SPARCL1在動脈粥樣硬化斑塊形成中的作用研究

程 煦,陳心嚴,陳婷婷,程筱雯,朱華慶,葛圣林

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)及其引起的一系列并發癥是目前心血管疾病的主要致病因素,持續威脅人類健康[1]。AS被認為是一種慢性炎癥狀態,是由于血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞和其他細胞的不受控增殖所引起的[2-3]。目前,內皮細胞的功能障礙被認為是AS的啟動和加重的重要因素[4]。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteines like 1,SPARCL1)也被稱作Hevin、SC1以及ECM2,隸屬于SPARC家族(參與細胞黏附、遷移和增殖調節的細胞基質蛋白家族)[5]。SPARCL1廣泛表達于人體的各個組織中,但在如前列腺癌、非小細胞癌、卵巢癌以及結腸癌中表達下調[6],提示SPARCL1基因可能是一種潛在的腫瘤抑制基因。通過對人類主動脈硬化病變的外周血白細胞轉錄組的分析[7],以及對人AS斑塊的單細胞轉錄組的研究[8],SPARCL1已被視為與AS有關的新的候選基因,并且確定了SPARCL1在AS組織中的表達。并且發現,SPARCL1在AS斑塊中的表達增高[9]。然而SPARCL1參與AS的具體過程和作用尚不清楚。該研究旨在探討SPARCL1在AS斑塊形成中的作用,以期為深入探尋AS發生發展的分子機制以及有效的早期診療分子標志物提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 研究對象來自于安徽醫科大學第一附屬醫院2022年3月—2023年2月收治的394例已經過臨床確診為AS的患者。對照組來自于同時期年齡、性別匹配的394例健康對照人群,已排除心腦血管疾病,且無其他顯著疾病。免疫組織化學的組織切片來自于安徽醫科大學第一附屬醫院病理中心的臨床動脈組織標本。本研究所選取的樣本均來自安徽省。

1.1.2主要材料 人SPARCL1酶聯免疫分析試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,貨號:0-001493);DNA提取試劑盒、蛋白裂解液、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(山東思科捷生物技術有限公司,貨號:AA0902-A、EA0003、AC0202-A、AG0401、AH0301);DAB顯色液、通用型二抗、枸櫞酸抗原修復粉末(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:PV-6002、SAP9100、ZLI-9066);蘇木精(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:C0105S);3%過氧化氫(H2O2)(福州邁新生物技術開發有限公司,貨號:BLK-0001);多克隆抗 SPARCL1抗體(武漢三鷹技術有限公司,貨號:13517-1-AP);人外周血單核細胞分離液、人外周血中性粒細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P8680、P9040);高糖DMEM、小鼠單核巨噬細胞J774A.1(武漢普諾賽生物科技有限公司,貨號:PM150210、CL-0370);胎牛血清(南京維森特生物技術有限公司,貨號:085-150);BCA定量試劑盒(美國Thermofisher Scientific 公司,貨號:23225);ECL反應液(成都正能生物技術有限責任公司,貨號:17064);PMSF(北京金克隆生物技術有限公司,貨號:CS3215);蛋白Marker(上海生工生物工程有限公司,貨號:C600526);過表達質粒:pENTR-CMV-MCS-EF1a-copGFP質粒(貨號:LM1479,上海聯邁生物工程有限公司);shRNA質粒:pENTR-U6-CMV-EGFP質粒(貨號:NTCC510825,上海西圖生物科技有限公司)

1.1.3實驗儀器 酶標儀(型號:A51119700DPC);恒溫細胞培養箱(型號:51023126);NanoDrop one 微量核酸蛋白濃度測定儀(型號:ND-LITE-PR)(美國Thermofisher Scientific 公司);大容量臺式高速離心機(美國BECKMAN公司,型號:369003);正置顯微鏡(德國Leica公司,型號:DM2700-M);熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號:Roche LightCycler96)

1.2 方法

1.2.1ELISA測定血清SPARCL1表達水平 所有實驗操作均按照SPARCL1酶聯免疫分析試劑盒提供的說明書進行。酶標板設置標準孔、樣品孔(3個復孔)和空白孔,經加樣、加酶、溫育、洗滌等步驟后,在酶標儀中讀取吸光度值并計算各樣品濃度。

1.2.2人外周血中性粒細胞及單核細胞分離 采集AS患者及正常對照人群的新鮮抗凝全血,嚴格按照人外周血中性粒細胞及單核細胞分離試劑盒說明書進行操作,分離出AS患者及正常對照人群的外周血中性粒細胞及單核細胞。

