組織因子途徑抑制物2與肝臟疾病研究進展

姜 燕，周 靜 綜述，姜 政審校

（重慶醫科大學附屬第一醫院消化內科 400016）

據統計我國HBsAg陽性者約為1.2億，其中慢性乙型肝炎患者約為3 000萬，慢性乙型肝炎演變為肝硬化約300萬，在此基礎上合并原發性肝癌30多萬，全世界每年約有100萬人死于肝癌，而我國約占其中的1/3還多。組織因子途徑抑制物2（tissue factor pathway inhibitor－2，TFPI－2）是一種新近發現的絲氨酸蛋白酶抑制物，可抑制包括纖溶酶、胰蛋白和基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）在內的多種蛋白酶。越來越多的研究表明，TFPI－2可通過降解MMPs，抑制MMPs的活性，促進肝臟細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）過度沉積，導致合成的ECM不僅有量的變化，而且有質的改變，一方面可抑制腫瘤轉移、降低腫瘤的侵襲轉移能力，與此同時這種ECM質和量的改變加速激活靜息狀態的肝星形細胞（hepatic stellate cell，HSC），而 HSC持續激活，又大量合成ECM，進一步加重ECM的沉積，從而形成惡性循環，導致肝纖維化和肝硬化的發生。因此本文就TFPI－2結構、功能與肝臟疾病的關系作一綜述，為肝臟疾病的生物學治療奠定基礎。

1 TFPI－2結構與分布

TFPI－2是1997年由Jandial和Horne首次在雙胞胎妊娠者體內發現的一種蛋白，并將其命名為胎盤蛋白－5（placental protien，PP－5）。后來研究發現，PP－5和人的TFPI的氨基酸序列有很高的同源性，且兩者的性質也有一定的相似性，因此最終命名為TFPI－2。TFPI－2基因位于人類染色體7q22，全長約7.0kb，含有5個外顯子和4個內含子，可編碼mRNA含有3個外顯子和4個內含子，其翻譯213個氨基酸殘基，為廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，相對分子質量為32 000［1］。成熟的TFPI－2由5個部分組成，即富含酸性氨基酸的N端、3個首尾相連的Kunitz結構域（kunitz domain）和富含堿性氨基酸的C端，每個結構域都有3對二硫鍵。其中第1個結構域（KD1）表現出與TFPI－1 45%同源性以及與堿性胰蛋白酶抑制劑40%同源性，第3個結構域（KD3）與TFPI－1的相似性為53%，而第2個結構域（KD2）為35%。成熟的蛋白70%～72%為Asp－Ala－Ala－Glu－Glu－Pro－Thr－Gly－Asn－Asn結 構，約 30% 為 Ala－Glu－Glu－Pro－Thr－Gly－Asn－Asn結 構。TFPI－2 是 通 過 Kunitz結構域對蛋白水解酶進行抑制，主要是通過KD1和P1殘基與蛋白水解酶的蛋白袋結構（主要是精氨酸和賴氨酸殘端）的結合來抑制其活性。TFPI－2/KD1的三維結構是典型的Kunitz蛋白酶抑制劑折疊結構，即從Arg20到Phe33的雙帶反平行β－sheet以及從Trp48到Ala54的α－螺旋，其核心區域由3對二硫鍵和一定的二級結構組成，并呈高度的保守性。另外從Leu19到Tyr33的結合環與纖維蛋白酶的活性位點有直接關聯，特別是與纖維蛋白酶活性位點的殘基（P′1、P′2、P1和P3）都存在氫鍵，其中最重要的是P1殘基（Arg15）［2］。與 TFPI－2/胰島素復合物相比，TFPI－2/纖維蛋白酶復合物在接觸面上多出2個氫鍵，這使得兩者更加牢固。有研究發現，與ECM相關的絲氨酸蛋白酶抑制物是相對分子質量為33 000、27 000和31 000的蛋白，均是TFPI－2基因表達的不同糖基化產物，說明TFPI－2是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制物［3］。

