漆酶在食品分子修飾和食品膠體體系中的應用

葛懌澤 辛嘉英 劉思淼 鎖博海 宋增武 夏春谷

摘要：近年來，改善食品分子的功能和營養特性一直是研究的熱點。食品分子的酶促修飾可用于增強其在食品中的功能性質。漆酶可催化蛋白質、多糖和多酚的氧化，在食品分子以及食品膠體的構建中具有巨大的應用潛力。文章總結了漆酶的結構、來源、對食品分子修飾的催化機制及其在食品膠體體系中的應用。研究發現漆酶分兩步催化食品分子的氧化：第一步涉及產生自由基或醌的酶促反應；第二步涉及自由基或醌與其他分子的非酶促反應。漆酶在整個過程中主要起著引發反應的作用。由漆酶誘導的食品分子交聯有助于改善食品分子的性質和功能，從而增加食品分子的功能性質、擴展用途，以及改善食品膠體體系（如乳液、納米顆粒和微凝膠）的形成和穩定性，從而增強它們封裝、保護和遞送生物活性化合物的潛力。

關鍵詞：漆酶;催化;自由基;交聯;食品膠體體系

中圖分類號：TS201.25????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0209-07

Application of Laccase in Food Molecular Modification and Food Colloid Systems

Abstract： In recent years， improving the functional and nutritional characteristics of food moleculars has been a research hotspot. Enzymatic modification of food moleculars can be used to enhance their functional properties in food. Laccase can catalyze the oxidation of proteins， polysaccharides and polyphenols， and has great potential for application in the construction of food moleculars and food colloids. In this paper， the structure， source， catalytic mechanism of laccase on food molecular modification and its application in food colloid systems are summarized. It is found that laccase catalyzes the oxidation of food moleculars in two steps： the first step involves enzymatic reactions that produce free radicals or quinones; the second step involves non-enzymatic reactions of free radicals or quinones with other moleculars. In the whole process， laccase mainly plays a role in initiating the reaction. Cross-linking of food moleculars induced by laccase helps to improve the properties and functions of food moleculars， thus increasing the functional properties of food moleculars and expanding their applications， as well as improving the formation and stability of food colloid systems （such as emulsion， nanoparticles and microgels）， so as to enhance their potential to encapsulate， protect and deliver bioactive compounds.

Key words： laccase; catalysis; free radicals; cross-linking; food colloid system

漆酶（laccase，EC1.103.2）是一種含銅離子的氧化酶，屬于多銅氧化酶家族[1]。漆酶廣泛存在于細菌、真菌、植物和昆蟲中，其中在真菌漆酶方面的研究最多[2]。漆酶通常被認為是綠色催化劑，因為它們能夠在分子氧的存在下將化合物氧化為自由基，副產物只有水[1]。

許多食品中的蛋白質和多糖具有良好的增稠、膠凝、乳化特性等[3-4]，因此，它們可用于改善食品的外觀、質地、穩定性等。然而，天然食品分子的性質和范圍有限，不能滿足商業化的要求，因此，有必要采用綠色、安全和有效的方法對食品分子進行修飾，以擴展其功能特性。目前的修飾方法包括物理、化學、酶和基因工程方法[5-8]。物理方法不易控制。有些化學交聯劑在食品中已經得到廣泛應用，但人們仍擔心其潛在的毒性[9]。食品中是否可以使用轉基因成分存在爭議。而酶因其高效的特異性、催化效率以及作用條件溫和的優點而受到青睞。目前的商品酶具有出色的功能特性，包括對pH、鹽和溫度變化的高抵抗力、快速反應速率和高底物利用率[10-11]。

