 000 V；鞘氣：30 Arb；輔助氣：10 Arb；離子傳輸管溫度：325 ℃；蒸發器溫度：350 ℃；輔助器：2 L/min；全程通入氮氣。5 種有效成分及內標化合物的檢測離子對及其質譜參數見表2；5 種有效成分的代表質譜圖見圖2。

表2 5種有效成分及內標的質譜條件

圖2 有效成分的代表質譜圖

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱取5種有效成分適量，配置成混合對照品溶液。各成分的濃度分別為：β-蛻皮甾酮0.989 0 mg/mL、25R-牛膝甾酮0.981 0 mg/mL、25S-牛膝甾酮1.102 0 mg/mL、人參皂苷R00.997 0 mg/mL 以及竹節參皂苷Ⅳa 0.976 0 mg/mL。

2.1.4 供試品溶液的制備牛膝樣品均粉碎并篩分（60目）。取0.5 g樣品于燒瓶中，浸泡于50 mL 50%的甲醇溶劑中，然后在40 ℃水浴中超聲60 min，得供試品溶液，4 ℃保存待測。

2.1.5 標準曲線

以進樣濃度為橫坐標（x），以對照品和內標峰面積比為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算回歸方程。相關系數（R2）均大于0.999 3，這表明5 種有效成分均在其線性范圍內呈現了良好的線性關系。5 種有效成分的回歸方程、相關系數及線性范圍結果見表3。

表3 5種有效成分的回歸方程、相關系數及線性范圍

2.1.6 系統適應性

精密度測試，精密吸取上述供試品溶液適量，24 h內連續測6 次，連續測定3 d，計算相對標準差（relative standard deviation，RSD）。結果表明各有效成分的精密度RSD ＜ 1.32%，表明該方法精密度良好。

重復性測試，精密稱取同一批樣品，記錄5 種有效成分的色譜峰面積，并計算峰面積的RSD 值，考察方法的重現性。結果表明各有效成分的重復性RSD ＜2.60%，表明該方法重復性良好。

穩定性測試，取同一批次的供試品溶液適量，分別于0、4、8、16、32、48 h進樣分析，記錄峰面積，考察供試品溶液在48 h內的穩定性。結果表明各有效成分的穩定性RSD ＜ 2.56%，表明該樣品48 h內在4 ℃下穩定。

利用加樣回收率試驗對該方法的準確性進行評價，樣品中加入了已知的低、中、高3 個濃度的標準溶液，每個濃度測定3 份。日內、日間精度、穩定性、重復性和準確性的結果見表4。該方法測定結果準確可靠。

表4 5種有效成分的精密度、重復性、穩定性及加樣回收率試驗結果

回收率（%）=（測定平均值-樣品值）/加入量×100%

2.2 鹽炙工藝的單因素實驗

2.2.1 炒制時間的單因素考察

牛膝原藥材切制成7～8 mm 小段，精密稱取6 份，每份100 g，放于保鮮盒中，加入2 g 食鹽配成的鹽水燜潤，炒制溫度為100 ℃，炒制時間分別為10、15、20、25、30 min，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比是1∶8（g/mL），提取時間為60 min，提取次數2 次的條件下分別進樣分析。在炒制溫度和加鹽量一定的條件下，隨著炒制時間的延長，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過長的加熱時間會導致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當炒制時間為20 min時，有效成分的含量最高，因此確定最佳炒制時間為20 min。見圖3。

圖3 不同因素對鹽炙效果的影響

2.2.2 炒制溫度的單因素考察

2 g 食鹽配成的鹽水燜潤，炒制時間為20 min，炒制溫度分別為80、90、100、110、120 ℃，牛膝炒后粉碎過篩（60 目），樣品在甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時間60 min，提取次數2 次的條件下分別進樣分析。其中炒制溫度為100 ℃結果最佳。炒制時間和加鹽量一定的條件下，隨著炒制溫度的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，過高的溫度會導致有效成分遭到破壞致使有效成分的含量降低。當炒制溫度為100 ℃時，有效成分含量最高，因此確定最佳炒制溫度為100 ℃。見圖3。