TFPI－2廣泛分布于人類肝臟、胰腺、腎臟和胎盤組織等，由表皮細胞、內皮細胞和間質細胞，尤其是肝竇內皮細胞分泌產生［4］，以 TFPI－2和其糖基化的2種亞型形式存在［5］。在正常細胞中表達的 TFPI－2能夠抑制纖溶酶、MMP－1、MMP－2、MMP－3和MMP－9以及胰蛋白酶等，其在循環血液中含量極低，男性為0.190～0.750μg/L，女性為0.200～0.905μg/L，且水平不隨月經周期改變，而妊娠婦女TFPI－2水平可高達40～70倍。在血漿中大多數以脂蛋白結合形式存在，在組織中主要存在于細胞外基質，約占體內含量的75%～95%。有研究發現，TFPI－2與ECM中的肝素及硫酸皮膚素的結合對TFPI－2的定位起重要作用。

2 TFPI－2的生物學功能與調控

2.1TFPI－2的生物學功能

2.1.1凝血功能 大量研究表明，TFPI是組織因子（tissue factor，TF）誘導凝血過程的負性調節物之一，可直接抑制凝血因子Ⅹа，并與凝血因子Ⅹа結合反饋抑制凝血因子Ⅶа/組織因子復合物。在正常情況下，TF與凝血因子Ⅶ（或FⅦа）結合是血液凝固的觸發點，兩者形成復合物后能使凝血因子Ⅶ更迅速地被血液中痕量FⅩа激活，同時也使FⅦа的活性增強1 000倍。凝血因子Ⅶа/TF復合物將更多的FⅩ活化為FⅩа，而TFPI的KD2與FⅩа活性位點結合直接抑制FⅩа的活性，當血液中TFPI達到一定濃度時，還能識別位于凝血酶原復合物中的FⅩа，從而抑制凝血酶原酶，阻礙凝血酶原激活，減少凝血酶的生成，防止血栓的形成，正是這種TF與TFPI動態平衡的維持，防止了血液系統的疾?。?］。

2.1.2維持ECM 及基底膜（basement membrane，BM）的完整性 在正常情況下，TFPI－2能與 MMPs、ECM及BM結合，阻止MMPs與ECM結合，且進一步成為MMPs的粘合劑并降解MMPs，從而阻止MMPs對ECM和BM的破壞，保持ECM和BM的完整性，有利于阻止疾病的侵襲與擴散。同時TFPI－2可以增強金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloprotienase，TIMP）與 MMPs結合部位的結合和提高其降解MMPs的能力［7］。

2.1.3抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移 惡性腫瘤引起患者死亡的一個重要原因是腫瘤的侵襲和遠處轉移，而惡性腫瘤的轉移是多因素和多階段實施的復雜過程，涉及腫瘤細胞自身生長優勢的獲得、細胞間黏附能力的降低、腫瘤細胞對ECM和BM的降解和破壞、細胞骨架重構引起的細胞運動和遷移、細胞因子誘導腫瘤細胞特異定向歸巢以及腫瘤血管、淋巴管生成，細胞凋亡和免疫殺傷等諸多因素，由于ECM的特殊結構和組成成分，不僅是腫瘤侵襲、轉移的天然組織屏障，而且是腫瘤細胞與周圍環境相互作用的場所，因此ECM在腫瘤發生、發展的整個過程中都起著重要的作用，而MMPs作為ECM微環境的重要組成成分，不僅通過降解ECM促進腫瘤的轉移，而且通過酶解從細胞表面和ECM釋放的生物活性絲裂因子（FGF、IGFs和EGF），促進腫瘤侵襲和轉移。一方面絲裂因子調控腫瘤細胞的生長、增殖、新生血管的生成等，另一方面上調MMPs的表達與分泌，又進一步促進絲裂因子的釋放。因此降解MMPs，同時抑制MMPs的活性與功能可阻止和控制腫瘤的侵襲與遠處轉移。

