益腎調經方調控PI3K/Akt通路對早發性卵巢功能不全大鼠卵巢功能及凋亡蛋白表達的影響

金國鈺，楊春潤，何靜，蓋敏雪，張舒榮，劉歡歡，李長忠

（1. 山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2. 山東省立醫院，山東 濟南 250021； 3. 山東大學，山東 濟南 250012； 4. 濟南大學，山東 濟南 250024； 5. 江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330025； 6. 北京大學深圳醫院，廣東 深圳 518036）

早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一種常見的自發性和異質性疾病，指女性40歲之前出現卵巢功能衰退甚至喪失，伴促性腺激素水平升高以及雌激素水平下降［1-3］。隨著醫療水平的發展以及就醫觀念的改變，POI 的發病率逐年增加且呈現出年輕化趨勢［4-5］。多數POI 患者在月經不調開始后12～24 個月內卵巢功能迅速下降，隨之出現繼發性閉經。同時，POI 還會導致骨質疏松癥、心血管疾病及情志障礙相關疾?。ń箲]、抑郁）等，嚴重影響廣大女性身心健康［6-7］。

目前，POI 相關機制尚未完全明確，遺傳缺陷、自身免疫性疾病、醫源性因素和環境暴露等因素均能導致POI 的發生［8-9］。 激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）作為目前最常用的治療手段［6，10］，雖然能夠暫緩POI 帶來的一系列癥狀，但對生殖功能無明顯改善，同時長期口服雌/孕激素也會增加靜脈血栓、中風、婦科腫瘤等疾病的患病風險［11-12］。

中醫學相關文獻中尚無POI 的病名記載，可將其歸于“閉經”“月經后期”“血枯”“不孕癥”等范疇。目前，中醫藥在調經促孕方面療效明顯，優勢突出［13-15］，益腎調經方作為臨床經驗方，能夠有效改善卵巢功能，保護女性生育能力，但其具體作用機制尚不明確。本研究通過腹腔注射環磷酰胺溶液（cyclophosphamide，CTX）構建POI 模型大鼠，探討益腎調經湯對CTX 誘導POI模型大鼠的影響及可能機制，以期為POI的臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

60 只SD 大鼠由山東省立醫院動物實驗中心提供，雌性，6 周齡，體質量（220 ± 10）g。實驗動物飼養于山東省立醫院實驗動物中心二樓東側SPF 環境中，室溫控制在20～25 ℃，相對濕度40%～60%，實驗過程中嚴格遵守山東省立醫院動物倫理委員會規定（山東省立醫院動物倫理批號為NO.2020-004）。

1.2 實驗藥物

戊酸雌二醇片（1 mg/片，拜耳，批號：224A2）；益腎調經方組方熟地黃15 g，當歸12 g，醋龜甲10 g，山藥20 g，山茱萸12 g，酒蓯蓉20 g，醋香附15 g，黨參15 g，丹參15 g，黃芪20 g，枸杞子20 g，淫羊藿15 g，菟絲子20 g，由山東省立醫院藥房提供，益腎調經方生藥與顆粒劑等量換算，相當于免煎顆粒43.5 g/劑。

1.3 實驗試劑

4%組織細胞固定液、1 × PBS 緩沖液、蘇木素伊紅染色試劑盒（P1110、P1020、G1120，北京索萊寶科技有限公司）；環磷酰胺試劑（HY-17420，MCE）；大鼠雌二醇（E2）Elisa 試劑盒、大鼠促卵泡生長激素（FSH）試劑盒、大鼠促黃體生成（LH）試劑盒、大鼠抗繆勒管激素（AMH）試劑盒（202206、202207、202207、202207，山東科研云生物科技公司）；兔抗PI3K 單克隆抗體、兔抗Akt 單克隆抗體、兔抗Bcl-2 單克隆抗體、鼠抗Bax 單克隆抗體（20584-1-AP、10176-2-AP、26593-1-AP、50599-2-Ig，武漢三鷹生物技術有限公司）；RNA Isolater、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（017E2250FA、017E2250FA、027E2201CB，南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.4 實驗設備

