響應面優化超聲提取綠色棉纖維總黃酮

陳沛 鮑軍秀 王斐 湯壽伍 劉海峰 李鴻彬

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.006

摘? 要：【目的】優化超聲提取綠色棉纖維中總黃酮工藝條件，為合理利用及鑒別天然綠色棉纖維提供依據。

【方法】以天然綠色棉纖維為原料，利用超聲空化效應加速黃酮溶解于乙醇中，在單因素試驗基礎上，結合Box-Benhnken中心組合原理及響應面設計優化試驗條件。

【結果】料液比為1∶50 g/mL時，總黃酮得率達到最大值，提取最適料液比為1∶50 g/mL，響應面試驗中建立的模型的CV值=0.87%，影響綠色棉纖維總黃酮得率的順序為提取時間＞乙醇濃度＞料液比，A料液比為1∶50 g/mL、B乙醇濃度50%、C提取時間50 min為最佳提取條件。

【結論】超聲波法提取綠色棉纖維總黃酮的最佳條件參數為料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度50%、提取時間50 min；獲得平均總黃酮得率為5.25%。

關鍵詞：綠色棉纖維；總黃酮；響應面法；最佳提取條件；超聲波細胞破碎

中圖分類號：S122??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0576-08

收稿日期（Received）：

2023-08-03

基金項目：

新疆維吾爾自治區創新環境建設專項（2020D14035）；新疆生產建設兵團科技攻關與成果轉化項目（2016AC017）

作者簡介：

陳沛（1996-），男，四川人，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學，（E-mail）554538275@qq.com

通訊作者：

李鴻彬（1980-），男，河南人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為植物分子生物學，（E-mail）lihb@shzu.edu.cn

劉海峰（1977-），男，湖北人，研究員，碩士生導師，研究方向為棉花遺傳育種，（E-mail）cncclhf@163.com

0? 引 言

【研究意義】天然彩色棉又稱為有色棉［1］，是纖維顏色除了白色以外具有其他色彩的棉花品種，其顏色主要是由于色素物質在纖維細胞中沉積產生的［2］。天然彩棉在加工生產過程中，無需染色［3］。目前對天然彩棉的鑒別仍缺乏完善的理論依據和適用于市場的實際鑒別標準［4］。類黃酮是天然彩色棉中的重要化合物，與纖維的色彩著色密切相關。類黃酮化合物是一類黃色色素，主要通過黃酮（2-苯基色原酮）而衍生出來的，在植物中分布廣泛［5］。利用超聲細胞破碎法輔助乙醇提取天然綠色棉纖維中的總黃酮，結合響應面分析法設計并優化提取條件并獲得最佳提取工藝條件參數，對合理開發利用天然彩色棉資源以及鑒別天然彩色棉有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】以彩色棉纖維和白色棉纖維為材料，比較不同的提取溶劑對不同的棉纖維色素提取的影響，發現棕色棉纖維色素極有可能是類黃酮化合物，而綠色棉纖維中除了類黃酮化合物還有蘆丁類的黃酮醇類的化合物［6］?！颈狙芯壳腥朦c】近幾年，國內外對于超聲波輔助提取植物中提取類黃酮的研究報道較多，利用超聲波的空化、攪拌，促進有效成分的快速釋放，并且與溶劑更快速有效的混合在一起［7］。目前關于綠色棉纖維中黃酮提取的研究報道較少。需研究優化超聲提取綠色棉纖維中總黃酮工藝條件?！緮M解決的關鍵問題】以乙醇溶液為提取劑，利用超聲細胞粉碎法輔助乙醇提取天然綠色棉纖維中的總黃酮，結合響應面分析法設計并優化提取條件，獲得最佳提取工藝條件參數，為合理開發利用天然彩色棉資源以及鑒別天然彩色棉和染色棉提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

天然綠色棉纖維由中國彩棉集團提供；蘆丁標準品（純度98%）、無水乙醇（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）、氫氧化鈉（分析純）購自天津市盛奧化學試劑有限公司。

