蘋果響應鹽脅迫相關miRNA的深度測序數據集

摘要：土壤鹽漬化已成為限制農作物產量與質量的重要因素之一，影響著全世界范圍內的農作物產量。蘋果作為一種重要的水果作物，鹽脅迫的危害及耐鹽砧木的缺乏已成為威脅現代蘋果產業健康可持續發展的重要問題。因此，研究蘋果對鹽脅迫的反應和適應具有重要的現實意義和緊迫性。本研究分別以0%、0.2%和0.6% NaCl處理0、4、8和12天后的珠美海棠實生苗為試驗材料，從葉片及根系中提取總RNA，構建RNA-seq文庫，共鑒定獲得575個miRNA，包括315個已知mdm-miRNA和260個新miRNA。此外，Differential Expression（DE） miRNA對鹽脅迫反應具有組織特異性表達模式。同時提供珠美海棠miRNA深度測序的數據集，結合生物信息學方法對原始數據質量控制，獲得高質量序列并利用BLAST軟件將預測靶基因序列與NR、Swiss-Prot、Pfam等數據庫比對，獲得響應鹽脅迫相關基因的注釋信息。GO分析表明與鹽脅迫有關miRNA及靶基因主要參與生物過程中對刺激的反應。本研究為珠美海棠的利用提供理論數據基礎，并為耐鹽砧木的選育提供有力支持。

關鍵詞：蘋果；鹽脅迫；miRNA；深度測序；生物信息學

1? 引言

鹽脅迫是制約全世界農業生產的主要環境因素之一[1]。據估計目前全球約有20%的灌溉土壤正在遭受鹽脅迫的危害，預計到2050年全世界將會有超過50%的可耕地土壤出現土壤鹽漬化問題[2]。植物受到鹽脅迫時會影響體內Na+、Cl- 等含量的積累，從而破壞細胞內的離子平衡，進而影響植物細胞膜上相關酶的活性，破壞膜結構。此外鹽脅迫會造成光合作用速率下降，增加呼吸消耗，加速植物衰老，并且積累大量有毒代謝物質，對植物造成不利影響[3-4]。然而植物為適應高鹽環境已進化出應對鹽脅迫的策略，包括積累滲透調節物質以適應滲透損傷[5-6]；激活活性氧清除系統保護植物免受鹽脅迫引發的氧化損傷[7-8]；調控鹽響應基因的表達以保護細胞機制免受脅迫[9]等方式來提高植物耐鹽性。因此，揭示更多耐鹽植物分子機制對未來農業生產具有重要意義。

MicroRNA （miRNA）是一類廣泛存在于動物、植物中的非編碼小RNA（sncRNA），長度為20－24個核苷酸（nt），被認為是一種重要的基因表達調控因子[10]。miRNA最初發現于秀麗小桿線蟲[11]，隨著對miRNA的深入研究，越來越多的植物、動物和病毒中都發現了miRNA的存在。截至目前已從82種植物中共鑒定出10 405個成熟miRNA，歸屬于上百個miRNA家族[12]。miRNA與反向互補序列結合形成RNA誘導的沉默復合物，從而通過轉錄后水平切割或抑制翻譯來負調控其靶基因[13]。此外，miRNA參與了植物種子萌發和幼苗的生長發育、植物形態結構調控和產量形成，以及對許多生物和非生物脅迫的響應[14-16]。已有大量研究證明miRNA在植物響應鹽脅迫中發揮著關鍵作用。例如，miR169c的靶基因可以控制玉米葉片氣孔的開啟和關閉，從而減少水分流失抵抗鹽脅迫[17]。棉花中miR414c過表達可負調控鐵超氧化物歧化酶基因，增強植物對鹽脅迫的耐受性[18]。此外，越來越多的耐鹽miRNA-mRNA模塊也得到了功能驗證。miR156/SPL模塊通過上調蘋果的MdWRKY100來增強其耐鹽性[19]。在水稻中miR528-AO （l-抗壞血酸氧化酶）模塊可以調節抗壞血酸和脫落酸的代謝以及清除ROS，從而增強耐鹽能力[20]。這些研究表明了解miRNA介導的植物耐鹽生理調控機制，可以為揭示植物耐鹽脅迫復雜的分子和遺傳機制提供必要的基礎。

蘋果是全世界重要的栽培果樹之一，亦是鄉村振興和脫貧攻堅的優勢樹種。然而一些蘋果優勢產區由于土壤鹽漬化嚴重，造成樹體營養失衡、生理病害加重、果實產量及品質下降等問題，土壤鹽漬化已經成為威脅果樹產業健康可持續發展的重要問題[21]。蘋果耐鹽性與其品種和砧木類型密切相關，選擇耐鹽性強的蘋果砧木類型可以有效提高蘋果耐鹽性[22]。因此對耐鹽砧木的挖掘、篩選及利用將成為現代蘋果產業和“四荒”用地上新果園發展的重要發展趨勢。

