蒙古黃芪葉綠體全基因組特征解析及親緣性分析

李俊霖，郭淑紅，張 強，張麗君，田洪嶺*，張 瓊*

1.山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001

2.山西農業大學經濟作物研究所，山西 太原 030031

3.山西農業大學 農業基因資源研究中心，山西 太原 030031

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.干燥的根，是人們熟知的一種藥食同源型植物，在中國的山西、內蒙古、東北等地廣泛栽培[1]。黃芪具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫的功效，常用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷等疾病[2]。目前，黃芪的化學成分主要包括多糖、黃酮類和三萜類等，其藥理作用廣泛，包括增強免疫功能、抗腫瘤、保護心腦血管系統、保護內臟、調節機體代謝、保護神經系統等[3]。

在植物進化中，葉綠體內的遺傳信息具有母系遺傳的特性[4]。葉綠體基因組的遺傳信息相對于核基因組更加獨立和保守，表現出半自主的遺傳特征，其編碼基因的數量、結構、組成和排列順序在大部分情況下保持一致，極少發生重組變異[5]。因此，葉綠體基因組在植物的物種鑒定、系統發育和物種起源的研究中得到了廣泛應用[6-8]。高等植物葉綠體基因組通常由1 個大單拷貝區域（large single copy，LSC）、1 個短單拷貝區域（small single copy，SSC）、和2 個反向重復區域（inverted repeats，IRs）組成，形成一種典型環式雙鏈DNA 結構，大小通常為120～180 kb[9-10]。高通量測序技術的發展為研究藥用植物葉綠體基因組提供了更加快捷、準確的方法。通過對蒙古黃芪近緣物種進行葉綠體基因組的比較分析，可以有效地確定不同種群之間的親緣關系，研究物種起源、分化和進化過程[11-12]。

目前，關于黃芪葉綠體基因組的研究集中在葉綠體基因組密碼子偏好性分析[13]，葉綠體基因組的基因丟失和倒位[14]，鮮有黃芪葉綠體全基因組結構特征及系統發育分析的報道。本研究完成了蒙古黃芪葉綠體基因組測序、組裝和注釋的工作，分析其結構、GC 含量、基因組成、密碼子使用度、簡單重復序列、葉綠體基因組序列變異，并構建系統發育樹，為進一步研究黃芪的遺傳結構、遺傳多樣性及親緣性奠定理論基礎。

1 材料

測序對象采自山西農業大學經濟作物研究所（37°24′05′′E，111°78′65′′N）選擇生長狀況良好、干凈、無病蟲害的蒙古黃芪嫩葉，放置?80 ℃冰箱備用，憑證標本存放于山西農業大學經濟作物研究所。蒙古黃芪及其近緣物種的葉綠體全基因組序列來源于NCBI 數據庫，測序獲得蒙古黃芪葉綠體基因組（Astragalus.mongholicuschloroplast genome，AMCP）（表1）。

表1 植物樣品信息Table 1 Information of plant samples

2 方法

2.1 DNA 提取和測序

采用植物DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech 有限公司，中國）提取蒙古黃芪嫩葉片DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（Nanodrop 2000，美國）檢測提取的DNA 質量和濃度。將符合要求的樣品進行測序，測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

2.2 高質量序列獲取

研究采用全基因組鳥槍法（whole genome shotgun，WGS）策略，借助二代測序技術（nextgeneration sequencing，NGS），使用 Illumina NovaSeq 測序平臺，構建名為Lib_Name 的文庫。本研究使用fastp 進行數據質量控制，濾過生成高質量序列。采用AdapterRemoval（version 2）[15]去除3’端的接頭污染，采用滑動窗口法進行質量過濾，計算窗口內堿基的平均Q值，若Q值＜20，刪除窗口內的堿基；若Q值≥20，則停止滑動。若雙末端中任意1 條reads 的長度≤50 bp 和雙末端中N 堿基的個數≥5，則去除該雙末端序列，以確保數據集中包含的序列都具有足夠的長度和足夠的質量。

2.3 葉綠體基因組組裝與注釋

采用GetOrganelle v1.7.7.0 軟件，進行葉綠體DNA 序列的拼接。將拼接得到的完整的葉綠體基因組序列上傳至Geseq 網站（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）進行功能注釋。在Organellar Genome DRAW（OGDRAW）繪制葉綠體全基因組圖譜，把最終注釋的葉綠體基因組上傳GenBank 中獲得登錄號（OR712437）。