微量電子秤（BS210S，德國Sartorious，）；室溫離心機（5430R，德國Eppendorf）；高速低溫離心機（5810R，德國Eppendorf）；組織脫水機（Excelsior AS，美國Thermo Scientific）；組織包埋機（Histostar，美國Thermo Scientific）；石蠟切片機（RM2235，德國Laica）；水平脫色搖床（TS-10000，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；全自動酶標儀（Multiskan FC，美國Thermo Scientific）；熒光定量PCR儀（LightCycler 480 Ⅱ，德國Roche）。

2 方法

2.1 模型建立和分組

SD 大鼠適應性喂養7 d 后，每天固定時間行陰道脫落細胞學檢查，連續10 d。將動情周期正常的大鼠納入實驗（n= 60），使用隨機數字表隨機分為空白組、模型組、對照組和中藥低、中、高劑量組，每組10 只?？瞻捉M大鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組大鼠腹腔注射CTX 誘導POI 大鼠模型，首次50 mg/（kg·d），然后按8 mg/（kg·d）劑量連續給藥14 d。建模成功后，對照組給予0.1 mg/（kg·d）戊酸雌二醇；中藥各劑量組給予5 mL/（kg·d）的益腎調經湯中藥溶液；空白組與模型組給予同等體積的生理鹽水，連續灌胃14 d。

參照《藥理實驗方法學》：200 g 大鼠的用藥劑量 =人臨床日用量 × 0.018 × 5。換算各組大鼠給藥濃度，結果見表1。

表1 各組給藥劑量及濃度

2.2 標本采集

末次給藥后，禁食禁水12 h，腹腔注射25 mg/kg 戊巴比妥溶液用于麻醉大鼠，電動剃毛器備皮，1%碘酊消毒，腹部行Y型切口，充分暴露腹主動脈。使用一次性真空釆血管采血，室溫靜置45 min，離心15 min（離心條件：溫度4 ℃，1 500 r/min），上層淡黃色血清分裝于凍存管中，放于-80 ℃冰箱凍存備用。游離雙側卵巢、盡可能去除多余脂肪組織，稱重，一側卵巢放入液氮凍存，另一側卵巢4%的多聚甲醛固定。

2.3 檢測指標

2.3.1 一般情況

從給藥第2 天開始，每天固定時間觀察并記錄大鼠的一般情況（體質量、行為活動、飲食、二便情況）。

2.3.2 動情周期變化

從給藥第2 天開始，每天固定時間進行陰道脫落細胞涂片檢查，連續14 d。

2.3.3 卵巢指數

游離雙側卵巢、盡可能去除多余脂肪組織，稱重并記錄，計算卵巢指數。

卵巢指數 = 卵巢濕重（mg）/體質量（g）

2.3.4 HE染色觀察卵巢組織形態改變組織切片常規脫蠟至水，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，常規脫水、透明，中性樹膠封片。

2.3.5 ELISA法檢測血清激素水平

取大鼠血清，按照試劑盒說明書操作，檢測血清中E2、FSH、LH、AMH 含量，用標準品的濃度和OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，算出各樣品的濃度。

2.3.6 RT-qPCR 檢測大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表達

取部分卵巢組織，按照試劑盒說明書步驟操作，檢測PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA 表達情況，以2-ΔΔCT法進行相對定量分析。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列表

2.3.7 免疫組織化學法檢測大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表達情況

組織切片脫蠟至水，Tris-EDT 修復液抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，5% BSA 封閉非特異性靶點，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫，滴加適量即用型HRP 標記抗兔二抗，DAB 顯色，滴加適量1% CuSO4增強信號，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封片?？瞻捉M滴加PBS代替一抗，其余步驟同前。

2.4 統計學方法

釆用SPSS25軟件進行統計學分析，本研究所使用數據均為計量數據，釆用均數 ± 標準差（±s）表示，多組數據間比較釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩數據間比較釆用LSD-t分析。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

