巨噬細胞M1/M2型極化對糖尿病視網膜病變進程的影響及相關性分析

王愛軍 周俊 夏常杰

作者簡介：王愛軍，大學本科，主管技師，研究方向：臨床檢驗免疫學。

【摘要】目的 分析巨噬細胞（M?）M1/M2型極化對糖尿病視網膜病變（DR）進程的影響，為臨床治療提供參考。方法 選取2020年6月至2022年7月南華大學附屬第二醫院收治的97例DR患者（研究組）及同期105例單純糖尿?。―M）患者（對照組）為研究對象，比較兩組患者臨床資料，分析M?表型檢測的診斷價值，以及M1/M2型M?與炎癥因子、血糖水平、氧化應激反應標志物、DR進程的關系。結果 研究組患者M1型、M1/M2型M?占比均大于對照組，M2型M?占比小于對照組（均P<0.05）；M1/M2型M?>7.275時診斷DM患者發生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，曲線下面積（AUC）為0.8655（P<0.05）；研究組患者白細胞介素-4（IL-4）、轉化生長因子-β（TGF-β）、超氧化物歧化酶（SOD）水平均低于對照組，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、丙二醛（MDA）水平均高于對照組（P<0.05）；研究組患者M1/M2型M?與IL-4、TGF-β、SOD水平均呈負相關，與TNF-α、iNOS、空腹血糖（FBP）、餐后2 h血糖（2 hBP）、MDA水平呈正相關（均P<0.05）。結論 DR患者M?由M2型向M1型極化過程中炎性反應與氧化應激反應加重，升高血糖水平，加速DR的惡性病理發展。

【關鍵詞】巨噬細胞M1/M2型極化；糖尿病視網膜病變；氧化應激反應

【中圖分類號】R774.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.05.0083.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.05.028

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是目前全球范圍內最常見的慢性疾病之一，據統計，2021年中國DM患者為1.409億，居全球首位[1]。目前，臨床無法治愈DM，需采用終身降糖治療方法[2]。糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）發生率約占DM并發癥的20%～30%，其早期通常無自覺癥狀，多被忽視或誤診，后期可能導致視力嚴重下降甚至失明[3]。巨噬細胞（Macrophages，M?）根據微環境改變表型，使自身發揮出多樣功能的過程被稱為M?極化，根據信號傳導差異極化為M1/M2表型[4]。 研究表明，阻斷M?中白細胞介素-17A（IL-17A）與內質網應激間的相互作用可抑制DR中新生血管的形成[5]。由此可見，M?極化過程可能與DR的病理變化相關?；诖?，本研究分析M? M1/M2型極化對DR進程的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年6月至2022年7月南華大學附屬第二醫院收治的97例DR患者（研究組）及同期105例單純DM患者（對照組）為研究對象。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），組間具有可比性，見表1。本研究經南華大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準，患者均對本研究知情并簽署知情同意書。納入標準：⑴符合《中國2型糖尿病防治診南（2020版）》[6]中DR的診斷標準；⑵年齡>18歲；⑶臨床資料完整。排除標準：⑴入院前接受過抗生素類藥物、手術治療；⑵存在其他DM病變；⑶存在肝、腎功能障礙；

⑷凝血功能異常；⑸妊娠及哺乳期女性。

1.2 檢測方法 ⑴單核細胞分離。入院時采集患者外周靜脈血1 mL，采用血糖分析儀（青島市三凱醫學科技有限公司，魯械注準20192220549，型號：SK-Ⅱ）檢測空腹血糖（FBP）、餐后2 h血糖（2 hBP）、糖化血紅蛋白（HbA1c）。同方法采集患者外周靜脈血1 mL加入等體積磷酸鹽緩沖液稀釋后滴加至淋巴細胞分離液中，以

3 000 r/min轉速、10 cm半徑，離心10 min后吸取下層細胞并將其置于培養皿中，37 ℃、5%CO2環境下恒溫培養24 h，細胞貼壁后吸除懸浮細胞，獲得外周血中的單核細胞。⑵M?檢測。預冷的PBS洗滌單核細胞3次，后分裝至兩個離心管中，一管加入PE抗人CD68抗體檢測M1型M?，一管加入APC抗人CD206抗體檢測M2型M?。檢測儀器為流式細胞儀[美國貝克曼庫爾特，國食藥監械（進）字2012第2402288號，型號：CyFlow（r） Counter]。⑶酶聯免疫吸附（ELISA）法實驗。入院時采集患者外周靜脈血于促凝管中，室溫下靜置30～50 min，以3 000 r/min轉速、10 cm半徑，離心10 min后分離血清。ELISA檢測血清中白細胞介素-4（IL-4）、轉化生長因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平，試劑盒均購自江西艾博因生物科技有限公司。

