脫細胞外基質在口腔組織再生中的研究進展

徐庭瑞 付 鈺 呂雯昊 馬 寧 張 莉

口腔頜面部軟硬組織的缺損嚴重影響患者的口腔功能,采用自體組織進行修復是一種理想的方式,但自體組織存在著來源不足和供區二次損傷的缺點[1]。組織工程和再生醫學的發展為口腔組織的修復與再生提供了新的思路。組織工程的原理是在體外模擬體內的組織微環境，將種子細胞接種至支架材料上培養形成工程化組織再植入體內修復或再生體內缺損組織或器官，生長因子和外部物理因素也是組織工程中的重要要素[2，3]。支架材料在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）形成期間為再生的細胞提供機械支持，是組織工程的核心部分[4]。其中具有良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性的天然生物材料被廣泛用于制備支架。脫細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）作為一種天然生物材料在組織再生中體現出了巨大的優勢。近年來越來越多的學者開始關注dECM，并對其在口腔醫學領域進行了一些基礎研究和臨床應用方面的探索。本文對dECM 的研究現狀作一綜述，旨在為dECM在口腔組織再生中的應用提供參考。

一、dECM的概念、來源和分類

dECM 是指經物理法、化學法及生物法等方式脫去組織或器官中的細胞后形成的生物材料，其可以直接作為支架材料，也可以加工后形成顆粒、水凝膠或生物墨水等形式加以應用[5，6]。dECM 保留了ECM 的基本結構和大部分有機成分，具有良好的生物相容性、可降解性和誘導組織再生能力[7，8]。根據ECM的起源，dECM可分自體dECM、同種異體dECM和異種dECM 三大類，其中同種異體dECM 和異種dECM 應用較廣泛[8]。根據ECM 的來源，dECM 可分為組織或器官來源和細胞來源兩類。組織或器官來源的dECM 是指通過對組織或器官進行脫細胞處理而形成的三維立體結構，這種dECM 保留了原組織或器官的復雜結構，因此其生物學性能更接近天然ECM[9]。細胞來源的dECM 是指對體外培養的細胞產生的特異性ECM 進行脫細胞處理后獲得的材料，與組織或器官來源的dECM 相比，細胞來源的dECM相對更容易獲取[10]。目前報道的應用于口腔組織再生的dECM 包括脫細胞牙髓（decellularized dental pulp，DDP）、牙周膜dECM、骨脫細胞外基質（decellularized bone extracellular matrix，dbECM）、顳下頜關節盤dECM、小腸粘膜下層dECM、脫細胞神經移植物（acellular nerve grafts，ANGs）和脫細胞牙胚等，不同dECM 的三維結構和成分的差異使其在口腔組織再生中發揮不同的作用[4]。

二、dECM的主要成分和作用

dECM 主要包含各種細胞因子、糖胺聚糖和蛋白成分[11]。細胞因子在體內釋放后可以直接作用于細胞，在調節各種細胞的功能中起著重要作用。糖胺聚糖，主要包括肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和透明質酸，是一類高度水化、具有凝膠性質的物質，這些聚合物可以通過與各種結構蛋白和細胞因子相互作用來調節細胞活動[12]。各類蛋白成分在dECM中同樣發揮著重要的作用。結構蛋白或纖維蛋白，包括膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白等以纖維的形式存在，這些蛋白質構成的細胞外網絡具有較高的機械強度，使組織或器官能夠承受重復的壓力和張力[6]。層粘連蛋白和纖連蛋白表面具有特定的受體結合位點，它們作為一個橋梁將ECM 與基質內的細胞相關聯，傳遞各種信息及調節細胞行為[13]。dECM中保留的主要成分有重要的意義，移植于體內組織缺損部位后可以通過激活多種信號通路調節細胞與細胞和細胞與基質間的相互作用，參與組織的修復和再生[14，15]。