漆酶廣泛用于構建食品膠體體系，如形成和穩定乳液、納米顆粒和凝膠[12]。食品中最常用的乳液是水包油（O/W）、油包水（W/O）和雙重乳液（W/O/W）[13]。納米顆粒因其較大的比表面積和較小的尺寸，在食品中表現出獨特的功能屬性，可改善營養素的分散性、穩定性[9]。食品凝膠由相互作用的生物聚合物分子或分散在水中的膠體顆粒網絡構成，可用于封裝和釋放生物活性物質。本文總結了漆酶對食品分子性能的影響，并且強調了漆酶在改善或擴展食品膠體特性方面的應用。

1 漆酶的結構

漆酶是含銅離子的糖蛋白，其肽鏈包含500～600個氨基酸，糖配基占整個分子的10%～45%。一般來說，銅原子是漆酶結構的共同特征，與漆酶的氧化還原功能緊密相關[14]。銅離子是漆酶結構中最重要的組成部分，它們參與構建漆酶活性中心，決定漆酶的特異性和活力，使漆酶具有氧化還原功能；與此同時，銅離子也直接參與鍵斷裂和形成過程，是漆酶結合底物的區域[15]。漆酶通常包含4個銅原子和3個銅原子的結合點，根據磁性和光譜特性的差異，可以分為T1銅原子、T2銅原子、T3銅原子三類[16]。T1銅原子相對獨立，與1個半胱氨酸（Cys）的S和2個組氨酸（His）的N配位，形成扭曲的四面體結構。其中還原態底物的結合位點是共價鍵Cu-S（Cys）的配位，漆酶在該結合位點附近接受來自底物的電子轉移，從而將底物徹底氧化，使得T1銅原子在614 nm處產生強烈的藍色特征吸收帶[17]，由此漆酶也被稱為銅藍蛋白。T2銅原子具有電子順磁共振效應（electron paramagnetic resonance，EPR）的性質，無特殊吸收峰，T3銅原子與其緊密相連形成一個三核中心，同時這個三核中心也是漆酶的催化活性中心。此三核中心與8個His配位結合，其中T3銅原子結合6個His，T2銅原子結合2個His。T3銅原子由2個銅原子組成，由于其發生氧化偶聯作用，T3銅原子的EPR性質消失，但在330 nm處有寬的吸收峰[18]。同時，一些反應中間體如過氧中間體的吸收，也會致使T3銅原子在400～460 nm或420～460 nm之間出現一些小的吸收帶[19]。漆酶的活性中心結構見圖1[20]。

2 漆酶的催化機制

漆酶介導的反應包括4個單電子底物氧化、電子向分子氧的轉移以及產生2個水分子的副產物三部分。反應過程中形成的自由基將進行進一步的反應，例如胺化、氧化、環化、二聚或聚合，直到形成最終且更穩定的產物[21-23]。漆酶能夠催化氧化酚類和非酚類底物的單電子氧化，生成自由基中間體，之后這些中間體會參與到氧化偶聯或底物鍵斷裂的過程，最終導致底物發生氧化、降解或聚合反應等。酶促反應過程主要包括漆酶分子對底物的氧化作用、電子在漆酶分子中的傳遞、氧分子對漆酶分子的還原以及產物的反作用[24]，在此過程中T1活性位點的銅離子從還原態的底物中吸收電子，這時底物被氧化形成自由基中間體，從而導致不同非銅簇的次級反應，如羥化、歧化和聚合反應等。在漆酶分子的整個催化循環反應過程中，主要表現為4個底物分子被氧化形成自由基中間體，單個分子的氧被還原成2個分子的水 [25]。開始時反應底物與處于酶活性中心的T1銅原子位點相結合，T1銅原子接受來自還原態底物的電子轉移，同時該底物被氧化形成自由基；然后，T1銅原子將單個電子通過Cys-His途徑傳遞到由T2和T3銅原子組成的三核中心上，分子氧在三核中心處接受電子，被還原成水[19]。漆酶的催化機制通常涉及從底物中提取單個電子以產生活性自由基。這些自由基是重要的中間產物，通過偶聯反應產生二聚物、低聚物、聚合物等（見圖2）[1]。