1.3 觀察指標 ⑴繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析M?表型檢測的診斷價值。⑵使用Pearson相關系數分析兩組患者M1/M2型M?與血糖、炎癥因子、氧化應激反應標志物的關系。⑶M?與DR進程的關系。

1.4 統計學分析 使用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[例（%）]表示，組間比較使用χ2檢驗；計量資料以（x）表示，組間比較使用t檢驗，多組間比較采用方差分析及最小顯著差異法（LSD）組內檢驗；診斷價值使用ROC曲線分析；相關性使用Pearson相關系數分析。 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M?表型檢測診斷效能 研究組患者中M1型M?、M1/M2型M?占比均高于對照組，M2型M?占比低于對照組，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表2。ROC曲線分析結果顯示，當M1/M2型M?>7.265時，診斷DM患者發生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，曲線下面積（AUC）為0.8655，見圖1。

圖1 M1/M2型M?診斷DR的ROC曲線

2.2 兩組患者M1/M2型M?與炎癥因子的關系 研究組患者中IL-4、TGF-β水平均低于對照組，TNF-α、iNOS均高于對照組，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表3。Pearson相關系數分析結果顯示：研究組患者M1/M2型M?與IL-4、TGF-β水平均呈負相關，與TNF-α、iNOS水平呈正相關（均P<0.05），見圖2。

圖2 DR患者M1/M2型M?與炎癥因子的關系

注：IL-4：白細胞介素-4；TGF-β：轉化生長因子-β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；iNOS：誘導型一氧化氮合酶。

表2 M?表型檢測結果比較（%，x）

例數 M1型M? M2型M? M1/M2型M?

研究組 97 38.24±5.94 4.32±0.73 9.12±2.13

對照組 105 32.48±6.36 5.34±0.76 6.23±1.63

t值 6.638 9.712 10.880

P值 <0.001 <0.001 <0.001

表3 兩組患者炎癥因子檢測結果比較（x）

例數 IL-4（ng/L） TGF-β（ng/L） TNF-α（ng/L） iNOS（U/mL）

研究組 97 30.42±6.01 604.88±84.35 1.50±0.32 4.11±0.64

對照組 105 36.76±3.83 664.97±91.47 1.07±0.24 2.99±0.52

t值 8.044 4.842 10.860 13.700

P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

注：IL-4：白細胞介素-4；TGF-β：轉化生長因子-β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；iNOS：誘導型一氧化氮合酶。

2.3 兩組患者M1/M2型M?與血糖的關系 Pearson相關系數分析結果顯示：研究組患者M1/M2型M?與FBP、2 hBP均呈正相關（均P<0.05），見圖3。

圖3 DR患者M1/M2型M?與血糖的關系

注：FBP：空腹血糖；2 hBP：餐后2 h血糖。

2.4 兩組患者M1/M2型M?與氧化應激反應標志物的關系 研究組患者SOD水平低于對照組，MDA水平高于對照組，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表4。研究組患者M1/M2型M?與SOD水平呈負相關，與MDA水平呈正相關（均P<0.05），見圖4。

表4 氧化應激反應標志物檢測結果（x）

例數 SOD（μg/L） MDA（μmol/L）

研究組 97 141.94±35.37 8.67±2.11

對照組 105 161.52±28.59 6.21±1.42

t值 4.342 2.721

P值 <0.001 0.007

注：SOP：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

圖4 DR患者M1/M2型M?與氧化應激反應的關系

注：SOP：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

2.5 M?與DR進程的關系 研究組患者中Ⅰ期患者M1/M2型M?占比最低，并隨著病理進程逐漸升高，Ⅵ期患者M1/M2型M?占比最高（P<0.05），表5。

表5 M?與DR進程的關系

分期 例數 M1/M2型M?

Ⅰ期 8 5.90±0.83

Ⅱ期 28 7.62±0.91a

Ⅲ期 22 ? 8.62±0.72ab

Ⅳ期 16 ? ?9.75±0.52abc

Ⅴ期 14 ? ?11.28±1.04abcd

Ⅵ期 9 ? ? 13.00±1.57abcde

F值 88.170

P值 <0.001

注：與Ⅰ期患者比較，aP<0.05，；與Ⅱ期患者比較，bP<0.05；與Ⅲ期患者比較，cP<0.05；與Ⅳ期患者比較，dP<0.05；與Ⅴ期患者比較，eP<0.05；MQ：巨噬細胞；DR：糖尿病視網膜病變。

3 討論

DM作為目前全球范圍內發病率較高的慢性疾病，已嚴重威脅患者的生活質量[7]。DR作為DM中的并發癥，其發病率隨DM患者的增多不斷升高[8]。炎癥反應在DR的病理過程中具有重要意義，且現代臨床治療中抗炎藥物是DR治療的關鍵之一。

