APE1/Ref－1線粒體定位機制的研究

朱劍武綜述，李夢俠，王 東 審校

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心，重慶400042）

APE1/Ref－1是一種重要的多功能蛋白，主要功能是DNA修復和轉錄因子的氧化還原調控。目前認為，核編碼基因的線粒體主動轉運主要依靠線粒體外膜和內膜上一系列轉運酶復合體，稱為外膜轉運酶（translocase of outer membrane，TOM）和內膜轉運酶（translocase of inner membrane，TIM）?；具^程為線粒體外膜TOM復合體中的受體亞基，包括TOM20、TOM22和TOM70識別前體蛋白上的線粒體定位信號，而后通過TOM40等亞基形成的共同轉運通道（general import pore，GIP）進入線粒體［1］。前體蛋白與不同的受體TOM蛋白結合，通過兩類主要的轉運機制進入線粒體［2］：（1）位于N端的線粒體定位序列（MTS）與TOM20、TOM22結合，是大多數線粒體定位基因的轉運途徑；（2）位于蛋白內部的信號肽與TOM70結合，主要是一類載體蛋白的轉運途徑［3］。本文從APE1/Ref－1的線粒體定位序列入手，闡明線粒體外膜TOM復合體識別 MTS的機制，并進一步探討APE1/Ref－1的線粒體轉位和干擾其線粒體定位的機制。

1 APE1/Ref－1在線粒體氧化應激反應中的作用

1.1APE1/Ref－1與氧化應激損傷 APE1/Ref－1是 DNA 堿基切除修復（BER）關鍵的限速酶，同時作為主要的AP核酸內切酶具有修復 AP位點和氧化還原雙重功能［4］；另一方面APE1具有獨特的氧化還原活性，通過控制DNA氧化還原狀態的結合域調控某些轉錄因子的DNA親和力［5］。DNA受活性氧（reactive oxygen species，ROS）攻擊后形成 AP位點，從而導致DNA復制障礙或發生遺傳變異。APE1/Ref－1作為核酸內切酶參與修復ROS引起的DNA損傷，在ROS誘導的疾病治療中起關鍵作用。在認識到ROS在信號轉導中起著核心作用之前，氧化應激被認為是促氧化劑和抗氧化劑之間的失衡，現在氧化應激被更多地認為是氧化還原信號轉導和控制之間的紊亂［6］。ROS是生物體進行有氧呼吸時產生的副產品，外源性環境致癌物和電離輻射等因素也能誘導ROS的產生。ROS包括O2－、OH－、H2O2、ONOO－等，它們通常導致膜磷脂、膜蛋白、DNA堿基等的氧化性損傷和AP位點的形成，與心臟衰竭、腦局部缺血損傷、神經變形性疾病和衰老等病變過程密切相關［7］。生物體在受到外源性環境致癌物和電離輻射等刺激后，誘導產生大量ROS。ROS廣泛攻擊膜磷脂、膜蛋白、胞漿蛋白和 DNA，導致細胞的氧化性應激損傷［8］。APE/Ref－1能調控轉錄因子AP－1的氧化還原活性，還原被氧化的AP－1，恢復其DNA結合活性。有研究發現，ROS能夠激活在CHO細胞中轉染的APE1/Ref－1啟動子，而且通過定點突變發現，使CREB結合位點失活能夠使H2O2對于APE1/Ref－1啟動子的激活失效。不僅如此，APE1/Ref－1的表達水平可以作為細胞氧化應激狀態的標志分子，因此了解ROS誘導的細胞調控機制中信號通路的組成十分重要。