空白組大鼠精神狀態良好，行為活動正常，飲食及二便均正常。與空白組比較，模型組大鼠精神狀態差，活動量減少，喜聚堆蜷臥，進食減少，部分大鼠出現脫毛。給予對應藥物治療后，上述癥狀出現不同程度改善，其中藥高劑量組、對照組效果最為明顯。

與空白組比較，模型組大鼠體質量明顯下降（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，給予治療藥物7 d后，對照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組大鼠體質量明顯增長（P＜ 0.000 1），給予治療藥物14 d 后，各給藥組大鼠體質量均有所增長（P＜ 0.05）。其中，對照組及中藥高劑量組改善效果最為明顯，接近于空白組，且兩組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表3。

表3 各組大鼠不同時間點體質量變化情況比較（±s，g）

表3 各組大鼠不同時間點體質量變化情況比較（±s，g）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△P ＜ 0.05，△△△△P ＜ 0.000 1。

第14天259.00 ± 1.53 224.70 ± 0.67####252.30 ± 1.76****215.70 ± 3.28*△△△△242.30 ± 0.88***△255.00 ± 1.73****組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10第1天222.00 ± 1.52 223.70 ± 2.84 223.00 ± 2.30 219.30 ± 1.86 223.00 ± 2.30 222.70 ± 0.89第7天243.70 ± 2.03 210.30 ± 0.89####241.00 ± 1.16****210.30 ± 1.45△△△△233.70 ± 2.33****△245.70 ± 0.67****

3.2 各組大鼠動情周期變化情況比較

與空白組比較，模型組大鼠動情周期明顯延長（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組大鼠動情周期明顯縮短（P＜ 0.000 1）。見表4。

表4 各組大鼠動情周期變化情況比較（±s）

表4 各組大鼠動情周期變化情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△P ＜ 0.05。

動情周期/h 113.30 ± 1.48 298.80 ± 8.53####133.80 ± 1.38****101.4 ± 4.20****△114.20 ± 1.16****137.20 ± 1.86****組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.3 各組大鼠卵巢指數情況比較

與空白組比較，模型組卵巢指數明顯下降（P＜0.000 1）；與模型組比較，對照組、中藥高劑量組卵巢指數明顯升高（P＜ 0.000 1），兩組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠卵巢指數情況比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢指數情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△△△△P ＜ 0.000 1。

卵巢指數/%0.91 ± 0.08 0.37 ± 0.08####0.80 ± 0.06****0.28 ± 0.01△△△△0.37 ± 0.04△△△△0.80 ± 0.03****組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.4 各組大鼠卵巢組織形態學觀察

空白組卵巢組織皮質及髓質結構清晰完整，可見各級卵泡（始基、初級、次級卵泡和竇前卵泡等）及黃體，間質內血管豐富、未見淋巴細胞浸潤及纖維化。模型組卵巢組織結構紊亂，卵巢髓質萎縮，皮質增生并出現纖維化樣改變，各級卵泡數量減少（始基卵泡、初級卵泡最為明顯），閉鎖卵泡數量增加。

給予相應藥物后，中藥低劑量組無明顯改善，可見成熟卵泡，但整體數量較少；中藥中劑量組優勢卵泡數目明顯增加，閉鎖卵泡減少；對照組、中藥高劑量組卵巢組織結構清晰，各級卵泡數量較模型組、中藥低劑量組明顯增加，卵泡充盈，與空白組接近。見圖1。

圖1 卵巢組織病理切片圖（ × 200）

3.5 各組大鼠血清性激素水平比較

與空白組比較，模型組E2、AMH 水平下降（P＜0.001，P＜ 0.000 1）、FSH、LH水平升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組E2水平升高（P＜ 0.000 1）、FSH、LH 水平降低（P＜ 0.01，P＜ 0.001，P＜0.000 1），對照組、中藥高劑量組AMH 水平升高（P＜ 0.01）；其中，中藥中劑量組、中藥高劑量組E2水平明顯高于對照組（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。見表6。