3 影響漆酶催化氧化的因素

溫度、pH和金屬離子等都會對漆酶的催化活性產生影響。漆酶的最適反應溫度在25～85 ℃之間，其中大部分在50～60 ℃仍能保持穩定，不同來源的漆酶及其不同的反應底物也會造成最適溫度的差異。漆酶的最適pH范圍為4～6，一般來說，酸性pH時漆酶的催化活性更高[25]。金屬離子如 K+ 、Ag+ 、Cu2+、 Mg2+、Ca2+、Zn2+等對漆酶活性也會產生重要影響。漆酶活性增加可能是由于這些金屬離子與電子傳遞系統中的Cu2+產生競爭，導致酶和底物之間的正合作關系。當然，一定濃度的Cu2+可以促進漆酶活性的增加[26]。Zhuo等[27]探究幾種金屬離子對漆酶活性的影響，結果發現在實驗10 d后Cu2+、Fe2+、Mn2+、Cd2+ 均會使胞外漆酶活性有所增加，其中Cu2+效果最顯著。然而有些金屬離子卻會抑制酶促反應，比如銅離子螯合劑。也有一些金屬離子會對漆酶活性產生抑制作用。研究發現，Co2+、Ni2+、Cd2+、Fe3+等對漆酶活性的抑制作用很強，其原因可能是在反應過程中，這些金屬離子占據漆酶的活性中心，使漆酶的結構發生變化，造成底物與漆酶正常結合受阻，從而抑制了漆酶活性[28]。

4 漆酶催化修飾對食品分子性能的影響

漆酶對蛋白質、多糖、多酚類等食品分子結構和性質會產生影響或者使其一些方面的性能得到改善，見表1。

4.1 蛋白質

漆酶可以改善蛋白質的性質和功能。Li等[29]研究發現馬鈴薯蛋白的交聯可單獨通過漆酶或漆酶-阿魏酸體系實現。馬鈴薯蛋白在交聯后表現出相似或略微增強的溶解度。交聯后觀察到馬鈴薯蛋白的乳化特性得到改善。經過毛云芝菌漆酶6 h處理的交聯馬鈴薯蛋白也表現出良好的發泡性，這些蛋白質表現出增強分子靈活性和輕度交聯程度的特征。通過測定漆酶催化醇溶蛋白氧化過程中的耗氧量、醇溶蛋白分子量、力學性能、水穩定性、熱性能和醇溶蛋白纖維的形態，以證明漆酶作為醇溶蛋白交聯劑的作用。經漆酶處理的小麥醇溶蛋白纖維的機械性能和水穩定性顯著提高。用漆酶處理的小麥醇溶蛋白的纖維具有更光滑和更均勻的表面，可以通過掃描電鏡觀察到漆酶介導的改性小麥醇溶蛋白纖維[30]。此外，漆酶對蛋白質與淀粉的共同體系也會產生影響。Fan等[31]研究漆酶（LAC）對蛋白質交聯和黑青稞面條（BHBN）體外淀粉消化的影響，結果表明，當LAC的添加量從0%增加到0.4%時，體外淀粉消化曲線顯示，初始60 min內淀粉體外消化速率（k1）從0.016 1 min-1顯著下降到0.008 3 min-1（P<0.05），300 min時最大水解度（C∞）從58.55%顯著下降至48.48%（P<0.05）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示，LAC誘導形成了越來越連續和緊湊的蛋白質網絡，從而更緊密地包裹淀粉顆粒。同時，在還原和非還原條件下觀察到十二烷基硫酸鈉可提取蛋白（SDSEP）含量呈顯著下降趨勢（P<0.05），表明LAC的添加促進了BHBN中蛋白質的交聯程度。當LAC添加量增加（0%～0.4%黑青稞粉）時，二酪氨酸的含量增加了12%，同時游離巰基和酚類物質減少（分別為17%和42%）。這些發現表明，LAC誘導的酚氧化可以通過將酚轉化為自由基來促進蛋白質交聯，從而在BHBN中引發二硫鍵和非二硫鍵（二酪氨酸）的形成。最后，LAC導致致密的蛋白質網絡結構，保護淀粉在淀粉水解的第一階段免受消化酶的攻擊，并降低BHBN中淀粉的消化率。