1.2.3Western blot檢測SPARCL1蛋白表達情況 采集細胞后對細胞進行裂解、離心,得到細胞蛋白液。隨后使用BCA法對得到的蛋白液進行定量,計算出各樣品的蛋白濃度,將各樣品濃度調整相同,經過制膠、電泳、轉膜、封閉以及4 ℃孵育一抗(多克隆抗SPARCL1抗體,1∶200)12 h和室溫孵育二抗(通用型二抗,1∶5 000)2 h,最后經過顯影得到SPARCL1的蛋白條帶并拍照記錄。

1.2.4免疫組織化學實驗(immunohistonchemistry,IHC)評估SPARCL1蛋白在AS斑塊區的表達水平 將AS斑塊區組織石蠟切片分別置于二甲苯溶液、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、純水中進行脫蠟。隨后在枸櫞酸鈉緩沖液中修復抗原。加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。孵育結束后用PBS輕微沖洗3次,每次2 min。滴加適量多克隆抗SPARCL1抗體(1∶200)覆蓋全部組織,37 ℃孵育60 min,PBS沖洗3次,滴加通用型二抗,室溫孵育20 min,加入新鮮配置DAB顯色液,室溫孵育6 min,自來水沖洗后蘇木精復染20 s。封片、觀察。

1.2.5SPARCL1重組腺病毒包裝及驗證 合成SPARCL1 短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)反向互補引物以及SPARCL1 編碼序列(coding sequence,CDS)構建目的基因質粒,隨后將目的基因序列重組至腺病毒載體,獲得過表達和抑制表達重組腺病毒質粒,對重組質粒進行酶切,隨后進行轉染,轉染操作嚴格按照轉染說明書進行,對獲得的初級病毒液進行擴增、純化,得到SPARCL1過表達及抑制表達的重組腺病毒。在6孔板中培養小鼠巨噬細胞(J774A.1),待細胞長至60%時將病毒注射入6孔板內(每孔5 μl),板內設置空白對照,繼續培養,分別在24、48 h時熒光下拍照,觀察轉染效率。在60 h時收集細胞,提取細胞蛋白測量SPARCL1蛋白表達量并進行對比驗證。

1.2.6細胞劃痕實驗檢測SPARCL1對細胞增殖和遷移的影響 在細胞培養皿中培養小鼠巨噬細胞(J774A.1),待細胞鋪滿培養皿后均勻轉入細胞6孔板,待細胞長至60%每孔時分別于不同孔注入SPARCL1干擾病毒、SPARCL1過表達病毒。待細胞均勻鋪滿6孔板后(約48 h),使用200 μl槍頭垂直于板面在6孔板中劃出直徑約1 mm的直線,PBS清洗6孔板以洗去游離細胞,加入細胞專用無血清培養基培養,在劃痕后的0、12、24 h分別在顯微鏡下拍照記錄每孔劃痕直徑。

2 結果

2.1 研究對象的一般特征及SPARCL1在血清中的表達情況患者組與對照組男女所占比例均分別為54.8%及45.2%,平均年齡均為50.02歲。兩組研究對象的性別、年齡差異無統計學相關性,組間具有可比性。ELISA檢測結果顯示,患者組與對照組的血清SPARCL1濃度差異有統計學意義(P<0.01),即AS患者血清SPARCL1表達明顯低于正常對照。見表1。

表1 研究對象一般特征及SPARCL1血清濃度的比較

2.2 SPARCL1在AS斑塊中的表達情況對AS斑塊病變動脈組織免疫組織化學染色(SPARCL1呈棕黃色),AS患者的粥樣硬化斑塊部位的SPARCL1的表達量高于鄰近正常動脈組織,且主要表達在泡沫細胞胞質(圖1)。通過對比正常動脈和病變動脈的免疫組織化學染色發現,相比于正常對照人群,AS患者血清中SPARCL1表達量下降(t=2.97,P<0.05)。

圖1 SPARCL1在AS病變部位(B)以及正常動脈組織(A)中表達的IHC染色圖×200以及免疫組化SPARCL1表達量對比統計圖(C)

2.3 AS患者外周血中性粒細胞及單核細胞SPARCL1蛋白表達情況AS斑塊部位的成分細胞主要源于血液中的單核細胞和中性粒細胞的募集,Western blot 檢測結果顯示,兩組外周血中性粒細胞及單核細胞均有SPARCL1表達,并且AS患者的SPARCL1蛋白表達量均低于對照組(t=3.05、2.83,均P<0.01)(圖2)。