據研究，TFPI－2作為一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能明顯抑制腫瘤中的MMPs活性和功能從而抑制腫瘤的侵襲、轉移能力，其抑制腫瘤的侵襲、轉移的可能機制如下：（1）抑制腫瘤新生血管的形成［8］。其主要機制包括下調血管內皮生長因子－C（VEGF－C）、VEGF－R1和IL－8的表達。在對神經膠質細胞瘤、纖維肉瘤和惡性腦膜瘤等研究中發現，TFPI－2通過抑制新生血管的形成抑制腫瘤細胞的生長，降低其與對周圍組織的侵襲及遠處轉移的能力；其次通過抑制纖溶物和金屬蛋白酶、增強其抑制物的活性等加速ECM的沉積以及重塑［7］。據研究，VEGF以時間、劑量依賴性增加內皮細胞TFPI－2的轉錄和表達，同時對 TNF－α、IL－1β和 FGF－2的刺激可明顯上調TFPI－2mRNA，相反 TFPI－2能明顯抑制由 VEGF和 FGF－2介導的內皮細胞增殖，從而減少新生血管的形成［9］。（2）誘導腫瘤細胞凋亡。近年來研究發現，TFPI－2在抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡中發揮重要作用，VEGF能夠上調TFPI－2的表達，進而降解絲氨酸的蛋白產物以結合細胞凋亡受體，引導細胞程序性死亡?，F已證實，凋亡蛋白（Bax）表達的增加和（或）抗凋亡蛋白Bcl－2表達的抑制均可導致線粒體膜滲透性的改變甚至破裂，繼而引起線粒體細胞色素C的釋放，而細胞色素C可進一步激活caspase－3并誘發凋亡的發生。TFPI－2可使Bax的表達水平增高，而X連鎖凋亡抑制蛋白、Bcl－2的表達水平降低，同時增強caspase－9、caspase－3、TNF－α、Bax、Fas相關的死亡結構域、TNFR－1有關的死亡結構域和Fas配體的活性，從而導致腫瘤細胞凋亡增加，發揮其抗腫瘤的效應［10－12］。（3）抑制MMPs。ECM由多種蛋白聚糖組成，在細胞黏附、遷移、生長和分化中起重要作用，其內環境的穩定依賴生長因子、蛋白水解酶及其抑制劑之間的動態平衡。各種腫瘤細胞分泌的蛋白水解酶，如MMPs所參與的ECM的降解是腫瘤發生侵襲和轉移的關鍵步驟。由于TFPI－2與金屬蛋白酶組織抑制劑有相似的結構，其氨基末端自由氨基上存在Zn2＋活化位點，可以通過多價螯合劑作用與MMPs及MMP前體結合，從而抑制各種絲氨酸蛋白酶及 MMPs，如 MMP－1、MMP－2、MMP－9和MMP－13等與ECM結合，降低對ECM的破壞作用，因此TFPI－2能夠抑制ECM的降解，在腫瘤的侵襲和轉移中發揮調節作用［13］。（4）抑制 TF/FⅦа復合物［8］。腫瘤細胞及腫瘤血管內皮細胞表面常有TF的異常表達，與FⅦа形成TF/FⅦа復合物是外源性凝血途徑的始動因子，與腫瘤的高凝狀態有關，能夠增加腫瘤的侵襲、轉移特性，其效應可以被TFPI－2所抑制，而TFPI－2作為組織因子途徑的重要生理抑制物則可能在抑制TF/FⅦа復合物介導的信號傳導途徑中發揮作用，抑制腫瘤的侵襲與轉移［6］。