4.2 多糖

漆酶可以改善多糖的性質和功能。使用漆酶作為催化劑，在均相反應條件下用4-己氧基苯酚（HP）功能化殼聚糖。X射線衍射（XRD）顯示與純殼聚糖相比，漆酶/HP 處理的殼聚糖的結晶度有所降低。隨著初始HP和殼聚糖比值的增加，漆酶/HP處理的殼聚糖中接枝HP含量先上升后下降。漆酶/HP處理提高了殼聚糖中共聚物的熱穩定性[32]。此外，研究漆酶對無麩質面團流變學特性的影響發現，隨著漆酶活性的增加（0～3 U/g 面粉），面團的硫醇和總酚含量分別降低了28%和93%。T. versicolor漆酶能夠交聯酚類和硫醇，產生范圍廣泛的同型和異型偶聯物。由于漆酶催化了蛋白質和多糖與酚類物質的酯化交聯，經漆酶處理的面團的G′和G″均顯著增加。Tan δ隨著漆酶活性的增加而降低，表明面團的彈性增加。面團黏彈性的改善可使面團在醒發過程中保留足夠的二氧化碳，并生產出更易接受的無麩質面包[33]。以耐熱漆酶作為生物催化劑，將阿魏酸的氧化產物與柑橘果膠結合，從而獲得功能性增強的新型果膠。結果證明阿魏酸的氧化產物和果膠的羧基之間形成了共價鍵，并且改性果膠的總酚含量顯著高于天然果膠。這種酶促過程將為果膠基聚合物提供新的思路[34]。

4.3 多酚

漆酶也可以改善多酚的性質和功能。Nemadziva等[35]使用小漆酶SLAC（天藍色鏈霉菌 A3（2）原生的雙結構域細菌漆酶）合成了β-β咖啡酸二聚體木層孔菌素A（Phellinsin A）。與咖啡酸相比，該二聚體的DPPH自由基清除能力提高了1.5 倍，而Trolox等效抗氧化能力（TEAC） 提高了 1.8 倍。 Phellinsin A還表現出在水性介質中改善的溶解度和在酸性pH值（pH值2.2和pH值5.5）下的顯著穩定性。此外，Wang等[36]選擇沒食子酸（GA）作為多酚模型，利用漆酶促進沒食子酸（GA）和大豆分離蛋白（SPI）的交聯，在中性pH條件下使用漆酶制備SPI-GA復合物。SPI-GA復合物改變了二級結構，β折疊減少，α螺旋和β轉角增加。漆酶催化的SPI-GA 復合物的 DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原能力顯著提高。據報道，將沒食子單寧（GT）作為介質的漆酶介質系統（LMS）引入酸溶脹膠原（ASC）薄膜中可以增強其強度。假設LMS 中的漆酶（LAC）將GT氧化為活性醌，與LAC的直接催化相比，后者更容易攻擊ASC，從而促進ASC的有效交聯和相關性能。結果發現，一方面，交聯對LAC和GT-LAC（即GT作為LMS中的介質）的ASC薄膜特性產生影響。當LAC劑量<12 U/g時，它對基于ASC薄膜的性能有積極的影響，例如機械性能、阻隔性能、耐水性和熱穩定性。另一方面，GT-LAC薄膜比LAC薄膜表現出更緊密的結構，更高的熱穩定性、機械性能和耐水性，證實了原先的假設，即在酸性條件下，相對高分子量的GT作為介質有可能提高LMS中LAC對膠原蛋白的交聯效率。GT介導的LAC交聯可以改善膠原材料的性能，使其成為增強可食用膠原包裝的潛在、有效且重要的方法[37]。