2.2.3 加鹽量的單因素考察

加入1%、2%、3%、4%、5%的10 mL 鹽水燜潤，炒制時間為20 min，炒制溫度100 ℃，甲醇濃度50%（V/V），料液比為1∶8（g/mL），提取時間60 min，提取次數2 次。在炒制時間和炒制溫度一定的條件下，隨著加鹽量的升高，5 種有效成分的總含量先升高后下降，加鹽量為2%時，有效成分的含量最高，因此確定最佳加鹽量為2%。見圖3。

2.3 鹽炙工藝的響應面法

2.3.1 回歸方程的建立及結果

采用基于Box-Behnken設計法優化牛膝鹽炙工藝。在單因素試驗基礎上，鹽炙考察因素設定為炒制溫度，炒制時間，加鹽量。根據響應面法設計，每個因素設3水平，分別以-1.00，0.00，1.00進行編碼。代碼值所代表的實際操作物理量見表5，試驗安排及結果見表6。

表5 響應面法實驗因素與水平

表6 鹽炙工藝BBD實驗設計

2.3.2 牛膝最佳鹽炙工藝的優化結果

2.3.2.1 β-蛻皮甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗數據進行分析，得到β-蛻皮甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 59.73 +7.74A - 3.21B + 0.54C - 1.26AB + 0.94AC - 0.12BC -19.49A2- 8.31B2- 0.38C2。方差分析結果見表7，模型決定系數R2= 0.957 6，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；表中F值和P值分別是17.57和0.000 5，表明β-蛻皮甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對β-蛻皮甾酮含量影響較大。

表7 β-蛻皮甾酮方差分析

2.3.2.2 25R-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗數據進行分析，得到25R-牛膝甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 2.09 +0.2A - 0.16B + 0.001 6C + 0.17AB - 0.038AC -0.006 3BC - 0.31A2- 0.12B2+ 0.096C2。方差分析結果見表8，模型決定系數R2= 0.916 8，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；表中F值和P值分別是8.57和0.004 9，表明25R-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項中，AB值最大，說明加鹽量和炒制溫度對25R-牛膝甾酮含量影響較大。

2.3.2.3 25S-牛膝甾酮

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗數據進行分析，得到25S-牛膝甾酮含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 3.06 +0.36A - 0.16B + 0.059C + 0.091AB - 0.16AC -0.33BC - 0.49A2- 0.74B2- 0.29C2。方差分析結果見表9，模型決定系數R2= 0.944 9，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；表中F值和P值分別是13.34 和0.001 3，表明25S-牛膝甾酮擬合模型顯著。其中，在交互項中，BC 值最大，說明炒制溫度和炒制時間對25S-牛膝甾酮含量影響較大。

表9 25S-牛膝甾酮方差分析

2.3.2.4 人參皂苷R0

采用Design-Expert軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗數據進行分析，得到人參皂苷R0含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 6.55 + 0.21A +0.2B + 0.043C - 0.013AB + 0.23AC + 0.009 5BC -2.08A2- 1.62B2- 1.42C2。方差分析結果見表10，模型決定系數R2= 0.978 2，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；表中F值和P值分別是34.82 和＜ 0.000 1，表明人參皂苷R0擬合模型顯著。其中，在交互項中，AC 值最大，說明加鹽量和炒制時間對人參皂苷R0含量影響較大。

表10 人參皂苷R0方差分析

2.3.2.5 竹節參皂苷Ⅳa

采用Design-Expert 軟件對牛膝鹽炙工藝的試驗數據進行分析，得到竹節參皂苷Ⅳa 含量對加鹽量、炒制時間、炒制溫度的二次多元回歸模型方程Y = 12.66 +1.02A - 0.59B + 0.035C - 0.56AB - 0.11AC + 0.29BC -2.92A2- 1.62B2- 0.19C2。方差分析結果見表11，模型決定系數R2= 0.970 4，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；表中F值和P值分別是25.46和0.000 2，表明竹節參皂苷Ⅳa擬合模型顯著。其中，在交互項中，AB 值最大，說明加鹽量和炒制溫度對竹節參皂苷Ⅳa含量影響較大。