三、dECM與口腔組織再生

1.牙髓組織

DDP 是牙髓再生中常用的一種dECM，由人或動物的牙髓組織經酶和化學物質脫細胞處理制成，其可以為干細胞增殖和分化提供合適的微環境[16]。DDP 中保留的血管內皮生長因子-A 和成纖維細胞生長因子-2 可以使人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的含激酶插入區受體和血小板內皮細胞粘附分子-1 表達上調，在牙髓再血管化過程中發揮作用[17]。Hu L等[18]用1 mm 厚的人磨牙牙根切片作為載體搭載豬DDP 和hDPSCs 后移植到裸鼠皮下，2 月后發現牙根切片內有髓樣組織和礦化組織的生長，并在再生的髓樣組織中觀察到了血管樣結構。除了DDP 以外，其他組織的dECM也可以促進牙髓再生。Bakhtiar H 等[19]將人羊膜dECM 接種hDPSCs 后置入完成預備和消毒的牙根根管內，將牙根植入小鼠顱骨7 周后可見高度血管化的髓樣組織充滿根管。以上結果提示dECM 在牙髓再生血管化過程中發揮了重要作用，但實現牙髓牙本質復合體再生還需要誘導干細胞多向分化。研究表明dECM 可通過Wnt/β-catenin 信號通路上調Wnt3a 基因的表達，誘導干細胞分化生成血管、神經和牙本質，在牙髓牙本質復合體再生中發揮作用[20]?；诖死碚?，有學者[21]發現DDP 水凝膠支架可以使人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）的牙本質基質蛋白-1、Ⅰ型膠原和牙本質涎磷蛋白表達水平升高并促進hBMMSCs 牙源性分化。另有研究[22]表明DDP水凝膠可以促進hDPSCs向成牙本質樣細胞、神經樣細胞和血管生成細胞分化。牙髓再生標準在于牙髓充滿血管、神經元形成和牙本質的沉淀，其關鍵因素在于牙髓血管網絡的重建[23]。dECM 在牙髓再血管化和誘導干細胞多向分化中具有重要作用，這為牙髓牙本質復合體再生過程中血管、神經和牙本質的形成提供了重要基礎。水凝膠形式的dECM 具有良好的流動性和可塑性，有望為牙髓生理性再生提供一種新的可能途徑，但其能否在復雜的根管環境中發揮作用仍需進一步的研究。

2.牙周膜

慢性牙周炎是導致牙周組織喪失最常見的因素，常規的牙周基礎治療只能消除牙周組織的炎癥，防止牙周組織被進一步破壞，但無法實現完整的牙周組織再生[24]。牙周膜的再生是牙周組織再生的關鍵，目前的一些生物合成材料和生物膜等在牙周膜再生中的作用有限，許多學者評價了dECM 在牙周膜再生中的作用。Nakamura 等[25]用十二烷基硫酸鈉對帶有牙齒的小鼠下頜骨進行脫細胞處理，之后通過拔除牙齒制備了帶有牙周膜dECM 的小鼠下頜骨，發現牙周膜dECM 可以引導宿主細胞在體內的遷移和排列，使細胞與原來的牙周膜細胞排列相同，證明了牙周膜dECM 具有一定的引導組織再生能力。但是直接制備牙周膜dECM 比較復雜，且容易破壞牙周膜，提示應用其他組織來源或細胞來源的dECM 有望成為一種嶄新策略。Xiong X 等[26]將人尿源性干細胞體外誘導培養后對其進行脫細胞處理，制備成人尿源性干細胞脫細胞外基質（decellularuzed extracellular matrix from human urine-derived stem cells，U-dECM），將人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）接種于U-dECM 上培養，發現U-dECM 可以促進hPDLSCs 的增殖和粘附。上述研究證實dECM 在牙周膜再生中具有一定的作用，未來可將不同干細胞來源的dECM 或其他組織來源的dECM應用于牙周膜再生中。但長期的慢性炎癥會導致宿主間充質干細胞數量減少及牙周菌群失衡，如何使dECM 在這個復雜的環境中誘導牙周膜再生是今后研究的重點[27]。

3.骨組織

由創傷、感染和手術造成的頜骨缺損嚴重影響患者的美觀、咀嚼和吞咽，自體骨或同種異體骨移植是臨床上修復頜骨缺損的金標準[28]，但自體骨來源有限及異體移植的倫理問題等缺點限制了其應用。近年來，學者們發現dbECM 在骨再生中具有很大的潛力。dbECM 通過化學物質和酶等處理脫去骨組織中細胞成分獲得，它既保留了天然骨ECM 中的主要成分，同時具有良好的力學性能和誘導成骨能力[29]。Paduano F 等[30]研究表明牛dbECM 水凝膠可通過上調牙髓干細胞成骨特異性基因RUNX-2 基因、骨涎蛋白、骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達水平調控其成骨分化。另有學者[31]將豬dbECM 植入10 名眶底骨折的患者體內進行眶底重建，發現其在人體內具有良好的生物相容性并顯著促進成骨。除了dbECM 以外，其他組織的dECM 也有促進成骨的作用。Alksne M 等[32]制備了大鼠DPSCs 來源的DDP，體外細胞實驗發現DDP 可以促進DPSCs 的粘附、遷移和增殖，并且對DPSCs的成骨分化具有誘導作用。Guo K 等[33]對人牙進行脫細胞脫鈣處理后植入大鼠顱骨缺損中，發現其具有誘導成骨能力和良好的生物相容性。不同來源的dECM 在體內和體外實驗中均表現出了良好的成骨能力，dbECM 可直接作為支架材料用于骨組織再生。但細胞來源的dECM 由于力學性能不足限制了其在骨組織工程中的應用，將其與生物相容性良好的高分子材料復合制備成一種既具有良好的力學性能又可以保存dECM 生物學活性的支架材料是一種理想的方案[34]。