2.4 密碼子和簡單重復序列分析

運用CodonW 分析葉綠體基因組的密碼子，獲得有效密碼子（effective number of codon，Nc）、GC含量、相對同義密碼子使用值（relative synonymous codon usage，RSCU）和第3 位上的GC 堿基的含量（GC3s）。使用MISA 檢測葉綠體基因組的重復簡單序列（simple sequence repeats，SSRs）。參數設置為單核苷酸序列，重復≥8 個單位；二、三核苷酸重復序列，重復≥4 個單位；四、五及以上核苷酸重復序列，重復≥3 個單位，且2 個SSRs 之間的距離≥100 bp[16]。

2.5 葉綠體全基因組比較分析

通過 mVISTA （ https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml）做全基因組對比，用shuffle-LAGAN 模式檢測變異情況，以蒙古黃芪（OR712437）為參照，與已公布的16 種豆科植物的葉綠體全基因組序列進行全基因組對比及差異性分析。

2.6 系統發育分析

為了解蒙古黃芪在黃芪屬的系統發育位置，從NCBI 數據庫中下載葉綠體全基因組，共計17 個物種，分別為草木樨狀黃芪（NC_072247）、蒙古黃芪（NC_029828）、細葉黃芪（OP723862）、乳白黃芪（NC_058825）、斜莖黃芪（NC_052923）、阿納卡黃芪（NC_028171）、膜莢黃芪（KX255662）、加拿大黃芪s（NC_060799）、糙葉黃芪（NC_058245）、膠黃芪（NC_047251）、背扁黃芪（NC_065023）、彎花黃芪（ON550404）、酒泉黃芪（ON550402）、巖生黃芪（ON550399）、尖舌黃芪（ON550396）、此外苜蓿（KU321683）被用作外群（表1）。利用MEGA 11 軟件運用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統發育樹，設置Bootstrap 為1 000[17]。

3 結果與分析

3.1 葉綠體基因組的結構

對蒙古黃芪的葉綠體基因組分析發現該結構呈現非典型四分體結構，由3 個區域構成：1 個LSC、SSC 和1 個IRs，故蒙古黃芪屬于反轉區缺失植物類群（inverse region losing cloud，IRLC）（圖 1）。測序獲得葉綠體基因組全長為123 349 bp，GC 含量為34.09%，獲得注釋基因109 個，包括4 個核糖體RNA（rRNA）基因、29 個轉運RNA（tRNA）基因和76 個蛋白編碼基因（coding sequence，CDS）（表2）。蒙古黃芪葉綠體基因組上共編碼29 個tRNA，其中含1 個內含子的有4 個（trnA-UGC、trnE-UUC、trnK-UUU、trnL-UAA）。

表2 蒙古黃芪AMCP 葉綠體基因組上的基因Table 2 Genes located on chloroplast genome in AMCP

3.2 密碼子偏好性分析

從注釋的葉綠體密碼子分析發現，64 個蛋白共編碼了41 116 個密碼子。由于遺傳密碼子具有簡并性，色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）只有1 個密碼子，其余均有2 個及2 個以上的密碼子，RSCU＞1 的密碼子共29 個，占總量的62.42%，其中除了精氨酸（Arg）密碼子AGA 的RSCU 值＞2，其余的密碼子的RSCU 值均在1～2，表明蒙古黃芪葉綠體基因組中不存在偏好性極強的密碼子（表3）。其中使用頻率最高的是亮氨酸（Leu），使用頻率為9.71%，其次是異亮氨酸（Ile），使用頻率為9.45%，最低的是色氨酸（Trp），使用頻率為1.48%。除了色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）外，大多數氨基酸密碼子具有偏好性（圖2）。把16 種黃芪屬植物和1 種苜蓿屬植物葉綠體基因組進行密碼子偏好性比較分析，可知Nc 值范圍在53.03～54.13，說明葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱。葉綠體基因組的GC3s 含量為20.62%～23.44%，GC 含量范圍均低于50%，說明豆科植物葉綠體基因的密碼子偏向使用A 和U 這2 種堿基（表4）。