儀器：JY92-IIL超聲波細胞粉碎機（上海喬躍電子有限公司）；DEF-500型搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；TDL-4A離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；752N紫外可見光分光光度計（上海儀電分析儀器廠）。

1.2? 方 法

1.2.1? 工藝流程

將采集到的綠色棉纖維用清水淋洗后，在60℃條件下烘干1 h。隨后取出并分批適量至于粉碎機中粉碎，粉末過80目篩。稱取適量過篩粉末約1 g放置于燒杯中，加入乙醇充分溶解，再利用超聲波細胞破碎處理。破碎處理后的液體置于離心機中，在4 000 r/min 的條件下離心15 min，隨后將上清液取出并定容搖勻靜置20 min，所得液體為綠色棉纖維總黃酮粗提液。利用紫外分光光度計在510 nm下測定粗提液的吸光度，以標準曲線的方程計算總黃酮得率。

1.2.2? 標準曲線的制作

精確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，用配置好的55%乙醇溶液溶解定容至50 mL，配制成0.2 mg/mL的溶液即為蘆丁標準溶液［8］。吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL 55%的乙醇溶液搖勻，接著加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻靜置5 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻靜置5 min后加入4 mL 4%的氫氧化鈉溶液后搖勻，最后用50%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻靜置20 min，以蘆丁標準品做對照，用1 cm的比色皿在510 nm處測定吸光值［9］。以蘆丁標準品的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，得到線性回歸方程［10］。

1.2.3? 總黃酮得率的計算

取粗提液1 mL于10 mL的比色皿中反應后，在紫外分光光度計510 nm下測定其吸光值。計算總黃酮得率［11］ Y= CNV/m×100% 。

式中，Y為總黃酮得率（%），C為棉纖維總黃酮的質量濃度（mg/mL），N為稀釋倍數，V為提取液稀釋后的體積（mL），m為稱取彩棉纖維的質量（g）。

1.2.4? 單因素試驗

設置4個單因素：料液比、乙醇濃度、提取功率、提取時間，每個因素設計5個水平，每個因素重復3次，分析超聲波輔助乙醇提取天然綠色棉纖維中總黃酮的影響。表1

1.2.5? 響應面試驗以及最佳組合驗證

模型的變異系數（Coefficient of Variation）能夠反映出一個模型的置信度，并且其CV值越低，則表示一個模型的置信度越好。

選出影響超聲波細胞粉碎法提取綠色棉纖維總黃酮的關鍵條件，再采用響應面分析法［12］，對最佳組合進行試驗驗證。料液比、乙醇濃度以及提取時間是影響超聲波細胞粉碎法提取綠色棉纖維總黃酮的關鍵條件，選擇3個因素作為響應面因素變量，以總黃酮得率作為響應值，設計響應面試驗，對試驗因素變量和響應值進行數據擬合，建立得到響應面回歸方程［13］。表2

1.3? 數據處理

采用Box－Behnken進行試驗設計并建立了二次回歸方程來表達試驗因素和響應值之間的函數關系，應用響應面分析得到最佳的提取條件。實驗數據使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行二次回歸方程分析，通過方差分析驗證模型及其各參數的顯著度。

2? 結果與分析

2.1? 影響超聲波輔助乙醇提取天然綠色棉纖維中總黃酮的條件

研究表明，料液比為1∶50 g/mL時，總黃酮得率達到最大值，確定提取最適料液比為1∶50 g/mL。當乙醇濃度小于50%時，總黃酮得率隨著乙醇體積的增大而提升，乙醇濃度為50%時，總黃酮得率達到最大值，提取的最佳乙醇濃度為50%。當超聲波功率比為60%時，總黃酮得率達到了最高值，最佳提取功率比為60%。隨著超聲總時間從30 min梯度增加到70 min，總黃酮得率也隨之提升，當提取時間為50 min時，總黃酮得率達到了最大值，隨后總黃酮得率降低。超聲工作最適時間為50 min。圖1