4.顳下頜關節盤

顳下頜關節盤是位于下頜骨髁突和顳骨關節窩之間的纖維軟骨樣組織，是顳下頜關節行使功能的主要組成部分和重要基礎，關節盤穿孔（disc perforation，DP）是常見的顳下頜關節紊亂病之一[35]。DP 的治療遵循一個循序漸進的原則，首先是進行保守治療如服藥、理療和透明質酸關節腔注射等，對于保守治療無效的患者需要進行關節盤切除、關節盤置換和關節重建等手術進行治療，但術后并發癥和移植物使用壽命較短是目前面臨的挑戰[36]。采用dECM 修復或重建關節盤是治療DP 的一種新的研究方向。有學者[37]通過凍融循環、酶和化學物質對豬顳下頜關節盤行脫細胞處理后再制備成豬顳下頜關節盤dECM 水凝膠并與支架材料復合，將載有大鼠肋軟骨細胞和L929 成纖維細胞的支架體外培養，發現軟骨細胞中SOX9 基因和Ⅱ型膠原纖維基因表達顯著上調，體內實驗進一步證明載有細胞的支架可以促進軟骨組織形成。另有學者[38]用小腸粘膜下層dECM 經凍干、粉碎后制成一種與豬顳下頜關節盤大小和形狀相近的支架，將該支架植入切除關節盤的豬動物模型中，發現其在術后3 月形成一種顳下頜關節盤樣組織，該組織的主要成分和生物力學性能與天然關節盤相似。以上研究表明dECM 在促進顳下頜關節盤再生時具有重大應用價值，其不僅可以通過水凝膠形式進行關節腔內注射，還能作為支架材料加以應用。但目前對于dECM 在顳下頜關節盤再生中具體機制的研究還較少，相信未來通過不斷研究可以將dECM 用于臨床治療，實現顳下頜關節盤的生理性修復。

5.神經

口腔頜面部外傷、手術等容易造成神經的損傷，其中下牙槽神經的損傷較常見，通常由牙槽外科手術、正頜外科手術以及頜骨手術等引起。對于大于8 mm 的較長神經缺損，修復的金標準是自體神經移植，但供體來源不足及供體區域的繼發性功能障礙是目前面臨的嚴峻挑戰[39]。ANGs 作為一種天然支架，可通過神經組織經凍融、化學物質脫細胞處理獲得。其不僅保留了天然神經的三維結構，而且去除了髓鞘、細胞等免疫源性物質，在誘導雪旺細胞（schwann cells，SCs）修復損傷神經中具有重要作用[40]。有研究[41]表明ANGs 可通過誘導脊髓中神經營養因子的高表達抑制JAK2/STAT3 信號通路促進神經再生。Shanti RM 等[42]對1 例下牙槽神經損傷的患者用同種異體ANGs進行修復，術后5月通過感覺檢測和兩點辨別感覺實驗觀察到患者患側皮膚感覺功能恢復良好。但長段ANGs 移植可能會導致SCs 衰老進而使神經再生過程受到抑制[43]，提示選擇合適的干細胞使ANGs 再細胞化或補充外源性物質以達到更為理想的修復效果是未來進一步的研究方向[44]。

6.牙再生

牙再生是指利用生物材料、種子細胞和生長因子模擬天然牙發生、發育過程中上皮和間充質的相互作用再生牙齒的過程[45]。有研究[46]在6 月大的豬頜骨中提取未萌出的鐘狀期牙胚進行脫細胞處理制成脫細胞牙胚，接種豬牙源性上皮細胞、人牙髓細胞和人臍靜脈內皮細胞使脫細胞牙胚再細胞化，將其接種到豬的下頜骨中，術后6 月觀察到由牙釉質、牙骨質、牙髓、牙本質和牙周膜組成的生物工程牙。這表明dECM 在牙再生過程中有巨大的作用，但其如何通過多種復雜的信號通路誘導牙再生仍不明確。此外，實現具有特定尺寸和形狀的生物工程牙齒的再生及如何控制其萌出還需進一步研究。

四、討論與展望

dECM 在口腔組織再生領域的應用是一個相對較新的課題，其在組織修復和再生中展現出了巨大的潛力。dECM 脫去了細胞及免疫成分，具有較低的免疫原性，這使異種來源的dECM 作為商業化產品用于口腔醫學領域成為可能。其保留的生物活性物質可以誘導干細胞增殖和分化，調控細胞信號通路的傳導和基因的表達，為干細胞移植和干細胞歸巢策略用于口腔組織再生奠定了基礎。組織、器官來源的dECM 可以直接作為支架材料用于口腔組織再生，但對于復雜的組織缺損無法實現精準修復，未來結合3D 打印技術制備出高精度的dECM 支架材料是一種發展趨勢。細胞來源的dECM 力學性能較差，可以將其與生物相容性優良、可降解的高分子材料復合制備支架材料或將其涂覆于支架表面。但目前dECM 在應用中仍面臨一些難題，例如：①脫細胞過程可能會破壞dECM 結構進而導致其有效成分的丟失；②其誘導不同口腔組織再生的具體機制尚未明確；③雖然目前關于dECM 的研究眾多，但進入臨床試驗的還很少。綜上所述，dECM 在口腔組織再生應用中充滿了機遇和挑戰，相信日后通過一系列的研究，可以解決dECM 現有的缺點，最終實現其在口腔組織再生中的廣泛應用。