圖1 蒙古黃芪AMCP 葉綠體基因組的基因圈圖Fig.1 Gene map of chloroplast genome in AMCP

圖2 蒙古黃芪AMCP 葉綠體基因組相對同義密碼子使用度Fig.2 RSCU value of chloroplast genome in AMCP

表3 蒙古黃芪密碼子信息Table 3 Codon usage of AMCP

表4 17 種豆科植物葉綠體基因組密碼子使用的總體特征Table 4 Overall characteristics of codon usage of 17 legume species chloroplast genomes

3.3 簡單重復序列SSR 分析

共檢測到AMCP SSR 位點263 個，包括149 個單核苷酸重復序列、90 個二核苷酸重復序列、12 個三核苷酸重復序列、11 個四核苷酸重復序列、1 個五核苷酸重復序列。測序的蒙古黃芪以單核苷酸A/T 重復為主，占比總SSR 位點數的56.27%（表5）。同時對16 種黃芪屬植物和1 種苜蓿屬植物葉綠體基因組進行簡單重復序列分析，檢測到SSR 位點241～268，其中A/T 占比范圍為55.11%～71.72%，說明可知豆科植物多數以A/T 重復為主，少有其他類型的重復（表6）。

表5 蒙古黃芪葉綠體基因組的SSRsTable 5 SSRs in chloroplast genome of AMCP

3.4 葉綠體全基因組比較分析

以蒙古黃芪（OR712437）的葉綠體基因組序列作為參考，對其余16 種豆科植物進行葉綠體基因組進行比較分析（圖3）。結果表明，17 條葉綠體基因組的4 個基因區大致相同，差異性較小。從非編碼區和編碼區看，非編碼區域序列變異高于編碼區域，但在ycf1、ycf2等基因編碼區變異程度較大。trnF-GAA～trnT-UGU、trnfM-CUA～psbC、trnE～trnD、psbM～rpoB、trnR-UCU～trnQUUG、petL～rpl133、rps7～trnV-GAC、rrn5s～trnGUU、trn-UAG～ndhF等區間的存在較大的差異。

圖3 17 種豆科植物葉綠體基因組對比分析Fig.3 Alignment analysis of 17 legume species chloroplast genomes

3.5 系統發育分析

通過構建黃芪屬的系統進化樹，了解蒙古黃芪AMCP 在黃芪屬中的近緣關系，將其和16 種豆科植物的葉綠體基因組進行親緣性分析。結果顯示豆科2 個屬的17 種植物具有明顯的進化關系，可以聚為3 大類，第一支由細葉黃芪（OP723862）、加拿大黃芪（ N_C060799 ）、草木樨狀黃芪（N_C072247）、巖生黃芪（ON550399）共14 個物種組成，第二支由背扁黃芪 （N_C065023）和糙葉黃芪（N_C058245）組成，苜蓿（KU321683）單獨聚為一類。由系統進化樹可知，蒙古黃芪（OR712437）、膠黃芪（N_C047251）、阿納卡黃芪（N_C028171）、膜莢黃芪（KX255662）親緣關系最近，其中蒙古黃芪（OR712437）與膠黃芪（N_C047251）的自展支持率為100%，說明兩者的遺傳關系最近（圖4）。

圖4 基于17 種物種葉綠體全基因的NJ 系統發育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree based on 17 species of complete chloroplast genomes

4 討論

大多數被子植物的葉綠體基因組呈現典型的四分體結構，而部分豆科植物葉綠體基因組由于在進化過程中發生多次重排，從而導致缺失1 個IR 區被歸為IRLC 類群[18]。本研究測序獲得蒙古黃芪葉綠體基因組缺少1 個IR 區，呈現出非典型的四分體結構，故蒙古黃芪屬于豆科蝶形花亞科的IRLC類群，與雷萬鈞[16]研究的結論一致。同時，蒙古黃芪葉綠體基因組上存在未知功能的基因，如ycf1、ycf2和ycf4，還有待研究。本研究測序獲得的蒙古黃芪有29 個tRNA，與2016 年測序獲得蒙古黃芪的tRNA 在數量和種類上存在差異。這反映出蒙古黃芪基因組的多樣性，也為應對不同的生物學需求，從而導致tRNA 的數量和種類發生變化，以滿足特定的代謝和蛋白質合成需求，同時反應出葉綠體基因組的檢測手段不斷發展完善。