我國擁有著豐富的蘋果種質資源。據報道，珠美海棠可耐0.6%以上鹽含量，具有耐鹽、耐堿、適應性強等優良特性。miRNA深度測序作為高通量測序技術的重要應用，通過運用生物信息學技術對數據分析可從測序得到原始數據中篩選出相關鹽脅迫響應基因，極大提高了植物與耐鹽相關基因種類鑒定的準確性。因此本研究以珠美海棠實生苗為材料，通過miRNA測序獲得樣品的miRNA序列數據，并通過生物信息學注釋了匹配到與鹽脅迫響應相關的靶基因，為珠美海棠的砧木利用提供理論數據基礎，并為解決耐鹽砧木的利用提供有力支持。

2? 數據采集和處理方法

2.1? 植物材料和鹽的處理

試驗材料來自中國農業科學院果樹研究所國家蘋果種質資源圃（遼寧興城），挑選健康的珠美海棠種子于4℃層積60 d。將層積的種子播種在營養缽中，隨后移栽在花盆中，每盆各一株。挑選150株生長一致、高度約30 cm的一年生苗，分別進行0、0.2%和0.6% 的NaCl脅迫處理，每50株為一個處理組。隨后在鹽脅迫第0、4、8和12 d時選取整齊一致的植株用超純水洗凈，分別采集葉片和根系液氮速凍，每個處理重復3次。取樣完成后，收集的組織樣本在液氮速凍后放入干冰中寄送到測序公司。

2.2? sRNA測序

每個樣本中的RNA提取參照植物RNA分離試劑盒的說明進行分離（Aidlab EASYspin， Beijing， China），隨后用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解和污染，RNA濃度和純度采用Nucleic Proteometer Thermo NANODrop 2000（Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE， USA）進行檢測，使用RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA的完整性（Agilent Technologies， Santa Clara， CA， USA）。只有260/280比值為1.8－1.9，260/230比值為2.0－2.5、RNA完整性（RNA integrity number）大于6.0的RNA樣本可以被認為是合格樣品。

獲得高質量RNA后，使用Ribo-ZeroTM試劑盒（Epicentre， Madison， WI， USA）去除樣本中rRNA以富集原核mRNA。隨后，使用片段緩沖液隨機中斷富集的mRNA片段，用六堿基隨機引物和逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶I、RNase H、dNTP和buffer solution合成第二鏈cDNA，使用AMPure XP beads純化cDNA片段。在PCR擴增前將純化的雙鏈cDNA片段末端修復、添加堿基并與NEBNext適配器連接cDNA 15 min。PCR產物用AMPure XP系統（Beckman Coulter， Beverly， MA， USA）純化，并由Agilent 2100 Bioanalyzer系統進行文庫質量評估。測序采用Illumina HiSeq高通量測序平臺，經過堿基識別和分析后，從測序數據中獲得FASTQ格式的原始數據。

2.3? 生物信息學分析

為了進行后續分析，采用‘Golden Delicious GDDH13_V1.1作為參考基因組進行序列比對。如圖1所示，Illumina測序平臺的工作流程如下：首先經過堿基識別，即Base Calling，原有的圖像數據文件會被轉換為原始測序序列，這也就是所謂的Raw Data或者Raw Reads。

這些收集到的原始序列可能會包含有接頭序列或者質量較低的序列。為了保證分析數據的準確性，需要對這些初始數據進行質量檢查，然后再生成高質量的序列，即Clean Reads。隨后用短序列比對工具Bowtie將Clean Reads比對到Silva數據庫、GtRNAdb數據庫、Rfam數據庫以及Repbase數據庫。此流程有助于過濾掉核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）、核內小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等非編碼RNA以及重復序列。在與參考基因組比對完成后，將比對結果與miRBase（v22）數據庫內已有的miRNA成熟序列及其上下游序列進行比對。此階段最多允許一個錯配，被滿足條件的reads將被確認為已知miRNA。對于沒有能夠匹配到已知miRNA序列的數據，使用miRDeep2軟件工具來進行處理。該軟件通過分析reads在基因組上的位置信息，能夠推斷出潛在的前體序列。然后根據reads在前體序列中的分布和前體的結構能量信息，利用貝葉斯模型進行評分，以預測新的miRNA。隨后，對已知的miRNA和新預測的miRNA進行結構和堿基編輯等相關分析，將獲得的靶基因與數據庫中的數據進行比對和分類注釋。最終基于這些注釋，確定與響應鹽脅迫相關的miRNA。