表6 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

表6 各組大鼠血清性激素水平比較（±s）

注：與空白組比較，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

AMH/（pg/mL）200.1 ± 1.94 152.8 ± 4.89###183.8 ± 1.92**152.5 ± 1.69△△157.7 ± 2.85△182.1 ± 9.07**組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 E2/（ng/L）82.19 ± 1.06 36.45 ± 0.41####62.84 ± 0.53****61.31 ± 2.00****70.48 ± 0.48****△△77.82 ± 0.58****△△△△FSH/（IU/L）20.06 ± 1.23 34.80 ± 1.56####17.79 ± 1.16****24.40 ± 1.21**△23.70 ± 1.35***17.58 ± 1.22****LH/（ng/L）22.66 ± 1.18 33.37 ± 0.77####21.61 ± 0.39****28.10 ± 0.48**△△△19.08 ± 0.30****21.01 ± 0.71****

3.6 各組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax mRNA表達比較

與空白組比較，模型組PI3K mRNA、Akt mRNA及Bcl-2 mRNA 表達明顯降低（P＜ 0.001，P＜0.000 1），Bax mRNA 表達明顯升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，對照組、中藥高劑量組Akt mRNA 表達升高（P＜ 0.01，P＜ 0.001）；對照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA 表達升高（P＜ 0.05，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），Bax mRNA表達逐漸降低（P＜ 0.01，P＜ 0.000 1）；其中中藥高劑量組Bax 蛋白表達低于對照組（P＜ 0.05）。見表7。

表7 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表達情況比較（±s）

表7 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表達情況比較（±s）

注：與空白組比較，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001。

Bax 0.44 ± 0.04 1.00 ± 0.03####0.71 ± 0.04**0.90 ± 0.07 0.58 ± 0.05***0.46 ± 0.02****△組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PI3K 4.17 ± 0.21 1.00 ± 0.08####3.08 ± 0.27****1.67 ± 0.12△△△2.86 ± 0.04****3.58 ± 0.08****Akt 4.21 ± 0.35 1.00 ± 0.08####2.32 ± 0.20**1.48 ± 0.03 1.79 ± 0.07 2.83 ± 0.20***Bcl-2 3.17 ± 0.13 1.01 ± 0.10###2.16 ± 0.19*0.79 ± 0.06△△2.53 ± 0.23**2.91 ± 0.38***

3.7 各組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax 蛋白表達比較

與空白組比較，模型組PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表達明顯降低（P＜ 0.000 1），Bax 蛋白表達明顯升高（P＜ 0.000 1）；與模型組比較，各給藥組PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表達升高（P＜ 0.05，P＜0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），對照組、中藥中劑量組及中藥高劑量組Bax 蛋白表達降低（P＜0.000 1）；

其中，中藥高劑量組PI3K、Akt 蛋白表達高于對照組（P＜ 0.000 1）；Bax 蛋白表達低于對照組（P＜0.05）。見圖2～5和表8。

圖2 各組大鼠卵巢組織中PI3K表達圖（ × 200）

圖3 各組大鼠卵巢組織中Akt表達圖（ × 200）

圖4 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2表達圖（ × 200）

圖5 各組大鼠卵巢組織中Bax表達圖（ × 200）

表8 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表達情況比較（±s）

表8 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表達情況比較（±s）

注：與空白組比較，####P ＜ 0.000 1；與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；與對照組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

Bax 0.12 ± 0.00 0.19 ± 0.00####0.15 ± 0.00****0.19 ± 0.00△△△△0.13 ± 0.00****△△0.13 ± 0.00****△組別空白組模型組對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10 PI3K 0.17 ± 0.00 0.06 ± 0.01####0.10 ± 0.00****0.08 ± 0.00***△△0.08 ± 0.00**△△△0.16 ± 0.00****△△△△Akt 0.14 ± 0.00 0.07 ± 0.00####0.10 ± 0.00****0.09 ± 0.00***0.10 ± 0.00****0.13 ± 0.00****△△△△Bcl-2 0.18 ± 0.00 0.11 ± 0.00####0.16 ± 0.00****0.12 ± 0.00*△△△△0.15 ± 0.00****0.15 ± 0.00****