2.2? 響應面優化

2.2.1? 3個因素變量與響應值的數據擬合

研究表明，模型中的P值＜0.000 1，則該試驗響應面建立的模型是十分顯著的。響應模型的失擬項（Lack of Fit）能夠表示該預測值與實際值不擬合的概率，該模型的失擬項P值為0.464＞0.05，該模型的預測值與實際值不擬合的概率是不顯著的，該模型的多元二次回歸方程中不再需要引入更高次數的因素項，建立的模型可用，該模型相關系數R2=0.991 5＞0.9，其擬合程度較好。建立的該模型的校正確定系數R2Adj=0.995 9，模型的預測值與實際值情況擬合良好，響應面試驗中建立的模型的CV值=0.87%，能獲得反映預測出較為真實的試驗值。影響綠色棉纖維總黃酮得率的順序為提取時間＞乙醇濃度＞料液比。單因素中提取時間對綠色棉纖維總黃酮得率的影響最顯著。交互作用中AB，即料液比與乙醇濃度交互作用最顯著。表3，表4

2.3.2? 響應面結果

研究表明，各因素之間對綠色棉纖維總黃酮得率影響的強弱。三維曲面圖最陡峭，料液比與乙醇濃度的交互作用對總黃酮得率的影響最顯著。料液比＞乙醇濃度；料液比＞提取時間；乙醇濃度＞提取時間，料液比與乙醇濃度的2個因素交互作用中，料液比的影響比乙醇濃度的影響更顯著；料液比與提取時間的2個因素交互作用中，料液比的影響比提取時間的影響更顯著；在乙醇濃度與提取時間的2個因素交互作用中，乙醇濃度的影響比提取時間的影響更顯著。圖2

2.3? 響面優化結果的驗證

研究表明，最佳3個提取條件的編碼水平都十分靠近0水平，A料液比為1∶50 g/mL、B乙醇濃度50%、C提取時間50 min為最佳提取條件。分別得到總黃酮得率值為：5.17%、5.36%、5.22%，平均值為5.25%，與其相應預測值5.269%基本一致，同時比其它響應組合的所得率都高，響應試驗效果較好，模型擬合度較好。表5

3? 討 論

3.1

畢麗君等［14］以80%乙醇超聲輔助提取水芹類黃酮30 min，2次便可達到94.6%的類黃酮浸出率；劉春宇等［15］以60%乙醇超聲輔助提取出楂類黃酮45 min，提取物中類黃酮含量是95%乙醇索氏提取6 h并經正丁醇萃取的3倍多，是經乙酸乙酯萃取的7倍多。研究中提取時間這一因素對于總黃酮得率的影響較為顯著，當料液體比較小時，是由于總黃酮溶解的不充分，導致提取率很小，隨著逐漸增大料液比，則有利于總黃酮的滲出，故而總黃酮得率隨之提升，且當料液比為1∶50 g/mL時，總黃酮的溶解達到了飽和［16］。當乙醇濃度為50%時，總黃酮得率達到最大值，由于相似相容的原理，當乙醇濃度為50%時與綠色棉纖維的總黃酮極性類似［17］。當超聲提取時間為50 min時，總黃酮的得率達到了最大值，隨后總黃酮得率降低，是超聲波的空穴作用時間過長，破壞了黃酮的結構，影響的總黃酮含量。并且時間過長，部分黃酮類化合物也會發生一定程度的氧化，使得總得率降低［18］。超聲波的空穴作用使得生物細胞壁破裂，部分物質溶出，增大超聲波功率，由于空穴作用的加強會使得黃酮物質結構破碎，其他雜質溶出，影響總黃酮得率。類黃酮化合物中含有不穩定性物質，超聲波工作過程中，由于過大的機械力會產熱，使得黃酮分解，也可能影響總黃酮的得率［19］。

