HPLC法測定蒙藥甘露解毒丸中連翹酯苷A的含量研究

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法測定蒙藥甘露解毒丸中連翹酯苷A的含量。方法：色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.4%冰醋酸（15∶85，V/V）為流動相，流速為0.8 mL/min，檢測波長330nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：連翹酯苷A在0.1～1.4μg范圍內呈現良好線性關系，線性方程為Y=2302379X+2377（r=0.9999，n=6）；專屬性良好；精密度和穩定性的RSD分別為0.40%和0.80%。平均加樣回收率為94.34%，RSD為1.26%（n=9）。測定兩批甘露解毒丸樣品，平均含量為0.7772 mg/g，RSD為0.71%。結論：高效液相色譜法測定連翹酯苷A的含量操作簡便，重現性好，靈敏度較高，適用于甘露解毒丸中連翹酯苷A的含量測定。

【關鍵詞】 甘露解毒丸；連翹酯苷A；高效液相色譜法；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）04-0024-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.04.zgmzmjyyzz202404006

Research of Content Determination for Forsythoside A in Mongolian Medicine by HPLC

JIU Yue

Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatograghy method for the content determination of Forsythoside A in Mongolian medicine Ganlu Jiedu Pills. Methods The chromatographic column was SHISEIDO CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile-0.4% acetic acid（15∶85，V/V）， the flow rate was 0.8 mL/min， detection wavelength was 330nm， the column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 10 μL.Results Forsythoside A showed a good linearity in the range of 0.1-1.4 μg and the linear equation was Y=2302379X+2377（r=0.9999， n=6）. The specificity was good and the RSD of precision and stability were 0.40% and 0.80%. The average recovery was 94.34% with RSD of 1.26% （n=9）.The average content of 2 batches samples was 0.7772 mg/g，with RSD of 0.71%. Conclusion The high performance liquid chromatograghy method for the content determination of Forsythoside A is easy to operate， reproducible and high sensitivity which can be used for the content determination of Ganlu Jiedu Pills.

Key words：Ganlu Jiedu Pills; Forsythoside A; High performance liquid chromatography; Content Determination

蒙藥制劑甘露解毒丸為棕褐色水丸，味微苦澀，由連翹、石膏、益智仁、肉豆蔻、苦參、丁香等四十七味藥組成，具有清熱、解毒、消食功效。用于接觸性毒、陽光毒、呼吸中毒、木質性毒等各類毒性疾?。?］。方中的連翹為主藥，其有效成分是以連翹苷為主的木脂素類和連翹酯苷為主的苯乙醇苷類［2］。連翹酯苷A作為一種酚性成分，一直以來都被視為連翹的主要有效成分，但其結構較為復雜，遇酸、堿或高溫等不穩定，易引起分解，對其含量進行檢測顯得更加重要［3］。連翹酯苷A的檢測方法目前有薄層色譜法、毛細管膠束電動色譜法、質譜聯用法、紅外光譜法、高效液相色譜法、UPLC-MS/MS法等［4-5］，其中高效液相色譜法具有高速高效、高靈敏度、應用范圍廣等特點，已廣泛應用于連翹酯苷A的含量測定［6-7］。蒙藥制劑甘露解毒丸無現行質量標準，試驗建立測定連翹酯苷A含量的高效液相色譜法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV2700紫外-可見分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］；BSA124S電子天平［型號：（0.1 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；BT125D電子天平［0.01 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；KQ-5200DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 連翹酯苷A 對照品（批號：111810-201707；中國食品藥品檢定研究院，純度為97.2%）；供試品：甘露解毒丸由內蒙古自治區國際蒙醫醫院提供（批號：20180514、20200316、20200440）。甲醇（色譜純；批號：20201102036；山東禹王和天下新材料有限公司）、乙腈（色譜純；批號：20200528118；山東禹王和天下新材料有限公司）、冰醋酸（色譜純；批號：20200415；天津市大茂化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85）；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。理論板數按連翹酯苷A計不低于3000且分離度良好，高效液相色譜圖如圖1所示（連翹酯苷A峰保留時間為37.21 min）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取甘露解毒丸，研細，精密稱取約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，稱定重量，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱定連翹酯苷A對照品，加入甲醇制成濃度為每1 mL約含0.1 mg的溶液，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液（除去連翹外其余藥材按原藥方配比）。

2.3 專屬性試驗 精密吸取“2.2.3”項下的陰性樣品溶液10μL，按“2.1”項下的色譜條件試驗測定。結果表明，陰性樣品對連翹酯苷A的含量測定結果無明顯干擾（圖1）。