4 討論

卵巢顆粒細胞是修復卵巢功能的關鍵，在FSH 和LH的共同作用下，卵巢顆粒細胞可以合成甾體激素雌激素和孕酮，在卵泡發育過程中發揮著重要作用。卵巢顆粒細胞功能受損時，不僅性激素生成受到影響，還能進一步影響卵泡的發育，進而導致不同發育階段卵泡閉鎖發生［16-17］。卵巢顆粒細胞自噬、凋亡等異常是導致卵泡細胞過早過快閉鎖的原因之一，其發生與相關信號通路及基因密切相關，其中，最經典的是通過PI3K/Akt信號通路影響Bcl-2、Bax等［18-19］。

PI3K/Akt 信號通路負責許多細胞行為,包括生存、生長和增殖。研究顯示，PI3K/Akt 通路廣泛參與卵巢顆粒細胞增殖、凋亡等過程，上調PI3K/AKT 表達能夠抑制卵巢組織損傷，以恢復卵巢功能［20-22］。凋亡是一種細胞程序性死亡方式，發生在細胞發育的各個階段。卵泡內細胞異常凋亡與卵泡閉鎖密切相關，可導致卵巢功能的衰竭，是卵巢功能低下的主要發生機制。觸發凋亡有兩種途徑，分別是線粒體途徑（內在途徑）和死亡受體途徑（外在途徑）。Bax 和Bcl-2 同屬于Bcl-2家族，在線粒體細胞凋亡途徑中起關鍵作用，并且已被證明可以調節卵巢凋亡。研究顯示益腎填精類中藥可以增加POI 大鼠卵巢的Bcl-2 蛋白表達，降低Bax 蛋白的表達，減少顆粒細胞凋亡，增加顆粒細胞分泌［23-25］。

腎為先天之本，藏精，主生殖，若腎精虧虛，則沖任失調，無血以下；肝腎精血互生、藏泄互用，若肝失濡養，疏泄失司，則氣機阻滯，氣血運行失常；脾主統血，脾主運化，若脾胃損傷，氣血不足，則化經無源，血海失養。因此，肝、脾、腎功能正常，方能沖任調達，生化有源。

益腎調經方是由左歸丸演變而來，方中熟地黃、淫羊藿、枸杞子為君，滋陰補血、益精填髓、溫腎壯陽，陰陽并補；臣以山茱萸、山藥、菟絲子平補肝腎之良藥，陰陽并治，陰平陽秘，使沖任調達，月經如時以下；佐以肉蓯蓉、醋龜甲滋陰潛陽、益腎安神；當歸、丹參養血活血、調經止痛；黨參、黃芪補氣健脾；醋香附行氣疏肝、活血止痛。全方虛實并治，補腎為主，兼顧肝脾，同時輔以行氣、活血、補血之法，以達陰陽平衡，沖任調攝，月經復常。

因此，本實驗基于PI3K/Akt 通路及凋亡相關蛋白探討益腎調經方治療POI 的作用機制。實驗結果顯示，益腎調經方能夠有效改善CTX 誘導的POI 模型大鼠的一般狀況，調節動情周期和血清激素紊亂，同時上調PI3K、Akt mRNA 及蛋白的表達，從而促進卵巢顆粒細胞增殖，原始卵泡的發育。此外，益腎調經湯還能增強Bcl-2 的表達及抑制Bax 的表達，從而抑制大鼠卵巢顆粒細胞過度凋亡。其中，高劑量組效果最佳，與對照組（戊酸雌二醇）效果最為接近，甚至部分指標優于對照組。綜上，益腎調經湯對POI 的治療作用可能是通過調控PI3K/Akt信號通路及凋亡相關蛋白實現。