5 漆酶催化生物分子修飾在食品膠體體系中的應用

漆酶催化生物分子修飾在食品膠體體系中的應用十分廣泛，發揮著巨大潛能作用，見表2。

5.1 乳化劑

Sato等[38]探究了漆酶和阿魏酸處理對酪蛋白酸鈉在不同 pH 值（3，5，7）下穩定的水包油乳液特性的影響。結果發現漆酶處理和pH對性能產生強烈影響，從而影響酪蛋白酸鈉乳液的穩定性、結構和流變學。由于結構化程度更高，漆酶處理導致乳液顯示出剪切稀化行為。在接近蛋白質pI處，O/W乳液在pH為3和5時顯示出相分離，但漆酶處理提高了乳液的穩定性，尤其是在pH為3時，添加阿魏酸和漆酶產生具有更大液滴的乳液尺寸，但具有更窄的液滴尺寸分布，增加了黏度、假塑性和黏彈性（凝膠狀行為）。結果表明，漆酶和阿魏酸對蛋白質的交聯通過改變蛋白質在乳液結構和流變學上的功能機制來改善蛋白質的乳化性能，酪蛋白酸鈉在用漆酶處理后可以成功地用于酸性產品。此外，用漆酶交聯的US-α-LA（經超聲預處理的α-乳清蛋白）和US-α-LA 制備的各種乳液凝膠中，超聲預處理和漆酶交聯相結合提高了凝膠強度、持水力，并改變了α-LA 乳液凝膠的流變學性質。交聯US-α-LA 和US-α-LA的漆酶比對照具有更均勻和更致密的微觀結構。此外，具有漆酶交聯US-α-LA的乳液產生了一種自支撐彈性凝膠，穩定性較好，超過1個月沒有出現任何分離。由此可得出漆酶交聯US-α-LA后形成了更穩定的乳液凝膠[39]。研究發現云芝漆酶對含有親脂模型著色劑（尼羅紅）的結構化水包油乳液顏色穩定性產生影響。結果表明漆酶可用于乳液中以提高在環境壓力（例如溫度、離子強度或 pH 值變化）下的物理穩定性。然而，由于其會促進褪色，它的使用還是會受到限制[40]。

5.2 納米粒子

漆酶誘導的交聯反應也被用于促進食品分子形成納米顆粒。研究發現漆酶可用于交聯乳清蛋白和甜菜果膠中，在有機相中微乳化為液滴。液滴通過漆酶誘導的交聯和生物聚合物的原位凝膠化轉化為納米粒子?？Х纫蛟谏锞酆衔锏墓曹椛⒀b凝膠中的截留推遲了動態流變法指示的膠凝時間并降低了最終凝膠的強度。紅外光譜表明蛋白質和果膠在阿魏酸基團的參與下發生交聯。在合成過程中，咖啡因被封裝為顆粒內的模型生物活性化合物。所產生的共軛顆粒為球形并且具有納米級尺寸[41]。此外，漆酶已用于木質素納米顆粒的制備，具有更好的穩定性[42]。

5.3 凝膠

漆酶能促進蛋白凝膠特性的改變。Ruzengwe等[43]研究漆酶交聯對熱誘導原位形成的班巴拉花生蛋白凝膠（BPI）的流變學和微觀結構特性的影響。對BPI進行漆酶修飾可改善凝膠特性，其改善率與酶的劑量有關。在凝膠形成和穩定之前，通過流變學分析漆酶的添加（1～3 U/g）誘導蛋白質初步的結構分解（G″>G′）。隨著漆酶活性的增加（分別為0～3 U/g蛋白質），凝膠點溫度從85 ℃顯著降低到29 ℃，這表明形成了結構相對良好的凝膠。還有在高酶活性（>2 U/g 蛋白質）下緩慢發生蛋白質結構的初始分解，同時，觀察到凝膠點溫度顯著降低。并且在此活性下形成的凝膠外觀均勻，具有緊湊的板條狀結構。漆酶催化BPI的交聯與模型反應中硫醇和酚類含量減少、表面疏水性增加和氨基酸（谷胱甘肽、半胱氨酸和賴氨酸）交聯現象一致。疏水相互作用是BPI凝膠形成中的主要非共價相互作用。因此，證實用漆酶修飾BPI的確促進了具有均勻和致密網絡的凝膠的形成。據報道，來自Trametes versicolor的漆酶被用于制備大米谷蛋白/甜菜果膠復合凝膠。200 mmol/L鈣離子可改善復合凝膠的流變學、結構特性以及保水能力[44]。