M?不僅是人體免疫細胞，還對炎癥反應調控有重要影響?，F代臨床研究中指出，M?向M2方向極化可促進視神經功能恢復，調節M?極化可促進實驗性脈絡膜新生血管的形成[9]。本研究結果顯示，DR患者中M1型M?增加，而M2型M?減少，M1/M2型M?比例升高，提示DR患者中M?由M2型向M1型極化，與既往研究結果一致[10]。本研究結果還顯示，當M1/M2型MQ>7.265時，診斷DM患者發生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，AOC為0.8655，提示M1/M2型M?占比同作為DR潛在病情評估指標。研究組患者IL-4、TGF-β水平均降低，而TNF-α、iNOS水平升高，提示患者存在明顯的炎性反應，與既往DR的病理研究結果相符[11]。研究組患者中M1/M2型M?與 IL-4、TGF-β水平呈負相關，而與TNF-α、iNOS水平呈正相關，這也驗證了M?極化與炎癥反應的關系。同時，研究組患者血糖水平更高，且與M1/M2型M?成正比，證明M?極化與DR進展密切相關。

此外，M1型M?可通過介導活性氧的生成加速組織再生的氧化應激損傷并延緩創傷的愈合[7]。M2型M?則具有清除碎片、凋亡細胞的能力，可促進機體內過氧化物的分解，促進組織損傷修復 [12]?？梢?，M?極化對于細胞與組織中的氧化應激反應也有極為重要的影響。DR病變的過程中，氧化應激反應加劇所致的視網膜微血管基底膜增厚、缺血性損傷等，這已是臨床公認的病理機制[13]。本研究結果顯示，研究組患者SOD水平降低，MDA水平升高，提示M?極化過程存在明顯氧化應激損傷，而M1/M2型M?與SOD呈負相關、與MDA呈正相關也提示M?極化對DR患者氧化應激損傷的影響。研究發現隨著DR分期的增加，M1/M2型M?占比呈現升高的趨勢，可見隨著M?由M2向M1的極化程度的增加，DR的病情發展也會不斷加重。

綜上所述，DR患者中M?由M2型向M1型極化過程中炎性反應與氧化應激反應加重，血糖水平升高，加速DR的惡性病理發展。

參考文獻

高嘉良， 楊庭， 王洪武. 巨噬細胞極化與2型糖尿病關系的研究進展[J].中國糖尿病雜志， 2024， 32（1）： 65-69.

VUJOSEVIC S， ALDINGTON S J， SILVA P， et al. Screening for diabetic retinopathy： new perspectives and challenges[J]. Lancet Diabetes Endocrinol， 2020， 8（4）： 337-347.

LIN K Y， HSIH W H， LIN Y B， et al. Update in the epidemiology， risk factors， screening， and treatment of diabetic retinopathy[J]. J Diabetes Investig， 2021， 12（8）： 1322-1325.

KANG Q， YANG C. Oxidative stress and diabetic retinopathy： Molecular mechanisms， pathogenetic role and therapeutic implications[J]. Redox Biol， 2020， 37： 101799.

ANDERSON N R， MINUTOLO N G， GILL S， et al. Macrophage-based approaches for cancer immunotherapy [J]. Cancer Res， 2021， 81（5）： 1201-1208.

中華醫學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南（2020年版）[J]. 中華糖尿病雜志， 2021， 13（4）： 315-409.

WANG Y， GAO S， GAO S， et al. Blocking the interaction between interleukin-17A and endoplasmic reticulum stress in macrophage attenuates retinal neovascularization in oxygen-induced retinopathy [J]. Cell Biosci， 2021， 11（1）： 82.

SIM?-SERVAT O， HERN?NDEZ C， SIM? R. Diabetic retinopathy in the context of patients with diabetes [J]. Ophthalmic Res， 2019， 62（4）： 211-217.

張順立， 白倩， 張倩， 等. 醛糖還原酶基因敲除促進視神經損傷后巨噬細胞向M2方向極化并促進視神經功能恢復[J]. 細胞與分子免疫學雜志， 2014， （5）： 505-508.

SABANAYAGAM C， BANU R， CHEE M L， et al. Incidence and progression of diabetic retinopathy： A systematic review [J]. Lancet Diabetes Endocrinol， 2019， 7（2）： 140-149.

YIN L， ZHANG D， REN Q， et al. Prevalence and risk factors of diabetic retinopathy in diabetic patients： A community based cross-sectional study [J]. Medicine （Baltimore）， 2020， 99（9）： e19236.

YUNNA C， MENGRU H， LEI W， et al. Macrophage M1/M2 polarization [J]. Eur J Pharmacol， 2020， 877： 173090.

ZHANG J， MURI J， FITZGERALD G， et al. Endothelial lactate controls muscle regeneration from ischemia by inducing M2-like macrophage polarization [J]. Cell Metab， 2020， 31（6）： 1136-1153. e7.