1.2APE1/Ref－1與線粒體氧化應激反應 APE1/Ref－1是一種在哺乳動物中高度保守的蛋白。在漫長的進化過程中，APE1和Ref－1這2個具有截然不同功能的亞基逐漸聚集到一起，形成一個密不可分的功能復合體，在細胞核內DNA損傷和氧化還原雙功能都參與氧化應激后基因轉錄的調控，因此APE1/Ref－1可能不僅具有線粒體DNA修復活性，而且很可能具有氧化還原功能［9］。APE1在線粒體氧化應激反應中的重要作用得到廣泛關注，以往研究表明，APE1蛋白水平在線粒體中表達量少，也就是說，常規的免疫技術很難定位檢測它的表達水平［10］。目前研究發現，APE1可以在氧化應激等情況下轉位至線粒體，而其理化性質決定APE1不能通過被動轉運進入線粒體，說明該轉位過程必定涉及主動轉運途徑。當線粒體受到不同的氧化應激物刺激時，如過氧化氫環境下，APE1在線粒體中的表達水平將明顯增高，并與刺激物劑量相關且具有時間依賴性［11］。因此APE1的線粒體靶向定位應該是有先決條件的。有研究表明，抑制APE1的氧化還原功能將阻止鼠內皮細胞生長及血管發生，同時對人腫瘤細胞的血管發生及生長也有抑制作用［12］。APE1的生物學重要性在于APE1基因敲除的小鼠表現出胚胎致命性［13］。由于APE1的生物學活性都是與DNA損傷修復相關，目前研究發現，APE1蛋白主要定位于細胞核，但在氧化應激等刺激下可轉位至線粒體基質，但其機制仍不明了，因此研究APE1/Ref－1分子與線粒體的氧化應激反應的調節機制顯得十分重要。

2 APE1/Ref－1的線粒體轉運機制

2.1線粒體蛋白的轉運機制 mtDNA為環狀雙鏈DNA分子，雖然線粒體也能合成蛋白，但是合成能力有限。在線粒體1 000多種蛋白中，自身合成的僅10余種，編碼37個基因產物，其中13種蛋白，包括1個細胞色素B基因，2個ATP酶復合體組成成分基因，3個細胞色素C氧化酶亞單位的基因及7個呼吸鏈NADH脫氫酶亞單位的基因；2個rRNA基因；還有22個tRNA基因［14］。絕大多數的線粒體蛋白是核基因所編碼的并易位到線粒體。近年來蛋白跨膜運送研究有很大的進展，主要在于：（1）無論外、內膜都發現不少組成運送機器的膜蛋白［15］，其中個別蛋白已分離、純化和重組于脂質體，并表現其功能［16］；（2）在跨膜運送前后有不止一種的“分子伴侶”參與，對運送過程起著重要的作用。分子伴侶在信號轉導中也有重要作用。當細胞未受到激素刺激時，受體同分子伴侶結合在一起，核定位信號（nuclear localization signal，NLS）和 DNA 結合位都被隱蔽起來。當細胞受到信號分子的作用，脂溶性的激素進入細胞質，同相應受體上的激素結合位點結合，使受體同分子伴侶脫離，露出核定位信號和DNA結合位點。然后核定位蛋白通過核孔（nuclear pore）進入細胞核（nuclear）DNA結合位點，同染色體上的DNA結合，啟動基因表達［17］。

2.2線粒體定位蛋白的運送途徑 線粒體具有4個功能區隔，即外膜、內膜、膜間隙、基質，進入不同部位的蛋白具有不同的轉運途徑。進入外膜的蛋白具有不被切除的N端信號序列，其后還有疏水性序列作為停止轉移序列，然后蛋白被TOM復合體安裝到外膜上，如線粒體的各類孔蛋白。進入基質的蛋白可以先通過TOM復合體進入膜間隙，然后通過TIM復合體進入基質，也可以通過線粒體內、外膜間的接觸點進入基質，在接觸點上TOM與TIM協同作用完成蛋白向基質的輸入，最后內膜的基質面上由ATP耦聯的線粒體熱休克蛋白70（mtHsp70）可以促進線粒體蛋白向基質轉運的完成［18］。值得注意的是，在轉運過程中線粒體蛋白都是以前體蛋白的形式存在，大多數是線性形式，經過轉運復合體后進入線粒體的前體蛋白由線粒體的基質作用蛋白酶（matrix processing peptidase，MPP）切除前導序列，并在諸如熱休克蛋白60（Hsp60）之類的分子伴侶的輔助下重新折疊成為活性蛋白。