密碼子偏好性分析在植物葉綠體基因組的蛋白質編碼基因過程中起著重要的作用，與突變、自然選擇和隨機遺傳漂變等分子進化現象密切相關[19]。大多數氨基酸可以同時被多種密碼子編碼，表現出不同生物對密碼子的使用具有一定的偏好性[20]。蒙古黃芪葉綠體基因組中64 個蛋白編碼基因共編碼出41 116 個密碼子，除色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）的RSCU＝1，有29 個氨基酸的RSCU＞1。17 種豆科植物的Nc 值范圍為53.04～54.13，說明葉綠體基因組的密碼子使用偏好性較弱。葉綠體基因組的GC 含量和GC3s 含量均小于50%，可知豆科植物葉綠體基因組的密碼子偏向使用A 和U 這兩種堿基，這與Nie 等[21]關于雙子葉植物葉綠體基因組中的密碼子偏好性分析的結論一致，表明密碼子使用在雙子葉植物遺傳進化中具有保守性和普遍適用性。其中，GC 含量和GC3s 含量相似可以推斷出這17 個物種在進化過程中存在一定的關聯。

SSR 也被稱為微衛星，高度變異且數量豐富，具有保守性、多態性高、分布廣泛等特點，廣泛應用于物種鑒定，遺傳多樣性、分子輔助育種等方面[22-24]。本研究通過對蒙古黃芪（OR712437）和其余的16種豆科葉綠體全基因組序列進行簡單重復序列分析，發現以A/T 堿基重復為主，這與張潔等[25]和向如雙等[26]關于豆科植物重復序列研究結論相吻合。通過了解重復序列的分布特點可以進一步研究豆科植物基因組的整體結構和基因的穩定性，從而用于研究種間和種內的親緣關系和統發育關系。

葉綠體基因組為系統發育提供了很多重要的分子片段[27]，多種基因、內含子和基因間隔區已經被使用在不同分類階元的系統發育重建過程中，如atpB、atpB-rbcL、matK、ndhF、rbcL等[28]。植物DNA條形碼常用于植物鑒定、植物分類的研究中，如atp-F、matK、psb-I、rbcL、rpoB、rbcL、trnH-psbA等片段是研究植物DNA 條形碼的重要選擇[29-30]。常晶茹等[31]用ITS2、matk、rbcL和psbA共4 種片段對吉林產的10 種黃芪屬植物進行DNA 條形碼與聚類分析，其結論為單獨用某一片段只能鑒別出部分植物，不能把10 種黃芪屬植物全部鑒別出來。本研究基于mVISTA 的葉綠體基因組序列對比分析得到trnF-GAA～trnT-UGU、trnfM-CUA～psbC、trnE～trnD、psbM～rpoB、ycf1和ycf2等編碼區的差異性大，也可以用于黃芪屬植物DNA 條形碼的開發，為黃芪屬藥材品種鑒別、種質資源評價以及種苗篩選提供有效工具，達到解決種源混雜的目的。

本研究采用鄰接法構建系統發育樹，所獲得系統發育樹中各類群間的拓撲結構與經典分類學的觀點一致：外類群苜蓿單獨聚為一類，剩下的黃芪屬聚為一大類，其中膠黃芪 （N_C047251）、阿納卡黃芪（N_C028171）在《中國植物志》沒有收錄，對于兩者屬于何種亞屬目前缺少研究。根據本研究，蒙古黃芪（OR712437）、膠黃芪、阿納卡黃芪、膜莢黃芪（KX255662）聚為一類，可以推測出膠黃芪、納凱黃芪與蒙古黃芪（OR712437）、膜莢黃芪的遺傳關系相近，與Tian 等[32]聚類結果相似，為后續研究膠黃芪、阿納卡黃芪的分類提供參考。

本研究通過測序、組裝和文庫構建，對蒙古黃芪葉綠體全基因組特征進行描述，分析了黃芪屬植物葉綠體基因組的序列特征并構建系統發育樹，為進一步探究黃芪屬植物的遺傳結構、遺傳多樣性和親緣性奠定了基礎。同時，豐富了黃芪屬藥用植物的葉綠體基因組數據，為黃芪屬的物種鑒別、群體結構分類和進化發育等研究提供科學參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突