2.2TFPI－2基因表達的調控 TFPI－2基因位于人類染色體7q22，全長約7.0kb，含有5個外顯子和4個內含子，所有的外顯子和內含子周圍的核苷酸序列都比較保守，服從GT－AC原則，TFPI－2mRNA啟動子有典型的管家基因特征，在TFPI－2基因調節中起關鍵作用：（1）凝血酶上調TFPI－2基因的表達。該效應發揮依賴于G蛋白偶聯受體Ⅰ及環氧合酶－2，以通過促分裂原活化蛋白酶依賴途徑增加環氧合酶－2mRNA的表達，進而促進促分裂原活化蛋白酶/環氧合酶－2依賴的信號傳導途徑上調TFPI－2。凝血酶介導的TFPI－2上調表達能抑制MMP前體的活化，降低MMP對ECM的降解。（2）炎癥介質以及理化因素可調節 TFPI－2基因的表達。IL－1、TNF－α和INF－α、β、γ等炎癥介質、內毒素以及山梨醇和紫外線等理化因素通過增加cAMP激活蛋白激酶C途徑或通過激活蛋白激酶/c－Jun氨基酸激酶信號傳導途徑實現對TFPI－2基因表達的調節，TFPI－2啟動子區域的4個AP－1結合位點在該過程中起重要作用。（3）TFPI－2的凝酸胞苷酰（cytidylyl phosphate guanosine，CPG）可調節 TFPI－2基因的表達。TFPI－2基因存在1個典型的220bp的CPG島區域，跨越外顯子1和3個轉錄起始位點，其中G＋C含量大約77%，TFPI－2基因的沉默與CPG島甲基化有關，與KLF－6結合的啟動子DNA超甲基化可阻止TFPI－2的轉錄與表達［12］。多種腫瘤中TFPI－2的表達受到抑制都與CPG島甲基化有關，同時TFPI－2甲基化常常提示組織細胞的惡性演變［13－14］；同時發現 TFPI－2mRNA 的表達與TFPI－2甲基化呈負相關［20］；而5′乙酰唑胺和曲古抑菌素A能解除CPG島甲基化，兩者結合可發揮協同效應，增加TFPI－2的表達，抑制腫瘤的侵襲和轉移［15］。除此之外，細胞外信號調節激酶/促分裂原活化蛋白酶信號傳導途徑也參與對TFPI－2基因表達的調節［16］。

3 TFPI－2與肝臟疾病

3.1TFPI－2與肝硬化 目前認為肝纖維化是肝損害持續存在，組織發生修復反應時因ECM合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程，而TFPI－2過度表達在肝纖維化和肝硬化的發生與發展中起到了推波助瀾的作用。據研究，TFPI－2具有降解MMPs、抑制MMPs的活性、同時與TIMP一起共同促進ECM過度沉積的作用。合成和沉積的ECM不僅有量的變化，而且有質的改變，這種ECM質和量的改變又加速激活靜息狀態的HSC，而HSC持續激活后又將導致：（1）HSC數量增多，合成ECM能力增強，從而導致膠原合成增加［17］；（2）纖維凝聚加強和膠原降解減少，這主要緣于HSC MMPs及TIMP表達的改變，隨著纖維化的進展MMPs下降，伴隨TIMP的表達上調，TIMP/MMPs比值增加，導致膠原降解減少［18］；（3）ECM比例失調以及ECM質和量的改變，導致HSC分泌不溶性Ⅰ型膠原明顯增加，取代Ⅲ型膠原而成為肝內主要膠原，進一步引起ECM分子結構發生微異質性改變，形成惡性循環。因此TFPI－2過度表達在肝纖維化和肝硬化的發生與發展過程中起到了重要的病理生理作用。以TFPI－2作為靶點治療肝纖維化將成為肝纖維化基因治療的一個途徑。如果采用現代分子生物學技術阻斷TFPI－2的過度表達，從而切斷其降解MMPs、抑制MMPs活性的作用，加速ECM的降解，從而在一定程度上達到預防和治療肝纖維化的目的［19］。