在漆酶交聯阿拉伯木聚糖形成功能水凝膠的研究中，發現使用漆酶制備4%的阿拉伯木聚糖（AX）凝膠，會對阿魏酸二聚體異構體的比例以及所形成凝膠（LAX）的流變學、結構和光譜特性產生重要影響。LAX表現出較高的硬度值和更緊湊的結構網眼尺寸。顯微鏡顯示LAX凝膠存在連接鏈，在2 895 cm-1處的拉曼譜帶強度較低，表明與AX相比其氫鍵增強。此研究可以應用于食品和生物技術的 AX凝膠化[45]。此外，漆酶催化阿魏?；矁r交聯，在從玉米麩皮中提取的阿魏?；咸侨┧岚⒗揪厶侵行纬啥浒⑽核?，從而形成堅固的水凝膠[46]。

漆酶交聯也被用來誘導雙網絡凝膠。Liu等[47]利用漆酶和葡萄糖酸-δ-內酯（GDL）成功制備了雙誘導酪蛋白和阿拉伯木聚糖復合凝膠（酪蛋白/AX凝膠）。與單一酪蛋白凝膠相比，酪蛋白/AX凝膠的流變學和結構特性得到改善，這可能歸因于AX和酪蛋白分子共價和非共價相互作用的共存可以賦予凝膠三維網絡結構和更理想的物理化學性質，包括更強的凝膠強度、更高的熱穩定性、持水性和EGCG-加載效率。

6 展望

酶技術在改變天然食品成分，如蛋白質、多糖和酚類物質的特性方面具有巨大的潛力，能夠增強其功能特性。漆酶作為綠色催化劑，其催化的反應具有溫和的催化條件、高效的轉化能力、廣泛的底物范圍以及能催化某些特殊反應等特點，是優質的酶類選擇，預期在未來會有廣泛的應用。本文重點介紹了漆酶的結構、作用機制以及在食品分子結構和功能方面的應用，也重點介紹了漆酶對于食品膠體系統（例如乳液、納米顆粒和凝膠）功能特性的改善。目前，漆酶這種氧化還原酶在食品中應用的研究還比較有限。一系列食品分子酶促交聯的反應條件有待通過實驗進一步探索，如體外消化、細胞培養和動物飼養實驗等，這對于評估潛在功效和安全性至關重要。目前，關于漆酶在食品工業中的應用，部分學者正在進行大量研究活動，相信在不久的將來，會開發出更多具有實用價值的應用。目前來看，漆酶促進合成具有良好功能特性的新化合物以及蛋白質和多糖等聚合物的交聯從而得到目標產物，或許在將來有更好的應用前景[48]。但是目前也存在許多的問題阻礙著漆酶的工業化應用，酶的成本、回收利用等因素會限制酶促交聯技術的發展。缺少充足的漆酶供應來源、一些酶促反應的介質并不適合工業化應用等[49] ，同樣會對酶促交聯發展造成不利影響。因此，今后的研究應不斷尋找新的漆酶底物、降低漆酶的應用成本以及開創更加高效且經濟的介質系統。最后，擴大漆酶的生產規模，尤其是擴大其應用衍生產品的規模，對于降低成本和擴大市場至關重要[50]。

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