線粒體蛋白的轉運涉及多種蛋白復合體，由受體和蛋白通過的孔道兩部分構成。主要包括：（1）TOM復合體，負責通過外膜，進入膜間隙，在酵母中TOM70負責轉運內部具有信號序列的蛋白，TOM20負責轉運N端具有信號序列的蛋白。TOM復合體的通道被稱為GIP，主要由TOM40構成，還包括TOM22、TOM7、TOM6 和 TOM5。（2）TIM 復合體，其中TIM23負責將蛋白轉運到基質，也可將某些蛋白安插在內膜；TIM22負責將線粒體的代謝物運輸蛋白，如ADP/ATP和磷酸的轉運蛋白插入內膜。（3）OXA復合體，負責將線粒體自身合成的蛋白插到內膜上，同樣也可使經由TOM/TIM復合體進入基質的蛋白插入內膜。

2.3APE1/Ref－1的線粒體轉運機制 據文獻報道，不同長度的截短型APE1真核表達載體，并轉染至HeLa細胞中以激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞內定位［19］。由于綠色熒光蛋白的激發發光需要其正確折疊形成的構象，因此在這一折疊過程中很可能影響了APE1殘余序列的正確折疊，導致無法與線粒體外膜受體TOM蛋白相互識別而影響特異性的轉位［20］。線粒體前體蛋白與不同的受體TOM蛋白結合，通過兩類主要的轉運機制進入線粒體［21］：（1）位于N端的線粒體定位序列（MTS）與TOM20、TOM22結合，是大多數線粒體定位基因的轉運途徑；（2）位于蛋白內部的信號肽與TOM70結合，主要是一類載體蛋白的轉運途徑［22］。核編碼的線粒體定位前體蛋白均由線粒體表面受體識別，隨后通過GIP將線粒體定位蛋白轉位到外膜上（TOM）［23］。TOM 復合體主要由 TOM20、TOM22和TOM70等3個亞基構成，主要負責轉運內部具有信號序列的蛋白，通過外膜，進入膜間隙。在體外純化這3種受體蛋白的胞質便可確定特異的線粒體前體蛋白。線粒體輸入蛋白研究表明，TOM20和TOM22是異二聚體受體，功能是轉運攜帶裂解N－末端線粒體定位序列（MTS）的典型的線粒體前體蛋白。據文獻報道，TOM70是負責將線粒體非裂解前體蛋白向內膜轉運所必須的特異受體蛋白［24］。因此進一步研究APE1線粒體定位序列（MTS）與線粒體外膜上TOM蛋白受體結合的作用區域至關重要。

3 APE1/Ref－1的MTS線粒體定位機制

3.1APE1/Ref－1的MTS特征線粒體定位蛋白APE1/Ref－1與線粒體特異的靶蛋白不同，它被認為是一個雙定位的線粒體蛋白，主要定位于胞核，可以在氧化應激等情況下轉位至線粒體，且主要分布在線粒體細胞核內。然而APE1的線粒體定位機制尚不明確。APE1相對分子質量偏大，無法通過被動擴散的方式進入線粒體，此外由于其線粒體移位發生于線粒體膜電位改變之前，不可能通過線粒體外膜通透性增加來滲入線粒體，因此普遍認為APE1的線粒體轉位是通過主動轉運的方式進入的。目前的生物信息學研究發現，APE1蛋白并無典型的N端MTS，而其同源蛋白APE2卻具有明確的MTS［25］，故早期研究認為，線粒體中的 APE活性主要是由APE2產生的，但是經后期研究發現，APE2與APE1同源性較低，且APE活性極弱，直至研究人員通過蛋白組學的方法在線粒體提取物中發現APE1蛋白才確證APE1是存在于線粒體中的主要AP核酸內切酶。對APE1/Ref－1N－末端序列仔細分析發現，并不存在典型的MTS，卻具有典型的細胞核定位信號（NLS），有研究表明，APE1線粒體定位的前提條件即去掉N端的NLS，證明其線粒體定位信號肽可能存在于除N端之外的其余序列之中。Qu等［26］認為線粒體定位信號可能存在于靠近C端的某個區域內，但是并未具體說明其范圍和序列特征。Dinur－Mills等［27］發現，雙定位的線粒體蛋白有較弱的MTS，且蛋白整體凈電荷較低。APE1/Ref－1蛋白含有一個非常規的定位信號，利用傳統生物信息學的方法極有可能逃脫預測。