3.2TFPI－2與肝癌 由于ECM是腫瘤侵襲、轉移的天然組織屏障，同時是腫瘤細胞與周圍環境相互作用的場所，因此ECM在阻止腫瘤侵襲與轉移的過程中起著重要的作用。由于腫瘤細胞大量分泌MMPs，不僅降解ECM促進腫瘤的轉移，而且通過酶解從細胞表面和ECM釋放的生物活性絲裂因子（FGF、IGFs和EGF），促進腫瘤細胞的生長、增殖以及新生血管的生成等，同時絲裂因子上調MMPs的表達與分泌，又進一步促進絲裂因子的釋放，形成惡性循環。因此降解MMPs、抑制MMPs的活性可阻止和控制腫瘤的侵襲與遠處轉移。據研究，導致腫瘤的侵襲與轉移常常是TFPI－2基因在腫瘤細胞中的突變、甲基化以及 TFPI－2不表達所致［20－21］。Rao等［22］分別測定了人類高度惡性、中度惡性以及低度惡性的神經膠質瘤中TFPI－2的表達，發現TFPI－2mRNA和蛋白質表達水平與腫瘤惡性程度呈負相關，而惡性程度最高的腫瘤細胞株體內轉移、侵襲能力最強，其TFPI－2幾乎無表達，同時將TFPI－2基因轉染到高度惡性的腫瘤細胞中，則發現明顯抑制腫瘤的侵襲與轉移能力。Jin等［23］將TFPI－2轉染到絨毛癌細胞株JAR研究TFPI－2與絨毛癌細胞轉移、侵襲能力的關系發現，惡性腫瘤不表達TFPI－2，其轉移、侵襲能力較強，而經轉染后表達TFPI－2，其侵襲力減弱，說明TFPI－2表達的下調與腫瘤侵襲、轉移能力呈正相關。據 Wong等［24］研究發現，在大約90%原發性肝癌中TFPI－2低表達或不表達，47%肝癌以及80%肝癌細胞系存在TFPI－2啟動子甲基化，從而導致TFPI－2轉錄和表達減少，而脫甲基作用的5′乙酰唑胺和組蛋白脫乙?；敢种苿乓志谹使TFPI－2去甲基化后能恢復TFPI－2的表達；同時發現異位過表達的TFPI－2能明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，提示TFPI－2是一種候選的抑癌基因［25］。因此采用現代分子生物學技術增加TFPI－2的表達，增強TFPI－2活性，有助于降解MMPs等多種蛋白水解酶，從而達到預防和治療肝癌的目的。

4 問題與展望

盡管20世紀在肝纖維化和肝癌研究領域已取得重大突破，然而目前可用于肝纖維化和肝癌基因治療的靶基因還相當有限，更多基因的功能還需要進一步認識和挖掘，而TFPI－2是一個組織因子途徑抑制物，在肝纖維化和肝癌的發生與發展中具有不同的病理、生理作用，同時在基礎與臨床應用研究過程中仍有許多問題亟待解決，如TFPI－2對各細胞因子和相應的傳導途徑的影響如何？在肝纖維化和肝癌形成過程中的作用孰輕孰重？同時針對肝纖維化和肝癌復雜的分子機制，如何進行多靶點協同調控以提高療效以及如何實現基因治療中的靶向性、調控性以及安全性？因此肝纖維化與肝癌的基因治療目前依然任重道遠。針對目前存在的問題，下一步研究重點將是TFPI－2在體內、外的表達調控和對細胞轉移機制作用探討以及在動物模型中進一步研究TFPI－2的作用，為臨床的開發與利用奠定基礎。

［1］Kamei S，Kazama Y，Kuijper JL，et al.Genomic structure and promoter activity of the human tissue factor pathway inhibitor－2gene［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1517（3）：430.

［2］Chand HS，Schmidt AE，Bajaj SP，et al.Structure－function analysis of the reactive site in the first Kunitz－type domain of human tissue factor pathway inhibitor－2［J］.J Biol Chem，2004，279（17）：17500.

［3］Chand HS，Foster DC，Kisiel W.Structure，function and biology of tissue factor pathway inhibitor－2［J］.Thromb Haemost，2005，94（6）：1122.

［4］Hisaka T，Lardeux B，Lamireau T，et al.Expression of tissue factor pathway inhibitor－2in murine and human liver regulation during inflammation［J］.Thromb Haemost，2004，91（3）：569.

［5］Choi MS，Parikh K，Saxena A，et al.Protective effects of recombinant kunitz－domain 1of human tissue factor pathway inhibitor－2against 2－chloroethyl ethyl sulfide toxicity in vitro［J］.Eplasty，2007，8：e3.

［6］Schmidt AE，Chand HS，Cascio D，et al.Crystal structure of Kunitz domain 1（KD1）of tissue factor pathway inhibitor－2in complex with trypsin.Implications for KD1specificity of inhibition［J］.J Biol Chem，2005，280（30）：27832.