3? 數據樣本描述

3.1? sRNA深度測序數據

從珠美海棠對照組0 NaCl（0 d）和NaCl（0.2%和0.6%）脅迫條件處理4 d、8 d、12 d的葉片（L）及根系（R）部位中提取總RNA，構建了包括3個生物學重復共42個樣品的RNA-seq文庫，并利用Illumina Hiseq X-ten平臺進行高通量測序。對所獲得的原始數據進一步過濾，最終得到用于后續分析的高質量小RNA reads。通過質量控制，每個樣品的Clean Data均大于9.31 M。隨后將每個樣本中獲取的Clean Reads與‘Golden Delicious GDDH13_V1.1參考基因組進行比對，Q30和GC含量分別為99.06%－99.35%、41.02%－49.37%（表1）。

3.2? miRNA分析

miRNA的起始轉錄位置往往在基因間隔區、內含子與編碼序列的反向互補序列上。這些miRNA的前體都體現出所具有的特殊的發夾結構，而其成熟體則是要依賴于Dicer或DCL酶的剪切才能實現?；趍iRBase（v22）數據庫和miRDeep2軟件包，我們對42個樣品進行了深入分析，共鑒定出575個miRNA。其中，已知的miRNA有315個，而新預測的miRNA則有260個。此外，miRDeep2軟件還預測了新miRNA的候選前體結構及其序列深度信息，并生成相應的pdf文件（圖2）。

注：圖A為miRDeep2軟件對miRNA前體的打分和比對到成熟序列、環狀結構、star序列上的reads數及其前體的二級結構預測圖：紅色為成熟序列，黃色為環狀結構，紫色為star序列；圖B顯示比對到本條前體上的reads分布；圖C包含了成熟序列、環狀結構、star序列的位置，紫色為miRDeep2軟件預測的star序列，亮藍色為測序reads支持的star序列。

3.3? 鹽脅迫下miRNA的差異表達分析

為了在珠美海棠中發現響應鹽脅迫的miRNA，分析了在0.2%和0.6% NaCl處理下葉片和根系中不同處理時間（4 d、8 d、12 d）下鹽響應差異miRNA的相對表達水平。研究發現在0.2% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的葉片中分別有10、126和15個DE miRNA特異性表達，3個DE miRNA在鹽處理4 d、8 d、12 d后的葉片中共同表達。在0.6% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的葉片中分別有29、29和30個DE miRNA特異性表達，9個DE miRNA共同表達（圖3a）。此外，在0.2% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的根中分別有38、34和27個DE miRNA特異性表達，10個DE miRNA共同表達。在0.6% NaCl處理4 d、8 d、12 d后的根中分別有55、39和9個DE miRNA特異性表達，22個DE miRNA共同表達（圖3b）?？傊?，這些miRNA對鹽脅迫反應具有組織特異性表達模式。

3.4? miRNA靶基因預測及注釋

通過已知的miRNA與新預測出的miRNA，再結合對應物種的基因序列信息，運用TargetFinder軟件預測可能的靶基因，預測結果如表2所示。以BLAST軟件為工具，針對預測出的靶基因序列和NR、Swiss-Prot、Pfam等數據庫進行比對，進一步了解這些靶基因，以此獲取靶基因的注釋信息。在5 812個預測出的靶基因中，共有5 692個獲得了注釋信息。全部miRNA靶基因注釋數量和不同樣品miRNA靶基因注釋數量見表3。

3.5? 注釋到的響應鹽脅迫靶基因數據及GO分析

注釋到響應鹽脅迫相關的靶基因數據以.xlsx文件格式保存。其中，注釋到鹽脅迫的靶基因見表4?；诩毎煞?、分子功能和生物過程對預測的靶基因進行GO富集分析。GO分析顯示，差異表達的靶基因被注釋為44個GO術語。在細胞成分類別中，主要富集的術語是“Cell”（GO：0005623）、“Cell part”（GO：0044464）、“membrane”（GO：0016020）和“organelle”（GO：0043226）。就其分子功能而言，主要富集的術語是“binding”（GO：00055488）、“catalytic activity”（GO：0003824）、“transporter activity”（GO：0005215）和“nucleic acid binding transcription factor activity”（GO：0003676）。涉及生物過程的主要術語是“metabolic process”（GO：0008152）、“cellular process”（GO：0009987）、“single-organism process”（GO：0044699）、“biological regulation”（GO：0065007）、“developmental process”（GO：0032502）和“response to stimulus”（GO：0050896）（圖4）。