表11 竹節參皂苷Ⅳa方差分析

2.3.3 響應面分析因素間的相互作用

加鹽量和炒制時間的交互作用與五種有效成分含量的關系的三維曲面圖見圖4。隨著加鹽量和鹽炙時間逐漸增大，5 種有效成分的含量也逐漸增大；當增大到一定水平時，5 種有效成分的含量卻逐漸下降，說明加鹽量和炒制時間兩因素的交互作用明顯。當加鹽量較大時，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖5。當炒制時間一定時，5 種有效成分含量隨著炒制溫度的增大逐漸減小，見圖6。綜上所述，鹽炙因素對有效成分的含量的影響由大到小依次為：加鹽量 ＞ 炒制溫度 ＞ 炒制時間。

圖5 加鹽量和炒制溫度對有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

圖6 炒制時間和炒制溫度對有效活性成分的含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

2.4 鹽炙工藝的驗證實驗

結合Design-Expert，綜合分析與實驗可操作性等有關的各因素，分析認為最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時間20 min。采用上述最優鹽炙工藝進行驗證，重復實驗3次，測得的主要成分的總含量較高，結果見表12。說明鹽炙工藝的穩定可靠，重復性好，可操作性強，具有實際應用價值。

表12 鹽灸工藝驗證實驗結果/（mg/g）

3 討論

牛膝始載于《神農本草經》，具有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經、引血下行之功效，用于腰膝酸痛、筋骨無力、經閉癥瘕、肝陽眩暈等。牛膝中含有皂苷類、甾酮類、多糖類、甜菜堿和多種微量元素等，其中以齊墩果酸型三萜皂苷、蛻皮甾酮和多糖類為其主要活性成分［10］。鹽炙理論雖論述頗多，但仍以“入鹽走腎”的理論為核心，臨床上凡是歸腎經的藥物多進行鹽炙［11］。歷代中藥鹽炙方法有14 種，分別為鹽水制、鹽水潤、鹽水炙、鹽水浸炒、鹽水淹、鹽水炒、鹽水煮、鹽水浸、鹽水拌、鹽水曝干、鹽水煮、鹽水拌炒、鹽水蒸、鹽水拌蒸［12］?，F代炮制方法主要以鹽炙、鹽蒸等為主［13］。牛膝經鹽炙后能夠增強補肝腎、強筋骨之功效［14］，而藥理研究證實牛膝中甾酮類物質（主要包括β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮等）有促進成骨細胞增殖作用［15］，牛膝中皂苷類物質（主要包括竹節參皂苷Ⅳa、人參皂苷R0等）有抑制破骨細胞以及保護損傷軟骨細胞的作用［16-17］，這與鹽牛膝補肝腎、強筋骨之效相吻合。因此本實驗以課題組前期確定的牛膝補腎壯骨的5 種有效成分——β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮，人參皂苷R0及竹節參皂苷Ⅳa 為評價指標進行鹽炙工藝研究。

在炮制工藝設計方面，相關的研究多是采用正交實驗法和Box-Behnken響應面法［18-22］。正交實驗同時考慮幾種相關因素，尋找最佳因素水平組合，但是不能給出整個區域因素和響應值之間的一個明確函數表達式，從而無法找到最佳組合和響應值的最優值。而Box-Behnken 實驗采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題［22］。因此，本研究采用Box-Behnken 響應面法對牛膝的鹽炙工藝進行設計。

本實驗采用超高效液相色譜串聯質譜法，以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人參皂苷R0及竹節參皂苷Ⅳa 為評價指標，采用單因素及Box-Behnken 設計方法，優化牛膝的鹽炙工藝。最終確定牛膝的最佳鹽炙工藝為2%加鹽量，炒制溫度100 ℃，炒制時間20 min。本文建立的牛膝鹽炙工藝穩定可靠，重復性好，可操作性強，具有較強的實際應用價值，有利于提高牛膝鹽炙品的質量均一性，保證臨床用藥的有效性，為中藥飲片的標準化和現代化提供依據。