［7］Ivanciu L，Gerard RD，Tang H，et al.Adenovirus－mediated expression of tissue factor pathway inhibitor－2inhibits endothelial cell migration and angiogenesis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（2）：310.

［8］Sierko E，Wojtukiewicz MZ，Kisiel W.The role of tissue factor pathway inhibitor－2in cancer biology［J］.Semin Thromb Hemost，2007，33（7）：653.

［9］Xu Z，Maiti D，Kisiel W，et al.Tissue factor pathway inhibitor－2is upregulated by vascular endothelial growth factor and suppresses growth factor－induced proliferation of endothelial cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（12）：2819.

［10］Kempaiah P，Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor－2induces caspase－mediated apoptosis in a human fibrosarcoma cell line［J］.Apoptosis，2008，13（5）：702.

［11］Rollin J，Régina S，Vourc′h P，et al.Influence of MMP－2 and MMP－9promoter polymorphisms on gene expression and clinical outcome of non－small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2007，56（2）：273.

［12］Guo H，Lin Y，Zhang H，et al.Tissue factor pathway inhibitor－2was repressed by CpG hypermethylation through inhibition of KLF6binding in highly invasive breast cancer cells［J］.BMC Mol Biol，2007，8：110.

［13］Ohtsubo K，Watanabe H，Okada G，et al.A case of pancreatic cancer with formation of a mass mimicking alcoholic or autoimmune pancreatitis in a young man.Possibility of diagnosis by hypermethylation of pure pancreatic juice［J］.JOP，2008，9（1）：37.

［14］Jiang P，Watanabe H，Okada G，et al.Diagnostic utility of aberrant methylation of tissue factor pathway inhibitor 2 in pure pancreatic juice for pancreatic carcinoma［J］.Cancer Sci，2006，97（11）：1267.

［15］Steiner FA，Hong JA，Fischette MR，et al.Sequential 5－Aza 2′－deoxycytidine/depsipeptide FK228treatment induces tissue factor pathway inhibitor 2（TFPI－2）expression in cancer cells［J］.Oncogene，2005，24（14）：2386.

［16］Kast C，Wang M，Whiteway M.The ERK/MAPK pathway regulates the activity of the human tissue factor pathway inhibitor－2promoter［J］.J Biol Chem，2003，278（9）：6787.

［17］Parsons CJ，Takashima M，Rippe RA.Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.Gastroenterol Hepatol，2007，22（Suppl 1）：S79.

［18］Wang CH，Lee TH，Lu CN，et al.Electroporative alpha－MSH gene transfer attenuates thioacetamide－induced murine hepatic fibrosis by MMP and TIMP modulation［J］.Gene Ther，2006，13（13）：1000.

［19］Liu X，Hu H，Yin JQ.Therapeutic strategies against TGF－beta signaling pathway in hepatic fibrosis［J］.Liver Int，2006，26（1）：8.

［20］Yanamandra N，Kondraganti S，Gondi CS，et al.Recombinant adeno－associated virus（rAAV）expressing TFPI－2 inhibits invasion，angiogenesis and tumor growth in a human glioblastoma cell line［J］.Int J Cancer，2005，115（6）：998.

［21］Rollin J，Iochmann S，Bléchet C，et al.Expression and methylation status of tissue factor pathway inhibitor－2 gene in non－small－cell lung cancer［J］.Br J Cancer，2005，92（4）：775.

［22］Rao CN，Lakka SS，Kin Y.Expression of tissue factor pathway inhibitor 2inversely correlates during the propression of human gliomas［J］.Clin Cancer Res，2001，7（3）：570.

［23］Jin M，Udagawa K，Miyagi E.Expression of serine proteiase inhibitor PP5/TFPI－2/MSPI decrease the invasive popential of human choriocarcinoma cells in vitro and in vivo［J］.Gynecol Oncol，2001，83（2）：325.

［24］Wong CM，Ng YL，Lee JM，et al.Tissue factor pathway inhibitor－2as a frequently silenced tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2007，45（5）：1129.

［25］Sato N，Parker AR，Fukushima N，et al.Epigenetic inactivation of TFPI－2as a common mechanism associated with growth and invasion of pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Oncogene，2005，24（5）：850.