3.2APE1/Ref－1的MTS與TOM蛋白結合特性 線粒體外膜轉運復合體TOM介導的轉運嚴格依靠在胞漿核糖體中合成的前體蛋白中所攜帶的一段氨基酸序列，這種線粒體定位蛋白的前導序列被稱為MTS，通過線粒體定位信號肽與線粒體外膜上受體的結合使前體蛋白定位于線粒體的表面，并穿過線粒體的雙層膜結構，最終到達線粒體基質。以往利用一些計算機預測軟件對線粒體亞細胞定位進行搜索預測，包括常用的預測軟件MitoProt和TargetP均顯示，APE1的MTS預測分數很低。有報道稱，APE1主要被TOM20識別，表明APE1的線粒體易位可能通過TOM20依賴途徑介導。TOM20識別一種位于N－末端裂解的線粒體前體蛋白信號序列MTS，此序列信號是具有兩親性螺旋的疏水氨基酸殘基［28］。有學者認為，APE1的MTS是位于C－末端的尾錨定性前體蛋白。線粒體尾錨定性前體蛋白，包括Bcl－2和TOM20，它們經C－末端跨膜區插入到線粒體外膜［29］。雖然APE1在線粒體中尚無確切的定位特征性，但根據APE1的修復功能，它應該是伴隨線粒體DNA分布在線粒體基質中。

通過多肽陣列掃描比較預測MTS與TOM蛋白親和力的研究發現，結合有強大約束力的TOM蛋白的多肽遍布在整個蛋白中，很難確定APE1真實的MTS，結果只突出了一些可能的截短型APE1信號序列。TOM的3個受體蛋白對特定的線粒體靶蛋白表現出不同的親和力。然而當與純化的多肽相互作用時這些TOM受體蛋白表現出重疊的親和力［30］。最值得注意的是，位于APE1的N－末端的位點K299、R301和K303只要發生丙氨酸置換突變便會減少肽與TOM20的親和力［19］。更有趣的是，K24、K25、K27和 K31殘基替換可增強TOM20親和力。由于它們位于APE1的N－末端，這些特定的賴氨酸殘基可能會抑制APE1的線粒體分布［19］。通過觀察截短型APE1的亞細胞分布檢測這些可能的定向序列，發現當N－末端的長序列包含在截短型APE1蛋白中，線粒體靶向作用非特異性。如果除掉大部分N－末端序列后，截短型APE1蛋白便具有線粒體特異的靶作用。雖然在C－末端它們均包含MTS，但似乎被隱藏在APE1蛋白的核心中，因此很難在線粒體表面接觸到TOM蛋白，由此可以推斷，APE1/Ref－1會靶向氧化應激后的線粒體，其中一個最可能的機制是細胞氧化還原失衡改變了APE1蛋白完整的N－末端構象，這種改變使氧化還原功能得以發揮并暴露出MTS與線粒體外膜上TOM蛋白接觸區域。綜上所述，通過分析亞線粒體組分研究APE1的線粒體定位，將有助于闡明其線粒體定位機制，為氧化應激后通過干擾APE1線粒體轉位以促進細胞凋亡為目的提供新的靶向治療策略。

4 小 結

APE/Ref－1是典型的雙定位的復雜的生物大分子，在多種氧化應激刺激下它可以易位到線粒體發揮效應。隨著生物芯片技術的發展，硅片法芯片技術為APE1的N－末端NLS的鑒定提供了新的契機。盡管目前的生物信息學方法尚無法確定APE1的MTS，但相信聯合蛋白組學和實驗室檢測方法研究TOM蛋白和APE1/Ref－1的 MTS間的相互作用，可以為更好地理解APE1/Ref－1這個多功能生物大分子提供新的思路，有助于為進一步以APE1/Ref－1線粒體定位序列為靶點的基因治療奠定良好的基礎。

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