3.2? 響應面的多元二次回歸方程分析方程［20］能直接具體的反應出各因素對提取綠色棉纖維的總黃酮得率影響的大小，系數的絕對值越大，對結果影響越明顯，反之則越?。?1］。根據設計的單因素試驗的結果，再采用響應面法優化設計和試驗，天然綠色棉纖維的最佳提取條件為料液比為1∶50 g/mL、乙醇濃度為50%、提取時間為50 min，在交互試驗結果中，三維曲面圖的陡峭平滑程度反應了2個因素交互作用對總黃酮得率的影響，曲面越陡峭，交互作用對總黃酮得率越顯著［22］。等高線圖的密集程度同樣反映了單因素條件的變化對綠色棉纖維總黃酮得率的影響大小，等高線越密集，則對總黃酮得率影響越顯著［23］，中心位置總黃酮得率則越高，料液比與乙醇濃度的交互作用對總黃酮得率的影響最顯著。驗證獲得總黃酮得率為5.25%，研究響應面法優化后的試驗結果可靠。劉寧等［24］利用超聲波細胞粉碎法提取東北紅松松針總黃酮，料液液比為1∶65 g/mL，乙醇體積為55%，超聲總時間為46 min，獲得總黃酮得率為4.88%。研究中，在乙醇濃度以及提取時間的參數上研究結果類似，但是料液比參數有一定不同，是與植物的不同組織性質、以及不同組織包含中的類黃酮化合物類型不一樣導致的。因為類黃酮化合物在不同植物組織中的類型和含量受到不同提取條件的影響。

4? 結 論

建立的模型可用，該模型的相關系數R2=0.991 5＞0.9，其擬合程度較好。建立的該模型的校正確定系數R2Adj=0.995 9，模型的預測值與實際值情況擬合良好，響應面試驗中建立的模型的CV值=0.87%。單因素影響綠色棉纖維總黃酮得率的顯著順序為提取時間＞乙醇濃度＞料液比，即提取時間的影響是最顯著的。最佳提取工藝條件參數為料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度50%、提取時間50 min，獲得總黃酮率為5.25%。

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Extraction of total flavonoids from green cotton fiber by ultrasonic-based response surface optimization

CHEN Pei1，? BAO Junxiu1， WANG Fei1，2，3， TANG Shouwu4， LIU Haifeng4， LI Hongbin1，2，3，4

（1.College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832003，China; 2.Key Laboratory of Oasis Town and Mountain Basin System Ecology，Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi Xinjiang 832000，China; 3.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization，Ministry of Education，Shihezi Xinjiang 832000，China; 4.China Natural Color Cotton Corp.Ltd.，Urumqi 830001，China）

Abstract：【Objective】 This study is to optimize ultrasonic extraction conditions of total flavonoids in NGC fibers，in the hope of providing the basis for reasonable utilization and identification of NGC fibers.

【Methods】 The NGC fibers were used as raw materials and were utilized for total flavonoids extract by ultrasonic cavitation effect to accelerate the dissolution of flavonoids in ethanol，to optimize the experimental conditions with Box-Benhnken center combination principle and response surface design.

【Results】? The optimal extraction conditions were as follows：solid-liquid ratio of 1∶50 g/mL，ethanol concentration of 50%，and extraction time of 50 min.Under these conditions，the average yield of total flavonoids was 5.25%，which was the best condition for the extraction of total flavonoids from NGC fibers by ultrasonic method.

【Conclusion】 The optimal condition Parameter for ultrasonic extraction of total flavonoids from green cotton fibers is a liquid to material ratio of 1∶50 g/mL，ethanol concentration 50%，extraction time 50 min，obtaining an average total flavonoid yield of 5.25%.

Key words：green cotton fiber; total flavonoids; response surface method; optimum extraction condition; ultrasionic cell-break

Fund projects： Innovation Environment Construction Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region（2020D14035）；Tackling Hard-Nut Problems in Science and Technology and Research Results Transformation Project of XPCC（2016AC017）

Correspondence author：LI Hongbin（1980-），male，from Henan，professor，Ph.D.，doctoral supervisor，research field：plant molecular biology，（E-mail） lihb@shzu.edu.cn

LIU Haifeng，（1977-），male，from Hubei，master supervisor，research field：cotton genetics and breeding，（E-mail） cncclhf@163.com.