4? 數據質量控制與評估

為了保證數據的質量和可靠性，試驗樣品寄送到北京百邁客生物科技有限公司后，由專業人員進行總RNA的提取以及miRNA的深度測序，并使用百邁客云平臺進行生物信息學分析。同時確保所提取的RNA滿足構建miRNA文庫的要求。miRNA測序后的原始序列首先通過內部perl腳本進行處理，隨后通過去除接頭；去除短于18或長于30個核苷酸的序列；去除對于每個樣本中質量值低的序列；去除未知堿基N含量大于等于10%的Reads以獲得Clean Reads。共得到648.15 M Clean Reads，各樣品不少于9.31 M Clean Reads。同時計算清理數據的Q30、GC含量和序列重復水平。以上數據的整理過程均由專業人員進行核查。

將rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等ncRNA以及重復序列過濾后，選用非冗余蛋白序列數據庫（NR）、同源蛋白家族數據庫（Pfam）、人工注釋的非冗余蛋白序列數據庫（Swiss-Prot）等數據庫對靶基因進行注釋，并根據不同數據庫的注釋最終確定與響應鹽脅迫相關的靶基因。響應鹽脅迫靶基因篩選按照如下標準篩選：當只在其中一種數據庫中注釋到與耐鹽相關的基因，則保留該注釋的基因；當在兩種或以上數據庫中均注釋到響應鹽脅迫相關的基因，則保留該注釋的基因。

5? 數據價值與使用建議

該數據集通過miRNA深度測序獲得樣品的序列數據，并利用生物信息學技術進行聯合分析，注釋到珠美海棠與響應鹽脅迫相關的靶基因，可為珠美海棠的砧木利用提供理論數據基礎。同時為解決耐鹽砧木的利用提供科學依據和數據支撐。

6? 數據可用性

中國科技資源標識碼（CSTR）： 17058.11.sciencedb. agriculture.00097；

數據對象標識碼（DOI）： 10.57760/sciencedb. agriculture.00097。

數據服務系統網址：https：//www.scidb.cn/s/iqmQfi。

作者分工與貢獻

劉昭，數據整理匯總和論文撰寫。

高源，數據質量控制與方法設計。

王昆，數據質量控制與方法設計。

孫思邈，數據收集與可視化。

代瑛姿，前期數據處理和分析。

路翔，樣品收集及質量控制。

田雯，數據匯總處理。

王大江，論文構架及質量控制。

馮建榮，論文構架及質量控制。

倫理聲明

本研究未涉及倫理。

利益沖突聲明

作者聲明，全部作者均無會影響研究公正性的財務利益沖突或個人利益沖突。

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CITATION： LIU Zhao， GAO Yuan， WANG Kun， SUN SiMiao， DAI YingZi， LU Xiang， TIAN Wen， WANG DaJiang， FENG JianRong. Deep Sequencing Dataset of miRNAs in Response to Salt Stress in Apples[J]. Journal of Agricultural Big Data， 2024，6（1）：14-23. DOI： 10.19788/j.issn.2096-6369.100007.

Deep Sequencing Dataset of miRNAs in Response to Salt Stress in Apples

LIU Zhao1，2， GAO Yuan2， WANG Kun2， SUN SiMiao2， DAI YingZi1， LU Xiang1，2， TIAN Wen1，2， WANG DaJiang2，*， FENG JianRong1，*

1 College of Agriculture， Shihezi University， Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization， Shihezi 832000， Xinjiang ， China; 2 Research Institute of Pomology ， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xingcheng 125100， Liaoning， China

Abstract： Soil salinization has become an important factor limiting crop yield and quality， affecting crop yields worldwide. As an important fruit crop， the harm of salt stress and the lack of salt tolerant rootstocks have become important issues threatening the healthy and sustainable development of the modern apple industry. Therefore， studying the response and adaptation of apple trees to salt stress is of great practical significance and urgency. In this study， total RNA was extracted from the leaves and roots of Malus zumi （Mats.） Rehd. seedlings were treated with 0， 0.2% and 0.6% NaCl after 0， 4， 8 and 12 days， and RNA-seq libraries were constructed. A total of 575 miRNAs were identified， including 315 known mdm-miRNAs and 260 new miRNAs. In addition， differentially expressed （DE） miRNAs exhibited tissue-specific expression patterns in response to salt stress. At the same time， a data set for deep sequencing of miRNA in Malus zumi （Mats.） Rehd was provided， and bioinformatics methods were used to control the quality of the original data. High quality sequences were obtained， and BLAST software was used to compare the predicted target gene sequences with NR， Swiss Prot， Pfam and other databases to obtain annotation information of salt tolerance related genes. GO analysis shows that miRNAs and target genes related to salt stress are mainly involved in the response to stimuli in biological processes. This will provide theoretical data basis for the utilization of Malus zumi （Mats.） Rehd and favorable support for the breeding of salt tolerant rootstocks.

Keywords： apple; salt stress; miRNA; deep sequencing; bioinformatics