2.4 線性范圍 取連翹酯苷A對照品約5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻（含連翹酯苷A 0.1 mg/mL），吸取上述溶液1 μL、2 μL、4 μL、10 μL、12 μL、14 μL分別進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定，以對照品量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y= 2302379X + 2377，r=0.9999（n=6）。結果顯示連翹酯苷A在0.1～1.4μg范圍內呈現較好的線性關系（圖2）。

2.5 精密度試驗 按“2.2.2”項下對照品溶液制備方法配置對照品溶液，重復進樣5次。結果顯示連翹酯苷A對照品峰面積的RSD為0.40%（n=5），表明精密度良好。

2.6 重復性試驗 取相同批次樣品（批號：20180514）6份，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法，制備樣品，按“2.1”項下的色譜條件試驗，測定6份樣品的含量，結果顯示6批樣品的平均含量為0.7227 mg/g，RSD為0.74%（n=6），表明重復性良好（表1）。

2.7 穩定性試驗 精密吸取樣品溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h進行測定，記錄各個時間點的色譜峰面積，結果顯示樣品溶液中的連翹酯苷A在12h內峰面積基本保持穩定，RSD為0.80%（n=5），表明樣品在12 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗 取已知含量的樣品（0.7227 mg/g）粉末9份，每份取約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，3個具塞錐形瓶中精密加入0.2120 mg/mL的連翹酯苷A對照品溶液0.85 mL（約相當于供試品含量50%）、70%甲醇25 mL，另3個具塞錐形瓶中加入上述對照品溶液1.7 mL（約相當于供試品含量100%）、70%甲醇25 mL，剩余3個具塞錐形瓶中加入上述對照品溶液2.4 mL（約相當于供試品含量150%）、70%甲醇25 mL，按“2.1”項下的色譜條件試驗，分別記錄色譜圖，計算平均回收率為93.34%，RSD為1.26%（表2）。

2.9 樣品含量測定 取甘露解毒丸樣品，按“2.1”項下的色譜條件試驗并測定含量，結果顯示2批樣品平均含量為0.7770 mg/g，RSD為0.93%（表3）。

3 討論

3.1 選擇流動相 參照《中國藥典》2020年版一部“連翹”項下的連翹酯苷A含量測定方法［8］，以乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85）為流動相，進行實驗分析，供試品中連翹酯苷A與其他成分達到較好的分離，理論塔板數較高，保留時間適宜，故作為檢測流動相。

3.2 流速的選擇 考察提取條件時，選擇1.0 mL/min的流速，隨著實驗的進行，雖然持續清洗色譜柱，柱壓仍偏高，故考察了0.8 mL/min流速，柱壓相對理想，且含量無明顯差異，故本次實驗流速選擇為0.8 mL/min。

3.3 檢測波長的選擇 通過考察連翹酯苷A的紫外光譜得出其在330 nm處有最大吸收，故選擇330 nm作為檢測波長。

3.4 提取效率的考察 試驗分別考察了以70%甲醇作為提取溶劑，20 min、30 min、40 min超聲處理提取。結果顯示超聲時間為30 min時，供試品中連翹酯苷A的含量保持相對穩定，故將提取時間設定為30 min。

3.5 提取溶劑的考察 以“3.4”項下選定的30 min作為提取溶劑超聲提取時間（功率250 W，頻率40 kHz），試驗考察了25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇3種不同提取溶劑對提取效率的影響。結果表明用70%甲醇作為提取溶劑時，樣品中連翹酯苷A的含量最高，故將提取溶劑確定為70%甲醇。

3.6 色譜條件耐用性考察 采用SHISEIDO CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和SHIMADZU Wonda Cract ODS-2 C18兩種不同廠家的色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按“2.1”項下的色譜條件分別試驗，結果表明兩種不同廠家色譜柱分離效果良好，含量測定結果無明顯差別，表明耐用性良好。

當前，蒙醫藥事業的發展受到全社會的廣泛關注，蒙藥制劑源于與疾患斗爭經驗的藥方，有著悠久的歷史、豐饒的資源和鮮明的民族特征，其藥效顯著、使用廣泛、受眾者廣。近年來，有關蒙藥制劑的研究發展速度較快，目前已經運用色譜分離、波譜分析等方法對其中所含的化學成分進行廣泛而深入地研究［9-11］。與此同時，蒙藥制劑現行質量標準存在著質量控制指標單一、藥效關聯性不強等問題［12-13］。試驗首次建立了高效液相色譜法測定甘露解毒丸中連翹酯苷A的含量，方法便捷科學、準確穩定，為建立相應制劑的質量標準提供了依據。

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（收稿日期：2023-05-17 編輯：陶希睿）

作者簡介：樛躍（1986—），女，漢族，碩士，工程師，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：1221sep@163.com