圖2 兩組細胞SPARCL1蛋白表達量的比較

2.4 SPARCL1過表達及抑制表達重組腺病毒的包裝效果驗證靶細胞感染24、48 h后,分別置于熒光顯微鏡下觀察并拍照,可見細胞中有熒光顯示,且48 h熒光數量>24 h。說明SPARCL1過表達及抑制表達重組腺病毒感染成功(圖3)。隨后培養至60 h提取細胞蛋白進行Western blot實驗檢測SPARCL1蛋白表達量,結果顯示,用SPARCL1過表達重組腺病毒感染的J774A.1細胞可觀察到SPARCL1蛋白表達水平上升(t=-2.19,P<0.05),用

圖3 腺病毒感染后熒光顯微鏡下拍照 ×20

SPARCL1重組腺病毒感染J774A.1細胞可觀察到SPARCL1蛋白表達水平降低(t=2.64,P<0.01),表明SPARCL1過表達和抑制表達重組腺病毒包裝成功(圖4)。

圖4 兩組細胞感染SPARCL1重組腺病毒后SPARCL1蛋白表達量的比較

2.5 SPARCL1對巨噬細胞遷移的影響細胞劃痕實驗結果顯示,SPARCL1抑制表達組的遷移距離低于對照組(t=3.12、-2.58,均P<0.05)。這表明SPARCL1參與到了巨噬細胞的遷移過程(圖5)。

3 討論

SPARCL1在1990年首次在大鼠中樞神經系統發現,并命名為SC1[5]。隨后又從非小細胞肺癌的內皮細胞和人扁桃體淋巴組織的高內皮小靜脈中克隆了Hevin的基因[10-11]。SPARCL1定位于染色體4q22-25,橫跨約47 kb的基因組。SPARCL1由N端酸性結構域、卵泡抑制劑樣結構域以及細胞外鈣離子結合域[9]組成。

目前關于SPARCL1的研究主要在其與癌癥的關系,其與AS之間關系的研究尚少。在以往研究[12]顯示,SPARCL1與血管壁穩定的維持有關。而AS發生的重要環節之一是血管內皮功能的障礙,因此SPARCL1可能參與AS發生過程。并且既往有學者[13-15]認為AS是一種血管壁的癌癥,它們在一些病理過程中較為相似,如:① AS和癌癥都有不受控制的細胞增殖[15];② 兩種疾病都有細胞粘附分子的變化,分別與動脈粥樣斑塊的形成和腫瘤細胞的遷移和侵襲有關[14];③ 都有相應的炎癥表現[13];④ 都與氧化應激密切相關[13];⑤ 有血管生成和細胞凋亡。提示SPARCL1有可能作為一種血管保護因素參與抑制AS的發生發展。

在2009年的一個通過對人類主動脈硬化病變的外周血白細胞轉錄組的研究[7]中,SPARCL1就被視為與AS有關的新的候選基因。最近,在對人類AS斑塊的單細胞轉錄組的研究[8]中顯示,SPARCL1在AS組織中表達。本研究也顯示SPARCL1在AS斑塊中表達升高,且 AS患者的血清SPARCL1水平明顯低于正常人,提示SPARCL1很可能參與AS的發生發展過程。

此外,本研究顯示AS患者及正常對照的外周血中性粒細胞及單核細胞均有SPARCL1表達,并且AS患者的表達量低于健康對照,免疫組織化學染色發現SPARCL1主要表達于AS斑塊中的泡沫細胞,這表明AS斑塊中高表達SPARCL1可能是由于在AS的炎癥過程中,將血液中的單核細胞和中性粒細胞募集至斑塊部位并隨后演變為泡沫細胞。

SPARCL1具有調節細胞的黏附、遷移和增殖的作用[5]。巨噬細胞在AS發生中的作用不可忽視,而SPARCL1是否參與了巨噬細胞在斑塊中的增殖或遷移過程,對斑塊形成的影響還需要進一步證明。本研究結果顯示,抑制SPARCL1表達的巨噬細胞遷移率降低,該結果為SPARCL1參與AS的具體過程提供了研究方向。

綜上所述,本研究證明AS病變部位泡沫細胞高表達的SPARCL1有可能來自于外周血單核細胞和中性粒細胞的代償性募集,SPARCL1可能作為血管保護因子參與抑制AS斑塊的發生發展。后續將通過繼續完善細胞表型實驗,建立SPARCL1基因敲除小鼠模型以明確SPARCL1影響AS斑塊形成的具體機制,探討SPARCL1成為AS診療新靶點的可能性。